正交試驗(yàn)法優(yōu)選肝炎康膠囊的醇提制備工藝

韋亞潔，王娟弟，3，秦 龍，李 平，2，李玉民，2，張嶺漪，代東良，2

（1．蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030； 2．甘肅省消化系腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3．蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

正交試驗(yàn)法優(yōu)選肝炎康膠囊的醇提制備工藝

韋亞潔1，王娟弟1，3，秦 龍1，李 平1，2，李玉民1，2，張嶺漪1，代東良1，2

（1．蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030； 2．甘肅省消化系腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3．蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

目的 優(yōu)選肝炎康膠囊的醇提制備工藝。方法 以浸膏率和大黃素含量作為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn) L9（34）法，優(yōu)選肝炎康膠囊的最佳醇提制備工藝。結(jié)果 影響醇提制備工藝的因素為乙醇濃度（因素A）＞加醇倍量（因素D）＞提取次數(shù)（因素C）＞提取時(shí)間（因素B）。最佳制備工藝條件為A3B2C2D2，即處方藥材加15倍量的80%乙醇，提取2次，每次1．5 h。結(jié)論 該醇提制備工藝條件合理可行，有效成分提取較完全，可優(yōu)先用于該制劑的實(shí)際配制。

肝炎康膠囊；正交試驗(yàn)；醇提工藝；大黃素

目前，肝炎的治療方法主要有藥物療法、基因療法和疫苗治療等，但大多數(shù)僅治標(biāo)，未從根本上消除肝炎的病因。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有完整的辨證施治理論和臨床治療經(jīng)驗(yàn)，強(qiáng)調(diào)機(jī)體的整體性和中藥治療的復(fù)方功效，在各種疾病的治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本研究中肝炎康膠囊以黃芪、白花蛇舌草、半枝蓮等藥材為主要成分，根據(jù)肝炎疾病的生理病理特點(diǎn)研制，有益氣固本、活血化瘀、利濕解毒功效，臨床療效明顯。為了更好地發(fā)揮其高效低毒的優(yōu)勢(shì)，保證其臨床療效的連續(xù)性和穩(wěn)定性，為肝炎康膠囊的制備工藝提供可靠的試驗(yàn)依據(jù)，本研究中以大黃素含量和浸膏率作為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn) L9(34)法，對(duì)該膠囊醇提制備工藝部分進(jìn)行了最佳條件的優(yōu)選，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀，包括 G1314BVWD檢測(cè)器、G1311A四元泵；G1316A柱溫箱、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)安捷倫公司）；Zorbax Eclipse XDBC18色譜柱（美國(guó)安捷倫公司，250mm×4．6mm，5μm）；吉尼斯系列ME215S型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯儀器有限公司）；202A－00型恒溫干燥箱（上海新正機(jī)械儀器制造有限公司）；RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ－500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

方中中藥材由甘肅隴脈藥材有限公司提供，均符合2010年版《中國(guó)藥典（一部）》及相關(guān)地方標(biāo)準(zhǔn)；大黃素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)為110756－200110，含量測(cè)定用）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 大黃素含量測(cè)定[1－4]

2．1．1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB－C18柱 （250 mm× 4．6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－0．1%磷酸（85∶15）；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；柱溫：30℃；流速：1．000m L／min；進(jìn)樣量：5μL。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算不低于3 000。

2．2．2 溶液制備

取醇提取物供試品0．2 g，精密稱定，置10m L容量瓶中加甲醇溶解，超聲處理10min，再吸取1mL置5mL容量瓶中并定容至刻度，搖勻，用0．22μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。按處方比例依法配制缺虎杖的醇提取物陰性樣品，并按供試品溶液制備方法配制陰性對(duì)照品溶液。

2．1．3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液，精密量取5μL，按擬訂色譜條件注入色譜儀，依法測(cè)定。結(jié)果陰性無(wú)干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取大黃素對(duì)照品0．83 mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，加甲醇使其溶解并定容，搖勻，配制成每1m L含83μg大黃素的對(duì)照品溶液，作為對(duì)照品溶液。取該對(duì)照品溶液各精密量取0．1，0．2，0．4，0．8，1．6，3．2mL，分別置5mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，再用0．22μm微孔濾膜過(guò)濾，按擬訂色譜條件，分別精密量取5μL進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Y＝17．365X－1．767 2，r＝0．999 9(n＝6)。結(jié)果表明，大黃素進(jìn)樣質(zhì)量濃度在1．66～53．12μg／m L范圍內(nèi)與峰面積值呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下質(zhì)量濃度為3．32μg／mL對(duì)照品溶液，精密量取5μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積值。結(jié)果大黃素峰面積的 RSD為0．94%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批醇提取物，按擬訂色譜條件，根據(jù)供試品溶液測(cè)定項(xiàng)下方法，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積值。結(jié)果其峰面積的 RSD為1．79%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，在室溫條件下避光放置，按擬訂色譜條件，分別在0，1，2，3，4，5，6 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積值。結(jié)果其峰面積的 RSD為1．29%（n＝7），表明供試品溶液至少在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批醇提物供試品，精密稱定，按高、中、低3個(gè)不同劑量分別精密加入大黃素對(duì)照品，充分混勻，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備溶液并依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 大黃素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2．2 提取工藝優(yōu)選

2．2．1 因素水平選擇

采用正交試驗(yàn)法，根據(jù)處方中中藥材所含有效成分的理化性質(zhì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)主要以乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、提取時(shí)間（因素B）、提取次數(shù)（因素C）、加醇倍量（因素D）為考察因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以大黃素和浸膏得率作為考察指標(biāo)，權(quán)重分別為60% 和40%，選用 L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表2。

表2 提取工藝優(yōu)選因素水平表

2．2．2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

按處方量稱取黃芪、虎杖、半枝蓮、白花蛇舌草等8味藥材，共稱9份，依次按 L9（34）正交表（表3）安排進(jìn)行回流提取，過(guò)濾，收集醇提取液，回收乙醇，移至表面皿中，置烘箱中，于55℃烘干至恒重，并計(jì)算浸膏得率[5]，取出，研細(xì)，混勻。稱取0．2 g，精密稱定，置10m L容量瓶中加甲醇溶解，超聲處理10min，再吸取1mL置5m L容量瓶中并定容至刻度，搖勻，依法分別測(cè)定其中的游離大黃素的含量。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 提取工藝優(yōu)選 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n＝3）

表4 提取工藝優(yōu)選方差分析表

2．2．3 最佳提取工藝確定

由表3可見，影響醇提中大黃素含量的因素大小順序是A＞D＞C＞B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞加醇倍量＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間。由表4可見，提取時(shí)間對(duì)大黃素含量影響不顯著（P＞0．05），乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)、加醇倍量對(duì)大黃素提取的影響具有顯著性（P＜0．05）。為了便于實(shí)際配制，綜合考慮，本研究中選定提取次數(shù)為2次，醇提最佳工藝條件確定為A3B2C2D2，即處方藥材加15倍量80%乙醇，提取2次，提取時(shí)間分別為1．5 h。

2．3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步考察該優(yōu)選的最佳制備工藝條件的穩(wěn)定性和可靠性，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，按處方稱取中藥材，在該最佳制備工藝條件下分別提取3批，進(jìn)行工藝驗(yàn)證，結(jié)果表明大黃素含量為3．235～3．533 mg／g，浸膏得率為18．89%～19．88%，符合預(yù)期設(shè)計(jì)，為肝炎康膠囊的制備提供了科學(xué)依據(jù)。

3 討論

肝炎康膠囊組方是在傳統(tǒng)中醫(yī)藥辨證施治原則基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果化裁研制。為了充分發(fā)揮其復(fù)方功效，體現(xiàn)中藥治療的整體性和調(diào)理性，該制劑在制訂制備工藝路線時(shí)分別采用了醇提、水提等制備步驟，以期對(duì)處方中醇溶性和水溶性的有效成分達(dá)到最大限度的提取。本研究中僅對(duì)醇提部分制備工藝進(jìn)行了初步探討，相關(guān)水提制備工藝部分、除雜部分工藝等試驗(yàn)尚在研究中，有待進(jìn)一步完善。

該膠囊的有效成分在醇提部位提取較完全。虎杖作為處方中君藥，具有清利濕熱、活血解毒利尿之功效，所含大黃素有效成分具有很明顯的藥理活性，如抗炎、抑菌、免疫調(diào)節(jié)[6]、保護(hù)肝腎[7－11]、利膽、抗氧化[12]、抑制血小板聚集[13]、抗癌[14－16]、改善微循環(huán)等。故本試驗(yàn)中主要以虎杖中游離大黃素的提取量作為考察指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)，確定了該制劑醇提部分最佳制備工藝條件，結(jié)果表明醇提制備工藝條件合理可行，可優(yōu)先用于該制劑的實(shí)際配制，同時(shí)也為該制劑獲得穩(wěn)定、連續(xù)的臨床療效提供了試驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

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Optim um on the Ethanol－Extraction Procedures of Ganyankang Capsules by O rthogonal Design Test

Wei Yajie1，Wang Juandi1，3，Qin Long1，Li Ping1，2，Li Yumin1，2，Zhang Lingyi1，Dai Dongliang1
（1．Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou，Gansu，China 730030； 2．Gansu Province Key Laboratory of Digestive System Tumors，Lanzhou，Gansu，China 730030； 3．Pharmacy College，Lanzhou University，Lanzhou，Gansu，China 730000）

Ob jective To optimize the ethanol－extraction procedures of Ganyangkang Capsules witn orthogonal design test．M ethods Using the extract yield and emodin as indexs，the optimum extraction conditions of ganyankang capsules were studied with the orthogonal test of L9（34）．Results The influencing effects for factor were described as A＞D＞C＞B（A：ethanol concentration，B：extracting frequency，C：extracting times，D：added ethanol volume）．The optimizing preparation conditions were A3B2C2D2，i．e．，added 15 times 80% ethanol，extracting for 2 times and 1．5 h per time．Conclusion The optimum ethanol－extracting procedures are feasible，rational and the extraction rate of active components is perfect，which can be applied to the preparation．

Ganyankang Capsules；orthogonal design test；ethanol－extracting；emodin

TQ 461；R284．1

A

1006－4931(2016)06－0032－04

韋亞潔，女，大學(xué)本科，副主任藥師，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)與醫(yī)務(wù)管理的研究與實(shí)踐，（電子信箱）yajiewei＠163．com；李平，男，博士研究生，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾滤幓蛐轮苿┑拈_發(fā)研究，本文通訊作者，（電話）0931－8942043（電子信箱）gsliping＠163．com。

2015－08－14)

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院院內(nèi)中醫(yī)藥科研項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：YJzy2013－26。