網(wǎng)絡科學在中藥多組分表征方面的應用

姜瑋

（江蘇省泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300）

網(wǎng)絡科學在中藥多組分表征方面的應用

姜瑋

（江蘇省泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300）

目的 介紹網(wǎng)絡科學在中藥領域的應用，為中醫(yī)藥理論的研究提供借鑒和參考。方法 介紹將網(wǎng)絡科學的理論方法引入到中藥多組分－復雜生物系統(tǒng)關系研究的成功案例，為研究“系統(tǒng)－系統(tǒng)”的復雜關系提供幫助。結果 以網(wǎng)絡科學發(fā)展而來的網(wǎng)絡藥理學、網(wǎng)絡靶點學及系統(tǒng)生物學等學科，給中醫(yī)藥研究增添了很多新的視角和活力。結論 隨著更多科學技術在中藥領域的應用，中藥復雜化學成分系統(tǒng)與復雜生物系統(tǒng)的相互作用將會越來越清晰。

網(wǎng)絡科學；無標度網(wǎng)絡；中醫(yī)藥；網(wǎng)絡藥理學；蛋白組學

近年來，隨著網(wǎng)絡科學的蓬勃發(fā)展，許多以前學科中無法解決或解釋得錯綜繁雜的相互關系網(wǎng)絡都可利用網(wǎng)絡科學的理論和方法進行探索和研究，從此各行業(yè)中涉及到與復雜網(wǎng)絡相關的研究就不再無從下手。網(wǎng)絡科學與生命科學的研究和發(fā)展更是息息相關，生命科學領域研究的是復雜的生物體與疾病間的相互關系，以前由于受到分子生物學和藥理學等學科發(fā)展的限制，再加上網(wǎng)絡科學的理論體系相對匱乏，因此生命科學中一些與復雜網(wǎng)絡相關的問題，如基因?qū)е碌募膊〖瓣P鍵蛋白介導的網(wǎng)絡通路，很難快速、準確地在復雜系統(tǒng)中表征和鑒定出來[1]。

西醫(yī)體系研究的是單組分藥物對生物體的影響，所以一定程度上簡化了網(wǎng)絡的結構。但中醫(yī)是從整體觀的角度看待疾病的發(fā)生和發(fā)展，在中醫(yī)的“審證求因”和“辨證施治”的指導原則下，勢必要以系統(tǒng)觀和整體論為基礎。中醫(yī)以中藥治療疾病，把機體看成一個相互作用的統(tǒng)一整體，各個組織器官相互作用、相互影響，共同產(chǎn)生機體的不同體征。中藥是由多組分構成的天然藥物，其治療疾病的解釋機理是“多組分－多靶點－多效應”共同作用[2]。因此，中藥復雜的組分和生物系統(tǒng)相互作用就構成了復雜的網(wǎng)絡結構，中醫(yī)體系研究的思維比西醫(yī)體系相對復雜得多。目前，制約中醫(yī)藥發(fā)展的重要因素就是未闡明治病機理，治療疾病帶有很大的模糊性和盲目性。中藥與機體相互作用的這一研究對象極復雜，由于未找到合適的方法和手段研究這2個復雜系統(tǒng)的相互作用，所以長期以來中醫(yī)藥的發(fā)展一直較緩慢。為了將中醫(yī)藥廣博的理論體系抽象化，必然需要用網(wǎng)絡科學的理論和方法來探討中醫(yī)藥復雜的整體觀。網(wǎng)絡科學中的小世界模型、無標度網(wǎng)絡和復雜網(wǎng)絡中的社區(qū)網(wǎng)絡的提出，極大程度地推動了中醫(yī)藥更快、更準地尋求治療疾病的本質(zhì)。以網(wǎng)絡科學的思想和理論為基礎迅速發(fā)展和演變而來的網(wǎng)絡藥理學、網(wǎng)絡靶點學、蛋白組學和代謝組學對促進中醫(yī)藥研究領域的發(fā)展起到了很重要的推動作用[3]。筆者分析探討了將網(wǎng)絡科學的技術和思想應用于表征中藥多組分功效的效果，以為中醫(yī)藥的研究提供參考。

1 確證靶點[4]

中醫(yī)證候的確定是中醫(yī)遣方用藥的基礎，只有正確地診斷患者疾病對應的中醫(yī)證候，才能正確地應用藥性理論治療疾病。目前的中醫(yī)診斷更多地依賴于臨床醫(yī)師經(jīng)驗，很難進行定量或定性監(jiān)控，加之幾千年來中醫(yī)的發(fā)展模式就是言傳身教、代代相傳，這樣的發(fā)展模式勢必會在如今高速發(fā)達的信息化時代顯得有些格格不入。面對此種現(xiàn)狀，清華大學李梢教授率先將網(wǎng)絡科學應用于中醫(yī)證候中的寒熱癥的表征研究，同時也尋找到與中醫(yī)寒熱癥相對應的特征生物標記物。研究的思路是定位出具有典型寒癥和熱癥患者這一非平衡網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點，該節(jié)點在局部組織和整個機體水平上具有明顯的生理功能。然后通過藥物干預調(diào)節(jié)該關鍵的節(jié)點，使非平衡網(wǎng)絡漸漸趨于平衡，表明網(wǎng)絡中關鍵節(jié)點就是導致寒癥和熱癥發(fā)生的生物標記物，進而可從分子水平上表征中醫(yī)中的寒熱癥，從而為高效篩選藥物提供很好的借鑒。具體研究方法[4]如下。

1)建立網(wǎng)絡模型

(1)種子基因是通過文獻記載研究發(fā)現(xiàn)的綜合后，采用統(tǒng)計學分析，優(yōu)選出對寒癥和熱癥具有潛在、有意義影響的基因。種子基因可編碼不同的蛋白而產(chǎn)生一系列靶點，然后再進一步反推各蛋白靶點分別受到何種中藥成分的作用。

(2)寒癥和熱癥患者體內(nèi)基因不同的表達，從而產(chǎn)生截然不同的疾病狀態(tài)，種子基因又和機體內(nèi)的基因共同表達的結果導致非平衡網(wǎng)絡模型的出現(xiàn)。

(3)通過與局部組織和平衡網(wǎng)絡模型比較，不同基因表達的蛋白靶點在寒、熱癥非平衡模型中相關性的得分，從而尋找出候選的生物標記物。

(4)驗證候選生物標記物的穩(wěn)定性及真實性。

平衡網(wǎng)絡模型的建立見圖1?？梢?，通過文獻和實踐過程，在陰陽平衡理論的指導下，將可能的代謝通路分別劃歸為熱癥和寒癥范疇，然后再通過定向剔除試驗驗證找到如圖1 B所示的幾個可能通過的種子靶點特異性地表征人體復雜代謝網(wǎng)絡中的寒癥和熱癥體征的患者，如能很好地鑒定出特異性靶點，將快速準確地診斷患者的體征，促進中醫(yī)藥的發(fā)展。圖1 B和圖1 C中都顯示熱癥和寒癥間的相互轉(zhuǎn)化必須要通過少數(shù)的關鍵節(jié)點，這樣的節(jié)點在人體寒熱癥網(wǎng)絡中起到關鍵的傳遞轉(zhuǎn)化作用。故重點調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中關鍵傳遞節(jié)點的活性，將非常有助于保持網(wǎng)絡的平衡，從而使機體處于一種最佳狀態(tài)，進而能很好地維持機體穩(wěn)態(tài)。

2)確定寒、熱癥

該研究選定的熱癥和寒癥患者的癥狀表現(xiàn)都與診斷學原理上介紹的熱癥、寒癥的表現(xiàn)型相同，并經(jīng)過權威醫(yī)療機構倫理委員會鑒定。最后挑選出的81名志愿者中，有37名寒癥患者和44名熱癥患者。通過酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定熱癥和寒癥患者尿液中的代謝物，并與正常人的尿液比較。整個過程采用免疫組化技術完成，通過分子水平測定不同體征樣本中代謝物的情況，為進一步表征網(wǎng)絡結構作鋪墊。通過主成分分析方法對不同體征的樣品中代謝物的整體情況進行表征，結果顯示，寒癥和熱癥患者體內(nèi)代謝物的特征可明顯分為2類，其中熱癥樣品可聚為一簇，寒癥患者又聚為另一簇。試驗數(shù)據(jù)進一步證明，不同證候患者體內(nèi)的代謝物水平及程度不同，表明尋求不同證候的不同生物標記物是有意義的。

3)寒、熱癥非平衡網(wǎng)絡的構建與解析

通過與前文平衡網(wǎng)絡的結構特性進行比對，可很快發(fā)現(xiàn)寒、熱癥組成的非平衡網(wǎng)絡的生物標記物。首先，通過不同基因的表達，設置1個閾值過濾掉無意義的網(wǎng)絡節(jié)點，將不同的蛋白看成不同的節(jié)點，種子基因表達的蛋白之間的關系構成網(wǎng)絡中的連邊，以連邊的得分賦予不同連邊一定權重，進而代表相應節(jié)點在表征疾病的過程中的重要性。研究結果表明，種子基因及相鄰的基因的關系網(wǎng)中的網(wǎng)絡中核心區(qū)域A是反映網(wǎng)絡失衡的重要區(qū)域。由圖2可見，免疫代謝、能量代謝和炎癥應激3個模塊共同構成了1個復雜網(wǎng)絡，每個模塊內(nèi)部發(fā)生錯綜復雜的聯(lián)系，而不同模塊之間只通過少量的節(jié)點產(chǎn)生有限的聯(lián)系，這種不同模塊之間共有的節(jié)點就是聯(lián)系不同功能模塊的重要標志物。3個功能區(qū)域都是由原有的種子基因及其鄰近的節(jié)點組成，節(jié)點的度值越大，可能與非平衡機體產(chǎn)生的關系越大。其中在每個功能區(qū)域的社區(qū)網(wǎng)絡又可看成由經(jīng)典的無標度網(wǎng)絡構成，符合80／20法則，且具有無標度網(wǎng)絡所具有的特征性的脆弱性和魯棒性，度分布符合冪律分布p（k）～k－γ，γ是冪律分布的常量參數(shù)（2＜γ＜3）。在這無標度網(wǎng)絡中，高度數(shù)節(jié)點，即常規(guī)的Hub節(jié)點起著關鍵作用，此類Hub節(jié)點連通了大量分散的低度數(shù)節(jié)點，在整個網(wǎng)絡中扮演重要的角色，因此在此代謝網(wǎng)絡中就是核心代謝物即特定功能模塊的生物標記物。從分子水平和整體動物水平對定位的核心代謝物進行驗證，然后通過代謝物最后反推核心表達基因，進而可很好地指導臨床實踐。由試驗結果尋找代謝物，可很快尋找到寒癥與熱癥患者不同的體征，是由于立普妥受體得以很好地激活，進而使體內(nèi)熱量代謝循環(huán)受到阻礙。與熱癥患者相比，由于營養(yǎng)代謝和能量消耗降低導致中醫(yī)中寒癥體征的出現(xiàn)，故該研究中首次用試驗驗證寒癥患者的體征出現(xiàn)與代謝抑制相關，可在很大程度上幫助中醫(yī)藥發(fā)展，也有助于中醫(yī)藥被世界所接受。此項研究是網(wǎng)絡科學理論應用于中醫(yī)藥研究的典型成功案例，相信隨著技術手段的不斷發(fā)展和理論實踐的不斷完善，會有越來越多的中醫(yī)證候得以表征。

2 多成分－多靶點[3]

圖1 熱、寒癥平衡網(wǎng)絡模型建立示意圖[4]

隨著李梢課題組對寒癥和熱癥這一非常抽象的中醫(yī)證候問題的解碼，并明確地提出能量代謝通路及免疫循環(huán)通路的紊亂失調(diào)分別是導致寒癥和熱癥患者體征出現(xiàn)的重要因素，然而其考慮的網(wǎng)絡結構還是相對簡化，只考慮了疾病狀態(tài)而未加入中醫(yī)用藥治病的這一重要環(huán)節(jié)。中藥組分復雜，進入機體后，很難明確地指出每個成分各自作用的靶點，雖整體觀不需解釋和弄清體內(nèi)具體的變化過程，但人類的認知過程又需要對其具體過程進行詳細解釋，這一直是困擾中醫(yī)藥工作者研究的難題。

有幸的是，呂愛平課題組依然以寒、熱癥為研究證候，在中醫(yī)治療寒、熱癥的原則“寒者熱之，熱者寒之”和中藥藥性理論的指導下，選取10味寒性藥和10味熱性藥分別治療熱癥和寒癥體征患者，在細胞周期、信號通路、細胞生長、二次信號傳導記憶癌細胞的變化等方面將中藥的多組分和機體內(nèi)的多個靶點進行關聯(lián)性分析，構建不同的復雜網(wǎng)絡結構，并對此復雜網(wǎng)絡進行解析和提取。由此得到復雜的典型的二分圖網(wǎng)絡結構，見圖3。

圖2 寒、熱癥代謝網(wǎng)絡圖[4]

此二分圖網(wǎng)絡結構在生物網(wǎng)絡中普遍存在且研究較多，其中2008年著名網(wǎng)絡科學家Albert教授成功地將網(wǎng)絡科學的理論引用于生物網(wǎng)絡系統(tǒng)。Albert研究了白細胞中信號傳導網(wǎng)絡的構建，并將其構建的網(wǎng)絡，即基因－疾病網(wǎng)絡的二分圖成功地發(fā)表于美國國家科學院院刊(PNAS)[5]。他還對基因網(wǎng)絡的構建方法進行了很好地總結[1，6]?？梢?，中藥的多成分與多靶點的網(wǎng)絡也屬于生物網(wǎng)絡中常見的二分網(wǎng)絡結構。圖3 B最后提取出了寒性藥和熱性藥的關鍵蛋白，其中不同類型的活性成分又可特異性地作用于少數(shù)的幾個蛋白靶點[3]，大大地提高了中藥開發(fā)新藥的進程，減少了盲目性和不確定性。因此，利用網(wǎng)絡科學可讓復雜的網(wǎng)絡問題變得更直觀化，有利于問題的解決。

3 多成分－多靶點－多效應[2]

網(wǎng)絡科學的知識體系可用于解析中醫(yī)證候中關鍵的生物標志物。研究者進而將研究對象進一步放大，使本就復雜的機體通路網(wǎng)絡中再加上多組分中藥這一關鍵因素；將若干個成分節(jié)點投放到復雜的靶點網(wǎng)絡通路系統(tǒng)中進一步做關聯(lián)性研究，使網(wǎng)絡結構更復雜。網(wǎng)絡科學的處理方法應用于中醫(yī)藥復雜網(wǎng)絡中進行建模仿真，也可得到客觀有價值的研究結果。通過成分與標記物的有效連接，可直觀地表征中藥多組分和人體多靶點的相互關系。雖然上述研究結果已對中醫(yī)藥的發(fā)展起到了極重要的作用，但仍遺漏掉了中藥治病的一步關鍵環(huán)節(jié)，即多效應。中藥多組分與多個靶點結合后必然產(chǎn)生不同的效應結果和強度，如何真實有效地刻畫中藥多成分－機體多靶點－多效應三者之間的關系，需要網(wǎng)絡科學的知識結構。浙江大學陳翼宇教授以中成藥（血塞通注射液）為例成功地表征了多成分－多靶點－多效應三者網(wǎng)絡結構，見圖4?？梢?，多組分作用于不同的靶點蛋白節(jié)點，通過蛋白節(jié)點的改變進而影響通路的結構，產(chǎn)生不同的效應，因此靶點蛋白在藥物治療過程中的作用非常重要，由研究結果的網(wǎng)絡結構分析找出了其中具有重要功能的靶點有70個，其中有32個可用試驗結果予以驗證。該項研究很好地證明和直觀地表示了中醫(yī)藥治病機理的多成分－多靶點－多效應，對于中醫(yī)藥進一步深入研究提供了很好的借鑒。

4 結語

圖3 不同評價體系下構建的網(wǎng)絡結構圖[3]

圖4 血塞通注射液多成分－多靶點－多效應網(wǎng)絡結構圖[3]

隨著科學技術的不斷發(fā)展，醫(yī)工交叉的現(xiàn)象會越來越普遍，交流也會越來越頻繁，因此一個學科的發(fā)展會在很大程度上促進相關學科的發(fā)展。網(wǎng)絡科學的興起和發(fā)展對生命科學的發(fā)展起到了很重要的作用。網(wǎng)絡科學在近年來取得了長足的發(fā)展，人們認識到真實的網(wǎng)絡既不是規(guī)則的也不是隨機的，而是處于二者間的小世界網(wǎng)絡和無標度網(wǎng)絡。這2個著名網(wǎng)絡模型的提出，在很大程度上解釋了自然界和社會網(wǎng)絡中很多有趣的現(xiàn)象。但網(wǎng)絡科學研究仍面臨很多的挑戰(zhàn)，如提升網(wǎng)絡容量以及建模仿真。對于生命科學，需解決的是如何高通量、高效率地篩選不同化合物，如何精確快速地打通不同的信號通路以及如何實時動態(tài)評價在體代謝情況。因此，未來人才的需求既要專又要廣，這樣才能對提升科技創(chuàng)新帶來很好的推動作用。

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App lications of Network Science in M ulticom ponent Representation of Traditional Chinese M edicine

Jiang Wei
（Taizhou Municipal Institute for Food and Drug Control，Taizhou，Jiangsu，China 225300）

Ob jective To introduce the app lication of network science in the field of traditional Chinese medicine（TCM）for providing reference for the research on the theory of TCM．M ethods The theory of network science method which was used to research on the relationship between the TCM multicomponent and the complex biological systems successfully was introduced，assistances for studying the complex relationship between them were provided．Resu lts The network pharmacology，network targets，systems biology and so on which were derivatived from the network science added many new perspective and vitality for the studying of the TCM．Conclusion The complex relationship between the TCM multicomponent and the complex biological systems will be clearer by more advanced technologies app lied in the field of TCM．

network science；scale－free networks；traditional Chinese medicine；network pharmacology；proteomics

R2－03；R28

A

1006－4931(2016)06－0001－06

2015－10－14)