免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測新生乳鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)與Ihh表達的實驗研究

邵翔++陳后煌++陳達++馬玉環(huán)++鄭文偉++葉蕻芝++李西海

【摘 要】目的：探討顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)育的分子生物學(xué)機制。方法：選取5只BAL B/C新生乳鼠，取頭，常規(guī)固定、脫鈣、脫水、包埋，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測顳下頜關(guān)節(jié)CollagenⅡ（ColⅡ）、CollagenⅠ（ColⅠ）、Aggrecan和印度豪豬蛋白（Ihh）的表達。結(jié)果：顳下頜關(guān)節(jié)盤中，ColⅠ和ColⅡ表達陽性，Ihh表達強陽性，Aggrecan未見明顯表達；髁狀突軟骨中，ColⅡ表達陽性，Aggrecan表達強陽性，Ihh和ColⅠ少量表達。結(jié)論：ColⅡ、ColⅠ、Aggrecan和Ihh正常表達，在顳下頜關(guān)節(jié)形成與發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。

【關(guān)鍵詞】 顳下頜關(guān)節(jié)；軟骨基質(zhì)；免疫組織化學(xué)技術(shù)；印度豪豬蛋白；小鼠

Experimental Study on the Temporomandibular Joint Cartilage Matrix and the Expression of Ihh in Newborn Rats by Immunohistochemical Technique

SHAO Xiang，CHEN Hou-huang，CHEN Da，MA Yu-huan，ZHENG Wen-wei，YE Hong-zhi，LI Xi-hai

【ABSTRACT】Objective：To investigate the molecular mechanism of the development of temporomandibular

joint.Methods：Heads of five BAL B/C newlyborn rats were taken，fixed，decalcified，dehydrated and embedded.Immunohistochemical technique was used to detect the expressions of CollagenⅡ（ColⅡ），CollagenⅠ

（ColⅠ），Aggrecan and Ihh.Results：In the temporomandibular joint disk，the expressions of ColⅠ and ColⅡ

were positive，the expression of Ihh was strongly positive and Aggrecan had no obvious expression；while in condylar cartilage，the expression of ColⅡ was positive，the expression of Aggrecan was strongly positive，and Ihh and ColⅠ had a little expression.Conclusion：ColⅡ，ColⅠ，Aggrecan and Ihh have normal expressions，playing an important role in the formation and development of the temporomandibular joint.

【Keywords】 temporomandibular joint；cartilage matrix；Immunohistochemical technique；Ihh；mouse

顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）由下頜骨的下頜頭關(guān)節(jié)面、顳骨的下頜窩和關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)關(guān)節(jié)面、關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)腔，以及將關(guān)節(jié)腔分為上、下兩部分的關(guān)節(jié)盤組成[1]，多種因素參與影響顳下頜關(guān)節(jié)的生長發(fā)育[2-3]，了解顳下頜關(guān)節(jié)的生長發(fā)育過程，對深入研究頜面部畸形的發(fā)病機制有著重要的臨床意義。小鼠的顳下頜關(guān)節(jié)基本結(jié)構(gòu)與人相似，但下頜骨升支端有髁狀突、喙突與角突，其中只有髁狀突參與構(gòu)成顳下頜關(guān)節(jié)。目前，顳下頜關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)和功能已有系統(tǒng)的描述，但其發(fā)育相關(guān)的分子生物學(xué)機制有待深入研究[4-5]。因此，本研究以新生乳鼠顳下頜關(guān)節(jié)為研究對象，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察小鼠發(fā)育過程中顳下頜關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)與印度豪豬蛋白（Ihh）的表達變化，為揭示顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)育機制提供新的

途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BAL B/C新生乳鼠5只，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司購買雌性孕鼠生產(chǎn)，動物合格證號：SCXK（滬）字第2012-0002號。實驗室室溫恒定（22±1）℃，濕度（56±5）%，紫外線定期消毒，自由攝食飲水，給予質(zhì)量分數(shù)為0.3%的鈉飲食。

1.2 試劑和儀器 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH = 7.4，美國Hyclone公司）；Ihh（1∶200；ab39634）、ColⅡ（1∶200；ab53047）、ColⅠ（1∶500；ab34710）和蛋白聚糖（Aggrecan）（1∶500；ab36861）抗體（美國Abcam公司）；枸櫞酸鹽緩沖液（pH = 6.0，美國Sigma公司）；山羊血清，通用型二步法檢測試劑盒（含質(zhì)量分數(shù)為3%的過氧化氫去離子水和多聚辣根酶標記羊抗兔IgG即二抗）以及DAB顯色試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；光學(xué)顯微鏡（德國徠卡公司）；石蠟切片機（德國徠卡公司）；生物組織石蠟包埋機（孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）。

1.3 取 材 空氣栓塞法處死新生乳鼠，立即放入PBS中，取下頭部置于質(zhì)量分數(shù)為4%的多聚甲醛4 ℃ 固定24 h，Kristense液脫鈣1周，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片備用。

1.4 免疫組織化學(xué)技術(shù)染色 室溫下石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，將切片放入

10 mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液（pH = 6.0）的電爐鍋內(nèi)，鍋內(nèi)的水沸騰開始計時20 min，進行抗原修復(fù)，然后自然冷卻到室溫。山羊血清（1∶10）封閉非特異性染色，室溫孵育15 min；然后分別加入一抗ColⅠ（1∶500）、ColⅡ（1∶200）、Aggrecan（1∶500）和Ihh（1∶200），PBS替代一抗作為陰性對照，4 ℃過夜；PBS洗滌后加入二抗（羊抗兔，1∶1000），37 ℃孵育20 min，再按試劑盒的說明書，ABC復(fù)合物處理，DAB顯色，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察顳下頜關(guān)節(jié)免疫組化染色的

形態(tài)。

1.5 陽性細胞判斷標準 顳下頜關(guān)節(jié)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，觀察蛋白的分布、陽性強度和陽性率。按染色強度打分：-為無色，+為淺黃色，++為棕黃色，+++為棕褐色，染色強度需與背景色相對比。

2 結(jié) 果

免疫組化染色結(jié)果定位明確，背景清晰，陽性顆粒清楚。ColⅡ在關(guān)節(jié)盤與髁狀突軟骨中均表達強陽性，Aggrecan特異性表達于髁狀突軟骨中，ColⅠ在關(guān)節(jié)盤中表達陽性但是髁狀突軟骨中僅見少量表達，Ihh在關(guān)節(jié)盤中表達強陽性、髁狀突軟骨表達明顯較少。ColⅡ與Aggrecan的表達位置強弱基本一致，ColⅠ與Ihh的表達位置基本一致。見圖1-圖5。

3 討 論

軟骨基質(zhì)主要由膠原纖維和蛋白多糖構(gòu)成，具有緩解關(guān)節(jié)應(yīng)力，維持關(guān)節(jié)周圍組織拉伸性能的作用。ColⅠ和ColⅡ是顳下頜關(guān)節(jié)中最主要的膠原蛋白，它們通過聚集分子形成關(guān)節(jié)盤、髁狀突以及關(guān)節(jié)窩。Aggrecan是最主要的蛋白多糖，以聚合體的形式存在，被包繞在膠原纖維間基質(zhì)內(nèi)，維持膠質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)充盈且具有高度彈性，也是軟骨形成和骨骼發(fā)育的基本物質(zhì)。蛋白聚糖與透明質(zhì)酸結(jié)合形成復(fù)合物，游離于關(guān)節(jié)液中，形成高度的粘彈性，對關(guān)節(jié)軟骨起著減震和潤滑等機械保護作用[6]。

在正常的生長發(fā)育過程中，髁狀突的生長方式屬于軟骨內(nèi)成骨，軟骨內(nèi)成骨始于增殖層內(nèi)未分化的間充質(zhì)細胞的增殖和分化，促進前體軟骨細胞分化為軟骨細胞，再逐漸成熟分化為前肥大軟骨細胞和肥大軟骨細胞，軟骨基質(zhì)由Ⅱ型膠原轉(zhuǎn)變?yōu)閄型

膠原，之后新生血管長入，肥大軟骨細胞發(fā)生程序性死亡，部分礦化的軟骨逐漸被骨替代。

Ihh是豪豬蛋白家族的一員，在顳下頜關(guān)節(jié)髁狀突的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，與髁狀突生長、軟骨的表型、軟骨祖細胞的功能有關(guān)，同時是關(guān)節(jié)盤和關(guān)節(jié)腔形成的必要條件。胚胎發(fā)育早期，Ihh在顳下頜關(guān)節(jié)髁狀突內(nèi)已經(jīng)有較強表達，Ihh受體及其效應(yīng)基因Gli 1、Gli 2和Gli 3的表達范圍已達髁狀突外層的多形軟骨細胞層和關(guān)節(jié)盤原基。在新生小鼠顳下頜關(guān)節(jié)的軟骨和軟骨膜中，Ihh基因顯著表達[7]，這與本實驗的研究結(jié)果一致。Ihh基因敲除小鼠的髁突組織不能正常生長，結(jié)構(gòu)紊亂，表現(xiàn)為細胞的增殖速率顯著降低，具有增殖和分化功能的間充質(zhì)細胞數(shù)量減少，軟骨細胞的數(shù)量不足以維持髁突軟骨的正常生長。同時，新生小鼠髁狀突軟骨內(nèi)Ihh缺乏的同時伴隨著ColⅠ、ColⅡ和Aggrecan表達改變，最終導(dǎo)致髁狀突表面纖維軟骨的特性改變[8]。

實驗表明，ColⅡ和Aggrecan同時在髁狀突軟骨中高表達，ColⅠ主要在關(guān)節(jié)盤中表達，關(guān)節(jié)盤主要成分為纖維軟骨，ColⅠ為纖維軟骨所獨有，可能是因為在顳下頜關(guān)節(jié)形成和發(fā)育過程中，ColⅠ

具有維持骨結(jié)構(gòu)的完整及骨生物力學(xué)特性，而ColⅡ和Aggrecan則通過構(gòu)成軟骨基質(zhì)，促進軟骨細胞的分化，從而促進軟骨的形成及骨骼發(fā)育。Ihh在新生乳鼠顳下頜關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)盤和髁狀突中均有表達，可能因其在維持關(guān)節(jié)盤骨生物學(xué)特性、促進髁狀突軟骨發(fā)育中均發(fā)揮重要作用。本實驗運用免疫組化染色法檢測了乳鼠發(fā)育期顳下頜關(guān)節(jié)各部位Ihh、ColⅡ、ColⅠ和Aggrecan的表達變化，指標定位準確直觀，且操作簡便，實驗費用低，具有同類實驗其他方法所不具備的優(yōu)勢。

目前，影響顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)育的因素尚未完全探明，如調(diào)控顳下頜關(guān)節(jié)組織間相互關(guān)系的信號分子的類型、關(guān)節(jié)盤形成過程對關(guān)節(jié)窩的影響等。未來的研究中，可以嘗試運用實驗胚胎學(xué)或者使用基因敲除小鼠模型進行研究，進一步闡明顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)育的細胞和分子學(xué)機制。

4 參考文獻

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收稿日期：2016-04-20；修回日期：2016-07-22