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    FGF-2上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)拮抗心肌細(xì)胞凋亡

    2016-12-24 17:35:12利軍

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    (1.南華大學(xué)心血管疾病研究所 動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院檢驗(yàn)科;3.南華大學(xué)兒科學(xué)院 湖南省兒童醫(yī)院科教科)

    ·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

    FGF-2上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)拮抗心肌細(xì)胞凋亡

    李國(guó)華1,劉米華1,2#,彭娟1,肖衛(wèi)晉1,屈順林1,唐之晗1,郭芳1,彭利軍1,3,任重1,危當(dāng)恒1,劉錄山1,王佐1,姜志勝1*

    (1.南華大學(xué)心血管疾病研究所 動(dòng)脈硬化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽 421001;2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院檢驗(yàn)科;3.南華大學(xué)兒科學(xué)院 湖南省兒童醫(yī)院科教科)

    目的探討成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(FGF-2)拮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法以H9c2大鼠心肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,用無血清培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24小時(shí),心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常組(Control)、缺氧/復(fù)氧(H/R)組和H/R+FGF-2組。采用CCK-8比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率,Hoechst染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。采用Western blot檢測(cè)生存素(Survivin)蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常組相比,H/R明顯抑制心肌細(xì)胞活力,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡(均P<0.01);與H/R組相比,F(xiàn)GF-2顯著改善H/R心肌細(xì)胞活力,拮抗H/R心肌細(xì)胞凋亡,同時(shí)上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)(均P<0.05)。結(jié)論FGF-2拮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用與其上調(diào)Survivin蛋白表達(dá)有關(guān)。

    成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2; 細(xì)胞凋亡; 生存素

    成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(Fibroblast growth factor-2,F(xiàn)GF-2)是廣泛分布在體內(nèi)各個(gè)組織的多功能生長(zhǎng)因子,具有極強(qiáng)的促有絲分裂作用,能促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和遷移,具有強(qiáng)大的促血管新生作用。本課題組和國(guó)外其他學(xué)者的研究都表明,F(xiàn)GF-2是一種重要的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)物質(zhì),具有明顯的心肌保護(hù)作用,能夠拮抗心肌細(xì)胞凋亡[1-4]。FGF-2拮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用主要與其結(jié)合FGF受體1(FGFR1),激活蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular-signal regulated protein kinase,ERKs)和蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt),抑制c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和蛋白激酶p38 (p38MAPK),促進(jìn)NO、Bcl-2和間隙連接蛋白43(Connexin 43,CX43)等蛋白表達(dá),抑制Bax、Bim和p53等蛋白表達(dá)相關(guān)[2,4,5]。然而,F(xiàn)GF-2抑制心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍未完全闡明。

    生存素(Survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中最小成員,是目前發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)最強(qiáng)的抑凋亡基因之一,具有調(diào)控細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,促進(jìn)血管形成等功能,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[6-7]。近期研究表明,Survivin在心血管疾病中也扮演著重要的角色,主要發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)損傷修復(fù)及重構(gòu),促血管新生和細(xì)胞增殖等作用[8]。研究發(fā)現(xiàn),缺血預(yù)處理(Ischemic preconditioning,IPC)[9-10]、阿片受體激動(dòng)劑[11]、胰島素[12-13]、右丙亞胺(Dexrazoxane,DRZ)[14]均可上調(diào)心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡。但是Survivin是否在缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá),以及FGF-2對(duì)H/R心肌細(xì)胞中Survivin表達(dá)的影響及意義,尚不明確。本研究以H9c2大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象,初步探討Survivin是否在FGF-2拮抗H/R心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用,為缺血性心臟病的治療提供新思路和新的干預(yù)環(huán)節(jié)。

    1 材料與方法

    1.1藥物與試劑H9c2大鼠心肌細(xì)胞系購于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為美國(guó)HyClone公司;Recombinant Rat FGF-2購于美國(guó)PeproTech公司;CCK-8試劑盒為廣州奕源生物科技有限公司;胰蛋白酶、Hoechst33258凋亡檢測(cè)試劑盒、兔抗大鼠Survivin多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗均為江蘇碧云天生物技術(shù)研究所;BCA蛋白定量試劑盒和兔抗大鼠β-actin多克隆抗體均為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;FITC Annexin V Apoptosis Detection KitI購于美國(guó)BD pharmingen公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組H9c2大鼠心肌細(xì)胞接種于含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,放在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞用胰蛋白酶消化傳代、收集,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)前用無血清培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24小時(shí),再加藥物預(yù)處理。心肌細(xì)胞隨機(jī)分為:正常組(Control);H/R組;H/R+FGF-2組,心肌細(xì)胞預(yù)孵育10 ng/mL FGF-2 30分鐘,缺氧90分鐘,復(fù)氧120分鐘。

    1.3心肌細(xì)胞H/R模型的建立根據(jù)文獻(xiàn)所報(bào)道的方法,建立心肌細(xì)胞H/R損傷模型:同步化的心肌細(xì)胞,更換為無糖和無血清的Hanks’平衡鹽溶液(1.3 mM CaCl2,5 mM KCl,0.3 mM KH2PO4,0.5 mM MgCl2, 0.4 mM MgSO4,69 mM NaCl,4 mM NaHCO3和0.3 mM Na2HPO4),Hanks’平衡鹽溶液預(yù)先用95% N2~5% CO2飽和,將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板置于持續(xù)95%N2~5% CO2平衡的缺氧孵育容器中(O2濃度≤1%),37 ℃,90分鐘后,更換為預(yù)平衡(37 ℃、95% O2~5% CO2)的無血清DMEM培養(yǎng)基,放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120分鐘,結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

    1.4 CCK-8比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率根據(jù)CCK-8試劑盒說明書,將H9c2大鼠心肌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),接種于96孔培養(yǎng)板中,100 μL/孔,每孔細(xì)胞數(shù)大于1000個(gè),在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜或大于5個(gè)小時(shí)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔的70%~80% 面積時(shí),加入不同的處理因素,每個(gè)處理因素至少設(shè)3個(gè)復(fù)孔和1個(gè)空白孔。終止處理后,每孔加10μlCCK-8溶液,避免產(chǎn)生氣泡,37C 孵育1.5小時(shí),用酶標(biāo)儀(λ= 450 nm )測(cè)定各孔的吸光度(OD)。取3孔OD值的平均數(shù),按公式計(jì)算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率(%)=(處理組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%,至少重復(fù)3次。

    1.5 Hoechst染色觀察心肌細(xì)胞凋亡將心肌細(xì)胞懸浮液接種于6孔板內(nèi),待細(xì)胞貼壁后,按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給予不同藥物處理,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,棄去培養(yǎng)液。PBS清洗3遍,每次3~5分鐘,加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘,棄去固定液,用PBS清洗3遍,Hoechst33258染色液染色20分鐘,去離子水沖洗3遍,每次3~5分鐘。在熒光顯微鏡下,以紫外光340 nm波長(zhǎng)激發(fā),觀察并攝片。

    1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞,以2×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于50 mL的培養(yǎng)瓶,放在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至70%~80%融合狀態(tài)時(shí),更換為含0.1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24小時(shí),再按實(shí)驗(yàn)分組加入不同的處理因素繼續(xù)孵育,最后收集細(xì)胞。

    PBS液清洗1次后,根據(jù)美國(guó)BD pharmingen公司的FITC Annexin V Apoptosis Detection KitI說明書,采用FITC-Annexin V/PI雙染色,結(jié)合流式細(xì)胞儀,檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。

    1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)按照哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白,利用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量;在蛋白上清溶液加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,在100℃沸水,加熱10分鐘,使蛋白質(zhì)變性;采用12.5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5小時(shí),接著220 mA電流轉(zhuǎn)膜2小時(shí),使蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜;含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h;用含有抗Survivin(1∶1000)、β-actin(1∶2000)一抗的 TBST溶液,4℃孵育過夜,TBST洗滌3次;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗 (1:1000),室溫孵育2小時(shí),TBST洗滌3次;用ECL化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行曝光顯影,采用完全自動(dòng)的化學(xué)發(fā)光圖像拍攝和分析系統(tǒng),攝像和分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值。

    2 結(jié) 果

    2.1 FGF-2對(duì)H/R心肌細(xì)胞活力的影響心肌

    細(xì)胞活力變化如圖1所示,H/R顯著抑制心肌細(xì)胞活力,與正常組(96.0±2.8%)相比,差異具有顯著性(P<0.01)。H/R+FGF-2組(89.0±3.0%)心肌細(xì)胞活力明顯增強(qiáng),與H/R組(81.3±2.6%)相比,差異具有顯著性(P<0.05)。以上結(jié)果提示FGF-2能明顯改善H/R心肌細(xì)胞的活力。

    圖1 FGF-2改善H/R心肌細(xì)胞的活力 與Control比較,*:P<0.05,**:P<0.01;與H/R比較,#:P<0.05,n=3

    2.2 FGF-2對(duì)H/R心肌細(xì)胞凋亡的影響首先采用Hoechst染色,觀察H9c2心肌細(xì)胞凋亡的核形態(tài)變化(圖2)。Hoechst染色后,正常心肌細(xì)胞的細(xì)胞核大小形態(tài)較為均一,多呈圓形或橢圓形,形態(tài)清晰完整,熒光染色呈勻質(zhì)狀,而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染色較亮,核濃染,核固縮,或呈半月形和圓形凝聚。正常組存在少量心肌細(xì)胞凋亡,H/R可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,與正常組相比,H/R組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,但加入FGF-2預(yù)孵育后,H/R所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少。

    圖2 FGF-2對(duì)H/R心肌細(xì)胞凋亡的影響 (200×)

    進(jìn)一步采用FITC-Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù),檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的凋亡率。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖3所示,正常組心肌細(xì)胞凋亡率為3.1±0.8%。H/R組心肌細(xì)胞凋亡率為13.6±1.4%,與正常組相比,差異具有顯著性(P<0.01)。H/R+FGF-2組心肌細(xì)胞凋亡率降低至7.5±1.2%,與H/R組相比,差異具有顯著性(P<0.05)。此結(jié)果與Hoechst染色的結(jié)果吻合。以上結(jié)果說明FGF-2明顯拮抗H/R所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

    圖3 FGF-2抑制H/R心肌細(xì)胞的凋亡 與Control比較,**:P<0.01;與H/R比較,#:P<0.05,n=3

    2.3 FGF-2對(duì)H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響Survivin是一個(gè)抗凋亡蛋白,從圖4可以看出,H/R對(duì)心肌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)不會(huì)造成什么影響,與正常組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但在H/R的基礎(chǔ)上加入FGF-2后,Survivin蛋白表達(dá)明顯增加,與H/R組相比,差異具有顯著性(P<0.01),這提示FGF-2能促進(jìn)H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)。

    圖4 FGF-2促進(jìn)H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá) 與H/R比較,**:P<0.01,n=3

    3 討 論

    缺血性心臟病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病。盡量縮短組織缺血時(shí)間,及時(shí)有效的恢復(fù)心肌血液供應(yīng)是挽救缺血性心臟病的最有效辦法。但是再灌注治療不可避免的會(huì)給心肌帶來缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)。心肌IRI的機(jī)制復(fù)雜,而心肌細(xì)胞凋亡是其主要病理機(jī)制之一[15]。

    本課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn),F(xiàn)GF-2可以減少大鼠離體再灌注心臟細(xì)胞色素C(cytochrome c)的釋放,提示FGF-2很可能具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)采用H9c2大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型,缺氧90分鐘,復(fù)氧120分鐘,采用Hoechst染色及FITC-Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù),發(fā)現(xiàn)FGF-2顯著降低心肌細(xì)胞凋亡率。本課題組[2]最近研究發(fā)現(xiàn)FGF-2拮抗H2O2所誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡。Iwai-Kanai,等[16]發(fā)現(xiàn)FGF-2可以拮抗LPS或H2O2所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)FGF-2可以對(duì)抗阿霉素所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。Wang,等[5]發(fā)現(xiàn)FGF-2可以拮抗過氧化氫叔丁醇(tert-Butyl hydroperoxide solution,TBHP)所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明FGF-2具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用。

    Survivin是分子量最小的IAP成員,其基因位于染色體17q25,可編碼產(chǎn)生由142個(gè)氨基酸組成的胞漿蛋白,分子量約為16.5kD。它主要表達(dá)于胚胎組織和腫瘤組織,而在終末分化成熟的正常成人組織中無表達(dá)或低表達(dá)。但是Santini[18]等人采用免疫組化檢測(cè)急性心肌梗死患者的心肌組織,發(fā)現(xiàn)Survivin在遠(yuǎn)離梗死部位心肌的表達(dá)比梗死周圍心肌表達(dá)的比例高,并且高于正常對(duì)照。Survivin的表達(dá)與心肌凋亡和心室重構(gòu)呈負(fù)性相關(guān),并且Survivin的表達(dá)與受威脅心肌的存活相關(guān),并預(yù)示急性心肌梗死后良性重構(gòu)的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn),在充血性心衰患者,心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)與細(xì)胞大小和DNA含量相關(guān),并且在減輕心臟負(fù)荷后表達(dá)明顯下降,提示Survivin蛋白很可能減輕心室肥厚的發(fā)生[19]。在自發(fā)性高血壓大鼠,Survivin蛋白表達(dá)指數(shù)與心肌凋亡和不良性心肌重構(gòu)呈負(fù)相關(guān),提示Survivin很可能抑制心肌細(xì)胞凋亡,改善不良性心肌重構(gòu)[20]。本實(shí)驗(yàn)采用Western blot方法觀察FGF-2對(duì)H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)FGF-2能促進(jìn)H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)。

    Survivin可以拮抗心肌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮心肌保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),IPC可以通過激活PI3k-Akt-GSK-3β-β-catenin信號(hào)通路,上調(diào)Survivin、Bcl-2和VEGF的表達(dá),促進(jìn)心肌梗死后大鼠血管新生,拮抗大鼠心肌細(xì)胞凋亡[10];當(dāng)沉默β-catenin表達(dá)后,IPC對(duì)缺血大鼠心臟心功能的改善作用及對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用被消弱,這很可能與Survivin、Bcl-2和VEGF蛋白表達(dá)受抑制有關(guān)[9]。阿片受體激動(dòng)劑嗎啡和δ阿片受體激動(dòng)劑DADLE均能通過激活MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路,上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá),拮抗饑餓所誘導(dǎo)的原代大鼠心肌細(xì)胞凋亡[11]。胰島素可以通過激活PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路,上調(diào)大鼠缺血/再灌注心肌Survivin蛋白的表達(dá),拮抗心肌細(xì)胞凋亡和縮小心肌梗死面積,通過上調(diào)H/R心肌細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá),拮抗原代大鼠心肌細(xì)胞凋亡[12];胰島素可以通過激活PI3K-Akt-mTORC1信號(hào)通路,阻止轉(zhuǎn)錄因子Sp1的降解,促進(jìn)心肌細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡,拮抗阿霉素對(duì)心肌細(xì)胞的毒性[13]。DRZ通過增加HIF-1a和HIF-2a的表達(dá)及增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性,促進(jìn)Survivin、Mcl-1和HO蛋白的表達(dá),拮抗阿霉素對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的毒性[14]。因此,以上研究表明FGF-2通過上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá),改善H/R心肌細(xì)胞活力,拮抗H/R心肌細(xì)胞凋亡。本課題組[2]最近研究發(fā)現(xiàn)FGF-2可拮抗氧化應(yīng)激引起的H9c2心肌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制與激活PI3K-Akt-FoxO3a信號(hào)通路有關(guān)。所以我們推測(cè)FGF-2很可能通過激活PI3K-Akt信號(hào)通路,上調(diào)Survivin蛋白的表達(dá),拮抗H/R心肌細(xì)胞凋亡,這需要下一步研究證實(shí)。

    總之,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,F(xiàn)GF-2拮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用與其上調(diào)Survivin蛋白表達(dá)有關(guān)。這進(jìn)一步充實(shí)了FGF-2拮抗心肌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮心肌保護(hù)作用的作用機(jī)制,可為缺血性心臟病的防療提供新思路。

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    FGF-2InhibitsCardiomyocytesApoptosisInducedbyHypoxia/reoxygenationviaUpregulatingtheExpressionofSurvivininH9c2cells

    LI Guohua,LIU Mihua,PENG Juan,et al
    (InstituteofCardiovascularDisease,KeyLabforArteriosclerologyofHunanProvince,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

    ObjectiveTo investigate the mechanism of FGF-2’s fighting against H9c2 cardiomyocytes apoptosis induced by Hypoxia/reoxygenation(H/R).MethodsH9c2 cardiomyocytes was employed as the experimental object,cells were incubated by free serum for 24 h for synchronous cell cycle,then,H9c2 cardiomyocytes were randomly divided into 3 groups:Normal group(Control),H/R group, H/R+FGF-2 group.The viability of cardiomyocytes was measured by CCK-8.The apoptosis rate of cardiomyocytes was detected by Hoechst and Armexin-V/PI assays with flow cytometry.Survivin expression were analyzed by western Blot.ResultsCompared to the Contrd group,H/R significantly decreased the viability of cardiomyocytes and induced cardiomyocytes apoptosis(P<0.01).Treatment with FGF-2 for H/R significantly increased the viability of cardiomyocytes subjected to H/R,suppressed cardiomyocytes apoptosis induced by H/R and up-regulated the expression of Survivin (P<0.05).ConclusionFGF-2 inhibits cardiomyocytes apoptosis induced by H/R in H9c2 cells,which the mechanism may be related to the up-regulation of Survivin expression.

    fibroblast growth factors-2; apoptosis; survivin

    10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.006

    2016-05-08;

    2016-06-29

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81470435、81541005)、湖南省衛(wèi)生廳科研計(jì)劃課題(B2011-041).

    *通訊作者,E-mail:zsjianglab@aliyun.com.

    #同為第一作者

    R541

    A

    秦旭平)

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