AngⅡ?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞CGRP受體組分的調(diào)節(jié)差異

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(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)藥物藥理研究所)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

AngⅡ?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞CGRP受體組分的調(diào)節(jié)差異

吳媛1，彭虹艷2#，朱怡1，駱竟妃2，秦旭平2*

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)藥物藥理研究所)

目的探討血管緊張素Ⅱ?qū)θ四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)受體組分的影響。方法以HUVECs作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24 h后，以Ang Ⅱ非處理細(xì)胞為對(duì)照組，AngⅡ處理組為不同劑量的AngⅡ處理HUVECs 12 h,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖率和凋亡率。Western Blot檢測(cè)CGRP三種受體組分，即降鈣素受體樣受體(CRLR)、降鈣素受體組分蛋白(RCP)和受體修飾蛋白(RAMP)1的蛋白表達(dá)。

結(jié)果與對(duì)照組相比，在處理組細(xì)胞，AngⅡ呈劑量依賴性地抑制HUVECs增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)上調(diào)CRLR表達(dá)(P<0.01)。而對(duì)另外兩個(gè)受體蛋白而言，AngⅡ(0.01～100 nmol/L)呈劑量依賴性的下調(diào)HUVECs的RAMP1的表達(dá)和RCP表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論AngⅡ影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CGRP受體組分的表達(dá)存在差異，可引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CGRP受體功能改變。

血管緊張素Ⅱ; 降鈣素基因相關(guān)肽受體; 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

內(nèi)皮細(xì)胞損傷與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)。正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生一些細(xì)胞因子通過調(diào)節(jié)血管張力、細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡、血液凝固等外周環(huán)境的變化，來(lái)維持其功能的穩(wěn)定性。當(dāng)各種損傷因素導(dǎo)致其功能失代償時(shí)，其細(xì)胞受體和離子通道可能發(fā)生變化，進(jìn)而加重細(xì)胞損傷。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ) 是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的主要活性肽[1]。Ang Ⅱ可通過多種途徑如刺激細(xì)胞壁產(chǎn)生過量活性氧簇(reactive oxygen space,ROS)、致敏血小板、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子、抑制一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)產(chǎn)生以及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等作用損傷血管內(nèi)皮[2-3]，但Ang Ⅱ作用的具體機(jī)制仍不十分明確。

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)是目前已知的最強(qiáng)的擴(kuò)血管物質(zhì)之一,并對(duì)心血管功能保護(hù)有重要作用。CGRP受體是由降鈣素受體樣受體(clcitonin receptor-like receptor，CRLR),受體活性修飾蛋白1(receptor activity modifying protein，RAMP1),受體組分蛋白(receptor component protein，RCP)三個(gè)組分組成[4]。前期工作表明，CGRP能抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與干擾受體后信號(hào)通路如ERK1/2，P38MAPK有關(guān)[5]。但Ang Ⅱ是否影響細(xì)胞CGRP受體發(fā)生重構(gòu)，仍不清楚，本研究以內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，探討AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是否伴隨有CGRP受體成分的變化，為研究不同血管活性物質(zhì)之間的相互作用提供新思路。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑AngⅡ 購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；低糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清為天津?yàn)笊锕?；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于康為世紀(jì)公司；胰蛋白酶為碧云天生物公司。RAMP1、CRLR、RCP、β-actin一抗購(gòu)于Santa公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化傳代、收集，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24 h后，以Ang Ⅱ非處理細(xì)胞為對(duì)照組，AngⅡ處理組為不同劑量的AngⅡ處理HUVECs 12 h。

1.3 PI單染色流式細(xì)胞術(shù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，以2×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合狀態(tài)時(shí)，更換為含0.1% FBS的1640培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，再按分組加入不同的處理因素繼續(xù)孵育后收集細(xì)胞。PBS液清洗1次，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，含10% FBS的1640終止消化，吹打成細(xì)胞懸液后，4 ℃,100 00 rmp離心5 min，棄上清，用體積分?jǐn)?shù)為75%冰乙醇吹打成單細(xì)胞懸液，吸入到的EP管中，4 ℃固定過夜。樣品寄北京中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與增殖。

1.4 Western blot 收集不同濃度AngⅡ處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞裂解液(RIPA∶PMSF=6∶1)冰上裂解15 min,4 ℃、12 000 rpm離心15 min，取上清；BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量；上清液中加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃沸水煮10 min；經(jīng)12%分離膠/5%濃縮膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，電轉(zhuǎn)2 h至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h；分別按照1∶1 000、1∶650、1∶200、1∶100的濃度加入β-actin、RCP、CRLR、RAMP1一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗3次；按照1∶5 000濃度孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗，室溫?fù)u晃45 min，TBST洗3次；用Western blot熒光檢測(cè)試劑盒顯影1～20 min，定影1 min；結(jié)果圖用AlphaImager2200進(jìn)行圖片灰度掃描。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graph Pad Prism5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HUVECs增殖與凋亡率前期研究表明，AngⅡ?qū)UVECs的增殖和凋亡有影響。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選用不同濃度(0.01、1、100 nmol/L)AngⅡ刺激HUVECs 24 h后，結(jié)果顯示0.01，1，100 nmol/L濃度的AngⅡ呈濃度依賴性抑制HUVECs的增殖或活力。在100 nmol/L AngⅡ時(shí)的抑制作用達(dá)到最大。AngⅡ?qū)?xì)胞凋亡的影響趨勢(shì)卻與增殖相反，隨著Ang Ⅱ濃度的增加HUVECs的凋亡率也增加(見表1)。

表1不同濃度的AngⅡ?qū)UVECs增殖和凋亡的影響

組別凋亡率(%)增殖率(%)對(duì)照組2.76±0.35100±8.21AngⅡ(nmol/L) 0.012.89±0.7790.8±8.71a 1.0029.2±1.24a85.3±9.03a 10079.6±1.35b55.7±8.03b

與對(duì)照組比較，a:P<0.05，b:P<0.01

2.2 AngⅡ?qū)RLR表達(dá)的影響CRLR是一個(gè)7個(gè)跨膜蛋白，從圖1可以看出，與對(duì)照組相比，AngⅡ能使內(nèi)皮細(xì)胞CRLR蛋白表達(dá)增加。并表現(xiàn)出劑量依賴性，在1 nmol/L時(shí)差異有顯著性(P<0.01)。

圖1 血管緊張素Ⅱ?qū)?nèi)皮細(xì)胞CRLR表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，*：P<0.05,**：P<0.01(n=3)

2.3 AngⅡ?qū)AMP1表達(dá)的影響RAMP1是受體伴隨蛋白，與CRLR的分布有關(guān)，從圖2可以看出，與對(duì)照組相比，AngⅡ能使內(nèi)皮細(xì)胞RAMP1蛋白表達(dá)降低。在0.01 nmol/L時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但在100 nmol/L時(shí)，AngⅡ?qū)AMP1表達(dá)抑制作用,雖然與1 nmol/L有所升高，但與對(duì)照組比較仍有降低趨勢(shì)(P<0.05)。

圖2 血管緊張素Ⅱ?qū)?nèi)皮細(xì)胞RAMP1表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，*:P<0.05,**：P<0.01(n=3)

2.4 AngⅡ?qū)CP表達(dá)的影響RCP是受體周邊蛋白，與CRLR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，從圖3可以看出，與對(duì)照組相比，AngⅡ能使內(nèi)皮細(xì)胞RCP蛋白表達(dá)降低，并具有劑量依賴性。但在100 nmol/L時(shí)，AngⅡ?qū)CP表達(dá)抑制作用才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AngⅡ?qū)CP蛋白的表達(dá)影響與其他兩個(gè)受體蛋白表達(dá)有差異。

圖3 血管緊張素Ⅱ?qū)?nèi)皮細(xì)胞RCP表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，*:P<0.05(n=3)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的同時(shí)伴隨有CGRP受體成分的變化，具體表現(xiàn)在AngⅡ可上調(diào)HUVECs的CRLR表達(dá)，而下調(diào)HUVECs的RAMP1和RCP表達(dá)，說明AngⅡ?qū)GRP受體成分的影響不同。

已知，CGRP對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用主要通過其受體實(shí)現(xiàn)，CRLR是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體蛋白，其本身不具有生物活性，單獨(dú)轉(zhuǎn)染CRLR基因，則表現(xiàn)為非功能型的受體形式，其主要與CGRP結(jié)合，在RAMP1伴隨下才能介導(dǎo)CGRP的生物學(xué)功能。RCP是CGRP受體的一個(gè)成分蛋白，存在于膜內(nèi)周邊，協(xié)助RAMP1和CRLR信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AngⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和抑制其增殖的同時(shí)，雖然也使CRLR蛋白表達(dá)增加，代償性增強(qiáng)CGRP與CRLR結(jié)合，這與對(duì)血管平滑肌細(xì)胞一致[6]，但AngⅡ同時(shí)也使內(nèi)皮細(xì)胞RAMP1和RCP表達(dá)降低，使CRLR的分布和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到障礙。故在AngⅡ過量刺激下，CGRP的受體功能會(huì)受到影響，推測(cè)受體成分發(fā)生重構(gòu)是影響CGRP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要原因。本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明CGRP和AngⅡ的相互作用不僅僅在細(xì)胞漿的酶水平，如ERK1/2，P38MAPK等水平[7-8]，也存在與細(xì)胞受體或信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)水平,這與在血管平滑肌細(xì)胞相似[6,9]。有研究表明，RCP不僅是CGRP受體的主要成分，可能也參與了其他活性肽的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),如ADM，Amylin[10-11]，其機(jī)制是RCP是參與了CRLR/RAMP信號(hào)傳遞作用[12]，另外，也有研究證明在小鼠RAMP1可能還參與了抗原誘導(dǎo)的呼吸道敏感性[13]。總之，不僅僅是AngⅡ,其他病理刺激也可能通過影響CGRP受體重構(gòu)，導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生發(fā)展，這些證據(jù)還需進(jìn)一步研究。

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DifferenceofExpressionofCGRPReceptorComponentsRegulatedbyAngiotensinⅡinHumanUmbilicalVeinEndothelialCells

WU Yuan,PENG Hongyan,ZHU Yi,et al

(ClinicalLaboratoryoftheSecondAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of angiotensin Ⅱ on the expression of calcitonin gene related peptide (CGRP) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).MethodsHUVECs was employed as the experimental object，cells were incubated by free serum for 24 h for synchronous cell cycle,then,Ang Ⅱ group cells were incubated with different concentration of angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ),the control cells were incubated by free Ang Ⅱ.The cell proliferation and apoptosis were observed by flow cytometry.Western blot was used to determine the expressions of calcitonin receptor like receptor (CRLR),receptor activity modifying protein-1 (RAMP1) and receptor component protein (RCP).Results

Compared with the control group,in the treated cells,Ang Ⅱ inhibited the HUVECs proliferation and induced cell apoptosis,and also up-regulated the CRLR expression of HUVECs (P<0.01) as well.In addition to the other two receptor proteins,Ang Ⅱ (0.01～100 nmol/L)down regulated expression of RAMP1 and RCP expression (P<0.05)in a dose-dependent manner.ConclusionAng Ⅱ can affect the expression of CGRP receptor in HUVECs,which can cause the functional changes of CGRP receptor in the cells.

angiotensin Ⅱ; calcitonin gen related-peptide receptor; human umbilical vein endothelial cell

R972

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.004

2015-10-29；

2015-12-28

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81173060，81500041).

*通訊作者，E-mail:qinxp333@hotmail.com.

#:同為第一作者.

蔣湘蓮)