B超彈性成像監(jiān)測下應用吉西他濱耐藥乳腺癌細胞4T1構(gòu)建裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型

葉志東黃 迪黃 宇張 強麥振豪趙 俐古維立

1 廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院 普通外科（廣州 510180）2 廣州消化疾病中心（廣州 510180）

B超彈性成像監(jiān)測下應用吉西他濱耐藥乳腺癌細胞4T1構(gòu)建裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型

葉志東1，2黃 迪1，2黃 宇1張 強1麥振豪1趙 俐1，2古維立1，2

1 廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院 普通外科（廣州 510180）2 廣州消化疾病中心（廣州 510180）

目的 構(gòu)建吉西他濱耐藥乳腺癌細胞4T1耐藥株并建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型。方法 采用低濃度加量持續(xù)誘導法，誘導吉西他濱耐藥乳腺癌細胞4T1耐藥株，命名為4T1/Gem；CCK-8法測定4T1與4T1/Gem細胞的增殖抑制率，計算耐藥指數(shù)；Western blot法檢測細胞P-gp蛋白表達；B超引導下注射4T1/Gem細胞懸液誘導裸鼠肝臟成瘤；HE染色觀察腫瘤組織病理情況，免疫組化法檢測瘤組織ER、PR、HER2、Ki-67和P-gp蛋白的表達。結(jié)果 經(jīng)過14個月的誘導成功建立4T1/Gem細胞株，可在含40μg/mL的Gem培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。4T1/Gem細胞耐藥指數(shù)為4T1細胞的788.547倍。與親代相比，4T1/Gem處于G1期和G2期的細胞增加，S期細胞減少；上調(diào)P-gp蛋白的表達。4T1/Gem細胞成功建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，瘤組織中ER、PR、HER2蛋白陰性表達，Ki-67陽性10%和P-gp蛋白陽性表達。結(jié)論 成功構(gòu)建吉西他濱耐藥乳腺癌細胞4T1耐藥株并建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，為開發(fā)治療乳腺癌肝轉(zhuǎn)移化療耐藥的藥物提供實驗基礎。

乳腺癌 吉西他濱 耐藥 P-gp蛋白 裸鼠成瘤

肝臟是晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌的重要靶器官。乳腺癌肝轉(zhuǎn)移預后極差，生存兩年以上的患者非常少。轉(zhuǎn)移性及復發(fā)性乳腺癌對化療的效果十分不理想［1］，化療耐藥問題一直是乳腺癌治療的瓶頸。目前，國內(nèi)外對乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型的研究不多，尤其是耐藥株引起的肝轉(zhuǎn)移模型。因此，為研究乳腺癌轉(zhuǎn)移合并耐藥機制，如何在裸鼠體內(nèi)建立耐藥的乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型是乳腺癌耐藥的研究難點［2］。因此，本文利用B超彈性成像監(jiān)測下應用吉西他濱耐藥乳腺癌細胞4T1耐藥株并建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，為開發(fā)治療乳腺癌肝轉(zhuǎn)移化療耐藥的藥物提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠乳腺癌4T1細胞購于中山大學動物實驗中心，BALB/c裸鼠購于廣東省動物實驗中心，吉西他濱（禮來制藥）；CCK-8試劑盒（上海東仁化學科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基干粉、胎牛血清（美國Sigma公司）FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；兔抗人P糖蛋白（P-gp）多克隆抗體（CST公司），周期試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱CCL-170A8（新加坡ESCO藝思高公司）；多功能酶標儀（香港基因有限公司）；IX51倒置相差顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 小鼠乳腺癌4T1細胞常規(guī)培養(yǎng)與DMEM培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%胎牛血清，1%雙抗液（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL），于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。細胞換液時間為2天，傳代時間為3～5天，傳代前用2.5 g/L的胰酶消化。

1.2.2 親代細胞的IC50值的測定 取對數(shù)期生長的親代細胞，胰酶消化后制成細胞懸液，按104個/孔接種于96孔板中，每孔加100μl，棄周圍一圈改加PBS 100μl保持濕度，每組做5個復孔。待細胞長至80%滿后，棄掉原培養(yǎng)基，以1×PBS輕輕沖洗一遍，加入不同濃度吉西他濱（0.01、0.1、1、10mg/mL）處理，同時設立空白對照組（加培養(yǎng)基100μl）作為調(diào)零用途，24 h后加入CCK-8試劑，與培養(yǎng)基按1∶10的比例加入，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，多功能酶標儀檢測波長為450 nm處的吸光度OD值。細胞抑制率計算方法:抑制率=1-（加藥組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。計算親代細胞 IC50=0.0126mg/mL。

1.2.3 耐藥株的建立 取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，待細胞貼壁長至70%滿時，加入終質(zhì)量濃度為0.001mg/mL（約1/13 IC50）的藥物培養(yǎng)液連續(xù)作用48 h，棄去上清液；加入不含藥物的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞恢復正常生長后，消化傳代，再用含終質(zhì)量濃度為0.002mg/mL的藥物培養(yǎng)液連續(xù)作用細胞48 h。如此反復換液、傳代，逐步提高藥物的質(zhì)量濃度（mg/mL）（0.001→0.002→0.005→0.01→0.02→0.04），使細胞在含0.04mg/mL藥物培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長，最終獲得耐藥細胞4T1/Gem。

1.2.4 耐藥細胞IC50的測定 取對數(shù)期生長的耐藥細胞，按照第二步方法測定耐藥細胞的IC50值，SPSS計算耐藥細胞4T1/Gem的IC50=9.9357mg/mL。

1.2.5 Western-blot檢測P-gp、ABCG2蛋白表達 分別收集親代和耐藥細胞，提取蛋白質(zhì)后，進行SDS-PAGE電泳（分離膠10%，濃縮膠5%），每孔加入50μg蛋白質(zhì)，恒壓100 V電泳至分離膠底部，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBST洗滌3次后，加入1∶1000稀釋的P-gp抗體，4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次10min。再加入1∶2000稀釋的羊抗兔IgG HRP，振搖1 h，PBST洗滌3次，ECL試劑顯色、曝光并拍照，掃描后用IPP6.0圖像分析軟件進行光密度積分值（Integral of optical density）分析。

1.2.6 B超引導下裸鼠成瘤 收集耐藥細胞4T1/Gem，用無菌PBS調(diào)整細胞濃度為5×107/mL，制成細胞懸液，取0.1mL細胞懸液在B超引導下于裸鼠肝臟體外注射，共3只。維持適宜溫度和12 h晝夜交替節(jié)律，保證裸鼠可隨時進食無菌飼料及飲用水。3周后，待B超鑒定腫瘤生長位于肝臟后，常規(guī)處死，完整剪下肝臟組織，70%酒精洗凈組織后予以拍照，取同一部位肝臟約5 mm×5 mm×5 mm，以10%多聚甲醛固定石蠟切片，用于病理染色及免疫組化測定。實驗過程符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》、《廣州市第一人民醫(yī)院中心實驗室動物管理條例》及倫理要求。

1.2.7 腫瘤組織特性鑒定 常規(guī)HE染色后于顯微鏡下觀察，拍照保存。SAB免疫組化法檢測腫瘤組織中ER、PR、HER2、Ki-67及P-gp蛋白的表達，倒置相差顯微鏡下觀察，拍照保存。

1.3 統(tǒng)計學處理 全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件處理。各組實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用秩和t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功誘導4T1/Gem細胞株 經(jīng)過14個月的誘導成功建立4T1/Gem細胞株（圖1A，B），其可在含40μg/mL的Gem培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。經(jīng)CCK-8試驗檢測不同濃度吉西他濱對細胞增值抑制情況（圖1C），4T1與4T1/Gem細胞24h時的IC50分別為0.0126mg/mL、9.9357mg/mL，耐藥細胞的耐藥指數(shù)（RI）為親代細胞的788.547倍。

2.2 P-gp蛋白的表達 Western blot結(jié)果顯示親代4T1細胞可以少量表達P-gp蛋白，4T1/Gem細胞P-gp蛋白表達明顯增加，為親代細胞的1.7倍（圖2 A，B）。

2.3 裸鼠成瘤實驗3只BALB/c裸鼠，3周后全部經(jīng)B超檢查確認，全部裸鼠肝臟中長出腫瘤（圖3A），B超下測量直徑為（0.75±0.06）cm。腫瘤大體形態(tài)外觀可見肝臟上有一個轉(zhuǎn)移瘤，大小約0.8cm×0.8cm。（見圖3B）

2.4 腫瘤組織特性鑒定 腫瘤組織HE染色結(jié)果見圖4A。免疫組化檢測結(jié)果顯示ER（4B）、PR（4C）、HER-2（4D）表達陰性，Ki-67陽性10%（4E），P-gp（4F）蛋白的表達陽性，可在包膜或胞質(zhì)中間見到成棕黃色的陽性區(qū)域。

3 討 論

乳腺癌是當今危害婦女生命健康的最常見的惡性腫瘤之一。隨著新的化療藥物的涌現(xiàn)及規(guī)范化的治療，早期乳腺癌患者的預后已經(jīng)有了顯著改善，無病生存期和總生存期已有了顯著提高，70%以上患者可以獲得長期生存，但仍有30%的患者死于復發(fā)和轉(zhuǎn)移，平均生存期僅為18～30個月［3-4］。目前對晚期乳腺癌患者的治療收效甚微，臨床上極大多數(shù)晚期乳腺癌患者是經(jīng)過一線化療藥物治療的病例，后續(xù)的化療耐藥性明顯，且晚期復發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移的患者，轉(zhuǎn)移部位以內(nèi)臟或混合為主，化療后容易出現(xiàn)骨髓抑制［4］，因此，患者更愿意接受有效低毒適合長期治療的方案。轉(zhuǎn)移性及復發(fā)性乳腺癌對化療的效果十分不理想，耐藥問題一直是根治乳腺癌的瓶頸。

圖1 成功誘導4T1/Gem細胞株。A:親代4T1細胞，B:4T1/Gem細胞（AB均為HE染色20×）C:親代細胞和耐藥細胞增值抑制率，IC50（4T1）=0.0126mg/mL、IC50（4T1/Gem）=9.9357mg/mL，RI=788.547

圖2 4T1細胞和4T1/Gem細胞DR1基因和P-gp蛋白的表達。

圖3 裸鼠成瘤B超檢查。A示肝臟腫瘤形成，大小為0.86cm×0.73cm；B為腫瘤大體形態(tài)。

圖4 腫瘤組織特性鑒定.A為HE染色結(jié)果；B-F分別為ER、PR、HER2、Ki-67和P-gp蛋白免疫組化結(jié)果，其中ER、PR、HER2表達呈陰性，Ki-67的表達陽性10%，P-gp蛋白的表達陽性（箭頭所示）。

腫瘤細胞對多種化學藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，稱多藥耐藥（Multidrug Resistance，MDR），是造成腫瘤化學藥物化療失敗的主要原因。耐藥腫瘤細胞株的建立是研究MDR發(fā)生機制和逆轉(zhuǎn)策略的重要手段。目前國內(nèi)外學者們用藥物遞增誘導法建立了不少耐藥腫瘤細胞株［5-7］，以深入研究腫瘤耐藥的機制。吉西他濱是一種核苷類似物，對乳腺癌具有廣譜的抗腫瘤活性。對遠處轉(zhuǎn)移的晚期乳腺癌患者，吉西他濱在臨床上常與其他化療藥物相聯(lián)用，如與紫杉醇（GT方案）或順鉑（GP方案）聯(lián)用作為晚期一線用藥并顯示出很好的臨床療效［5-7］。但經(jīng)吉西他濱治療后仍有一大部分患者出現(xiàn)化療耐藥，導致治療失敗。在乳腺癌中吉西他濱耐藥的機制報道不多，具體機制仍待進一步闡明。我們通過建立穩(wěn)定的乳腺癌細胞4T1吉西他濱耐藥株并建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，是開發(fā)逆轉(zhuǎn)乳腺癌肝轉(zhuǎn)移化療耐藥的藥物提供實驗基礎。

我們采用低濃度加量持續(xù)誘導法即:使腫瘤細胞在低于其致死濃度的藥物中持續(xù)培養(yǎng)，然后逐漸增加藥物濃度，直至腫瘤細胞獲得穩(wěn)定的耐藥性，成功建立了乳腺癌4T1吉西他濱耐藥株（4T1/Gem）。經(jīng)過14個月的誘導，其可在含40 ug/mL的Gem培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長，耐藥細胞的耐藥指數(shù)（RI）為親代細胞的1088.3倍。經(jīng)過western blot法測定其表達耐藥蛋白P-gp發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞中表達上調(diào)，說明產(chǎn)生了一定的耐藥性。我們通過B超彈性成像監(jiān)測下應用吉西他濱耐藥乳腺癌細胞4T1構(gòu)建裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型。B超顯示小鼠肝臟中腫瘤形成，大小為0.7cm× 0.69cm（圖3），經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織ER、PR、HER-2表達成陰性，Ki-67的表達陽性10%，P-gp蛋白的表達成陽性（圖4），結(jié)果說明獲得的腫瘤組織具有三陰性乳腺癌的特性，并且具有一定的侵襲性和耐藥性。

我們成功構(gòu)建吉西他濱耐藥乳腺癌細胞4T1耐藥株并建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，為開發(fā)治療乳腺癌肝轉(zhuǎn)移化療耐藥的藥物提供實驗基礎。下一步，我們將進行乳腺癌耐藥株逆轉(zhuǎn)藥物的篩選，以期開發(fā)針對乳腺癌化療耐藥的靶向藥物。

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Application of a gemcitabine-resistant variant of breast cancer cell line（4T1/Gem）to construct nude mouse models of breast cancer with hepatic metastasis under ultrasonic elastography

Objective To construct a gemcitabine-resistant variant of the breast cancer cell line（4T1/Gem）and establish a nude mouse model of breast cancer with hepatic metastatic. Methods A gemcitabine-resistant variant of the breast cancer 4T1 cell line was induced by gradually increasing the concentration of gemcitabine；this variant is referred to in this study as 4T1/Gem.The proliferation suppression rates of 4T1 and 4T1/Gem cells were determined by using the CCK-8 essay to evaluate the drug resistance indices of the cell lines.Western blot analysis was used to detect P-gp protein expression.Under ultrasonography，a 4T1/Gem cell suspension was injected into nude mice to induce liver tumors.H＆E staining was used to observe tumor pathology，and immunohistochemistry was used to detect the expression of ER，PR，HER-2，Ki-67，and P-gp. Results After 14 months of induction，a 4T1/Gem cell line is established successfully.The cell line can grow stably in culture liquid containing 40μg/ml gemcitabine.The drug resistance index of 4T1/Gem is 788.547.Compared with the 4T1 cell line，the 4T1/Gem cell line can upregulate P-gp protein expression and successfully establish a nude mouse model of breast cancer with hepatic metastatic.ER，PR，and HER-2 proteins exhibit negative expression in the tumor tissue.The positive expression of P-gp and 10%of Ki-67 proteins is also observed. Conclusion This study successfully constructs a gemcitabine-resistant variant of the breast cancer cell line（4T1/Gem）and establishes a nude mouse model of breast cancer with hepatic metastatic，thereby providing an experimental basis for developing and treating a drug-resistant variant of breast cancer.

Breast cancer；Gemcitabine；Drug-resistant；P-gp protein；Forming tumor in nude mice

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.01.017

2015-10-15）

廣東省科技計劃項目（2011B061300024，2013B021800057）；廣東省自然基金項目（10151006001000013）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導項目（20131A011029，20141A01003）；廣州市科技和信息化局科普專項項目（2014KP000086）

黃迪，E-mail：penguinzone＠163.com