一種新型PDE-5抑制劑衍生物的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)鑒定

馬春艷，段 瓊，封淑華

(河北省藥品檢驗(yàn)研究院,河北 石家莊 050011)

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一種新型PDE-5抑制劑衍生物的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)鑒定

馬春艷，段 瓊，封淑華*

(河北省藥品檢驗(yàn)研究院,河北 石家莊 050011)

基于超高效液相色譜電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-DAD-QTOF-MS)技術(shù)檢出某保健酒中非法添加了一種磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制劑衍生物，經(jīng)制備液相色譜分離純化，采用UPLC-DAD-QTOF-MS、核磁共振(NMR)和紅外光譜(IR)技術(shù)對其進(jìn)行了分析和結(jié)構(gòu)鑒定，確定其為一種新型艾地那非衍生物，國內(nèi)外均未見報道。

磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制劑衍生物；UPLC-QTOF-MS；NMR；IR；結(jié)構(gòu)鑒定

磷酸二酯酶-5(PDE-5)抑制劑是一類應(yīng)用廣泛的治療男性勃起功能障礙(ED)類藥物，臨床用藥主要有西地那非、伐地那非和他達(dá)拉非3種。一些不法分子為了謀取暴利，利用人們相信中藥和保健品是純天然無毒副產(chǎn)品、可長期服用的心理，在中成藥和保健食品中非法添加PDE-5抑制劑類化合物，對服用者安全造成嚴(yán)重隱患。國家食品藥品監(jiān)督管理局于2009年頒布了補(bǔ)腎壯陽類中成藥中11種PDE-5抑制劑的檢驗(yàn)方法，然而不法分子為規(guī)避技術(shù)監(jiān)管，新型的PDE-5抑制劑衍生物層出不窮，而檢驗(yàn)方法明顯滯后，在監(jiān)督檢驗(yàn)中極易造成“假陰性”的結(jié)果。

隨著對PDE-5抑制劑衍生物的不斷研究，新發(fā)現(xiàn)的PDE-5抑制劑衍生物[1-6]越來越多。目前已報道的PDE-5類化合物主要是在西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非、紅地那非、艾地那非等化合物的官能團(tuán)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而得到的相應(yīng)衍生物，如硫代西地那非是西地那非嘧啶環(huán)上的氧被硫取代，氨基他達(dá)拉非是他達(dá)拉非吡嗪環(huán)氮上的甲基被氨基取代，N-去乙基伐地那非是伐地那非哌嗪環(huán)氮上的乙基被消去，羥基紅地那非是紅地那非哌嗪環(huán)氮上的乙基被羥基乙基取代，苯丙氧基艾地那非是艾地那非苯環(huán)上的乙氧基被丙氧基取代。結(jié)構(gòu)修飾呈多樣化趨勢，在監(jiān)督檢驗(yàn)中易發(fā)生漏檢現(xiàn)象。筆者團(tuán)隊(duì)采用UPLC-DAD-QTOF-MS技術(shù)，在宣稱具有壯陽作用的某保健酒中發(fā)現(xiàn)一種新型艾地那非類化合物，經(jīng)制備液相色譜分離純化后，進(jìn)行紫外光譜、質(zhì)譜、紅外光譜和核磁共振光譜解析，確認(rèn)為一種新型PDE-5抑制劑衍生物，目前國內(nèi)外均未見報道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AB TripleTOF?5600+高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜(美國AB公司)，島津LC-30A超高效液相色譜儀(日本島津公司);Waters制備液相色譜(美國Waters公司)；AVANCE-600超導(dǎo)核磁共振儀(瑞士布魯克公司)；NICOLET iS 50 FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀(美國Thermofisher公司)；甲醇(色譜純，Merck公司),乙酸(色譜純，F(xiàn)isher公司)，乙酸銨(Sigma公司，純度≥99.99%)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。樣品為購自超市的某保健酒。

1.2 UPLC-DAD-QTOF-MS檢測條件

Shimadzu Shim-pack XR-ODS色譜柱(100 mm×2.0 mm,2.2 μm)，流動相為含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脫程序：0～8 min，27%B；8～18 min，27%～80%B；18～20 min，80%B；20～21 min，80%～27%B；21～25 min，27%B。流速0.3 mL/min；波長掃描范圍200～400 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，掃描方式：一級質(zhì)譜全掃描，掃描范圍為m/z100～1 000；二級質(zhì)譜全掃描，掃描范圍為m/z40～1 000。離子源參數(shù)：霧化氣為高純氮?dú)?，GS1為55 psi，GS2為55 psi，CUR GAS為30 psi，離子源溫度(550 ℃)，電噴霧電壓為5 500 V，去簇電壓為80 V，碰撞能量為24 V。CDS自動校準(zhǔn)(校準(zhǔn)液為AB公司APCI positive calibration solution)。

1.3 制備HPLC條件

SunFire Prep C18OBD制備色譜柱(19 mm ×100 mm,5 μm)；流動相為甲醇-水，流速為10 mL/min，紫外檢測器，波長為230 nm，進(jìn)樣量為200 μL。

1.4 NMR條件

溶劑為氘代氯仿(CDCl3)，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷(TMS)，測試溫度為298.5 K,1H NMR共振頻率為 600 MHz,13C NMR共振頻率為 150 MHz。

1.5 IR條件

溴化鉀壓片，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.6 樣品制備

1.6.1 UPLC-DAD-QTOF-MS 精密吸取保健酒樣品1 mL，置于50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.6.2 制備HPLC 取保健酒適量進(jìn)行旋蒸濃縮，當(dāng)殘留溶劑約為5 mL時過濾進(jìn)樣，收集主成分色譜峰，減壓蒸發(fā)除去溶劑，即得純化物。

1.6.3 NMR 取制備得到的純化物約15 mg，用0.5 mL氘代氯仿溶解至核磁共振測試管中。

1.6.4 IR 取制備得到的純化物約5 mg，與適量KBr混勻，研細(xì)，壓片。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-DAD-QTOF-MS分析

按國家藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件(批準(zhǔn)件編號2009030)及參考文獻(xiàn)[7-15]，建立了UPLC-DAD-QTOF-MS檢測緩解體力疲勞及補(bǔ)腎壯陽類藥物PDE-5 抑制劑數(shù)據(jù)庫，通過特征碎片離子篩查，發(fā)現(xiàn)該保健酒樣品中有一響應(yīng)較高但準(zhǔn)分子離子峰與數(shù)據(jù)庫不匹配的未知峰(見圖1)，其紫外吸收光譜圖與西地那非和艾地那非有一定的相似度。此未知峰的[M+H]+精確分子量為531.274 6，同位素豐度比m/z531∶532∶533∶534=100∶31.59∶14.95∶1.3；其m/z小于300的碎片離子與西地那非及艾地那非基本一致，其中包含有m/z113艾地那非(衍生物)的特征碎片離子，因此綜合未知物的紫外光譜和一級、二級質(zhì)譜信息，推斷該未知物為艾地那非衍生物。

圖1 未知物的圖譜Fig.1 Spectrum of unknown compound

綜合同位素、精確分子量以及碎片離子信息分析，通過Formulafinder軟件，篩查出其分子式為C26H38N6O4S，此化合物的同位素相對豐度比理論值為m/z531∶532∶533∶534=100∶32.49∶10.34∶2.18，實(shí)驗(yàn)值與理論值基本一致，匹配度達(dá)97.1%。該衍生物比艾地那非(C23H32N6O4S)多3個CH2單元，比文獻(xiàn)[3]報道的丙氧基苯基艾地那非Propoxyphenyl aildenafil(C24H34N6O4S) 多2個CH2單元(見圖2)。經(jīng)質(zhì)譜圖比對，發(fā)現(xiàn)該衍生物除本身的準(zhǔn)分子離子峰m/z531([M+H]+峰)外，其它離子碎片與Propoxyphenyl aildenafil基本一致(見表1),由此推測該衍生物是在Propoxyphenyl aildenafil基礎(chǔ)上(結(jié)構(gòu)見圖3)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造。

圖2 艾地那非和propoxyphenyl aildenafil[3]的二級質(zhì)譜圖Fig.2 MS2 spectra of aildenafil and propoxyphenyl aildenafil[3]

圖3 西地那非、艾地那非、propoxyphenyl aildenafil[3]的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structures of sildenafil,aildenafil and propoxyphenyl aildenafil[3]

Table 1 UPLC-QTOF-MS data for sildenafil,aildenafil,propoxyphenyl aildenafil[3]and unknown

NameFormulaExtractionmass(Da)Foundatmass(Da)Error(ppm)MS2SildenafilC22H30N6O4S475212247521220475，311，299，283，254，99AildenafilC23H32N6O4S4892278489228921489，432，377，311，299，283，254，166，113，99Propoxyphenylaildenafil[3]C24H34N6O4S50324355032418-34503，391，325，299，283，113，99UnknownC26H38N6O4S53127485312745-06531，503，391，325，311，299，283，254，166，113，99

2.2 NMR結(jié)構(gòu)解析

2.2.1 氫譜信號峰的解析 由質(zhì)譜分析可知未知物的元素組成為C,H,O,N,S 5種元素，其分子式為C26H38N6O4S。核磁共振譜有一維譜圖(1H NMR,13C NMR,DEPT135,DEPT90)和二維譜圖(1H-1H COSY,HMQC,HMBC)，具體圖譜見圖4。

圖4 未知物的核磁共振圖譜

Fig.4 NMR spectra of unkonwn compounds

13C譜顯示未知物含23個C，結(jié)合DEPT135可知，此化合物含有8個季C,由其分子式為C26H38N6O4S分析，可得出該化合物含有3組對稱C原子；由1H譜可知，δ8.13(s,1H)、δ7.75(d,1H)、δ7.09(d,1H)、δ4.69(q,2H)、δ4.24(s,3H)、δ4.06(t,2H)、δ3.63(d,2H)、δ2.99(m,4H)、δ1.89(m,4H)、δ1.80(m,2H)、δ1.50(t,3H)、δ1.03(m,12H)，共37個氫，含1個活潑氫。氫信號峰的分析見表2。

表2 氫譜信號峰的分析

Table 2 Analysis of1H NMR data

1HNMR(ppm)1H-1HCOSY(ppm)HMQC(ppm)13CDEPT135Structureδ813δ775δ13185CH(15)δ775δ813，δ709δ12993CH(17)δ709δ775δ11264CH(18)δ424-δ385CH3(10)-X1-CH3δ469δ150δ628CH2(a)-X2-CH2CH3δ150δ469δ144CH3(b)δ406δ180δ704CH2(20)-X3-CH2CH2CH3δ180δ406，δ103δ224CH2(21)δ103δ180δ106CH3(22)δ299δ189δ279CH2(11)-CH2CH2CH3δ189δ299，δ103δ225CH2(12)δ103δ180δ141CH3(13)δ362[2]，δ189δ189，δ362δ528CH2(25，29)δ299δ362，δ102δ503CH(26，28)δ103δ299δ193CH3(30，31)

[2]分析認(rèn)為，δ3.62與δ1.89處質(zhì)子數(shù)為4的多重峰，H-H COSY顯示此兩組峰互為強(qiáng)相關(guān)，HMQC譜、碳譜、DEPT譜顯示該峰與亞甲基譜線δ52.8直接相關(guān)，即該碳譜包含兩個亞甲基碳，此兩個亞甲基處于對稱的結(jié)構(gòu)上。其氫譜化學(xué)位移不一致是因?yàn)閬喖谆幱诃h(huán)上的結(jié)構(gòu)位置，直立鍵氫與平伏鍵氫的空間化學(xué)環(huán)境不同使得氫譜上的化學(xué)位移不同，所以歸屬為25和29位亞甲基。

2.2.2 季碳譜信號峰的解析 季碳信號峰的歸屬見表3。

表3 季碳信號峰的分析

Table 3 Analysis of13C NMR data

13CNMR(ppm)HMBC(ppm)13CStructureδ1607δ709(18)，δ406(20)，δ813(15)，δ775(17)C(19)δ1557δ469(a)，δ424(10)C(7)δ1462δ299(11)C(9)δ1444δ299(11)，δ189(12)，δ424(10)C(3)δ1553δ469(a)，δ813(15)，δ709(18)C(5)δ1211δ424(10)C(8)δ1266δ709(18)，δ813(15)，δ775(17)C(14)δ1296δ813(15)，δ775(17)，δ709(18)C(16)

圖5 NMR的解析結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Structure of NMR analysis

綜上分析，此化合物含有兩個結(jié)構(gòu)片段，片段1(結(jié)構(gòu)B)與片段2(結(jié)構(gòu)C)。依據(jù)元素價鍵理論分析，X1與3位C間應(yīng)有一雜原子X6；9位C與5位C間有一雜原子X7相連，如圖5所示結(jié)構(gòu)D，從質(zhì)譜分析可知X1，X6，X7在S，O，N中選擇N原子最為合理。

2.3 IR解析

通過紅外光譜圖可確定此未知物存在的一些官能團(tuán)(見表4)。因此由25位氫δ值為3.62，26位氫δ值為2.99可知，24位所連官能團(tuán)為磺?；黄?中X4應(yīng)為N元素，所連基團(tuán)為N—SO2—R；片段1與片段2通過磺?；噙B；X5為N元素所連活潑氫，因此可確定該未知物的結(jié)構(gòu)，其分子式為C26H38N6O4S。通過與艾地那非的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)此化合物為艾地那非19位上的乙氧基被丙氧基取代，6位N原子上的活潑氫被乙基取代后的衍生物。與Propoxyphenyl aildenatil的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，則此化合物為Propxyphenyl aildenatil 6位N原子上的活動氫被乙基取代后的衍生物。

表4 紅外光譜數(shù)據(jù)分析

Table 4 Analysis of IR data

σ/cm-1VibrationFunctiongroup2961～2874亞甲基、甲基的C—H伸縮振動亞甲基和甲基1457C—H的變形振動亞甲基和甲基1647C‖O伸縮振動酰胺1608C‖N的振動氮雜環(huán)1576，1505苯環(huán)骨架中C‖C振動苯環(huán)1417氮甲基(N—CH3)的振動吸收氮甲基1318酮基的不對稱吸收磺酰基1264不飽和醚鍵(‖C—O—)的振動吸收不飽和醚鍵1163磺?；?RSO2—N—)的振動吸收磺?；?/p>

3 結(jié) 論

本文通過建立的UPLC-DAD-QTOF-MS檢測方法和數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)某保健酒中未知物的二級碎片中有PDE-5抑制劑的特征碎片，其紫外吸收光譜與西地那非、艾地那非相似，且實(shí)驗(yàn)獲得的同位素豐度比與Formulafinder軟件篩查出的分子式(C26H38N6O4S)理論值基本一致，從而確定了分子元素組成。再進(jìn)一步用制備液相色譜進(jìn)行了分離純化，將得到的純化品進(jìn)行NMR和IR分析，最終確定未知物的結(jié)構(gòu)。此未知物是在艾地那非的基礎(chǔ)上進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾：19位上的乙氧基被丙氧基取代，6位N原子上的活潑氫被乙基取代，此未知物為一種新型艾地那非衍生物，國內(nèi)外均未見報道。此種結(jié)構(gòu)修飾的PDE-5抑制劑是非法添加的新趨勢，應(yīng)引起足夠的重視。

近年來，不法分子為逃避監(jiān)管，采用高科技造假，檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)不斷檢出新型PDE-5抑制劑，綜合分析近年來PDE-5抑制劑衍生物的種類，常見在O和N上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，通常為短鏈的甲基、乙基、丙基取代，因此當(dāng)準(zhǔn)分子離子峰不同，但二級碎片中出現(xiàn)PDE-5抑制劑的基本母核的特征碎片時，應(yīng)給予特別的關(guān)注。

致謝：衷心感謝本院郭永輝博士以及石藥集團(tuán)中奇制藥有限公司對本實(shí)驗(yàn)提供的幫助。

參考文獻(xiàn)：

[1] Wang M L，Zeng L，Yan H F，Li Y J，Dai H.J.Instrum.Anal.(王美玲，曾樂，顏鴻飛，李擁軍，戴華．分析測試學(xué)報)，2014，33(3)：239-247.

[2] Qiu Z W，Ye R H，Liu Y L,Sun Y F，Chen Y，Li Z Q，Pan W L.J.Instrum.Anal.(仇鎮(zhèn)武，葉汝漢，柳亞玲，孫一峰，陳泳，李正全，潘文龍．分析測試學(xué)報),2013，32(4)：488-493.

[3] Kee C L，Ge X W，Koh H L，Low M Y.J.Pharm.Biomed.Anal.，2012，70：265-272.

[4] Qiu Y J，Zou Y H.Chin.J.Mod.Appl.Pharm.(裘一婧，鄒耀華.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)),2015,32(8):1000-1004.[5] Sun J，Yu H，Hu Q，F(xiàn)eng R，Zhang S，Ji S.ActaPharm.Sin.(孫健,于泓,胡青,馮睿,張甦,季申.藥學(xué)學(xué)報),2014,49(4):513-516.

[6] Deng K P，Luo Z Y，Lei Y.Chin.Pharm.J.(鄧鯤鵬，羅卓雅，雷毅．中國藥學(xué)雜志),2011，46(18)：1441-1444.[7] Lee E S,Lee J H，Han K M，Kim J W，Hwang I S，Cho S，Han S Y，Kim J.J.Pharm.Biomed.Anal.,2013,83:171-178.

[8] Yu H，Hu Q，Zhang S,Sun J，F(xiàn)eng R，Ji S.Chin.Pharm.J.(于泓，胡青，張甦，孫健，馮睿，季申.中國藥學(xué)雜志),2013,48(15):1312-1318.

[9] Patel D N，Li L，Kee C L,Ge X W,Low M Y，Koh H L.J.Pharm.Biomed.Anal.，2014，87：176-190.

[10] Li R，Chen G B.Chin.J.Pharm.Anal.(李銳，陳國彪.藥物分析雜志)，2014，34(5)：879-884.

[11] Gao Q，Zhang Z，Guo H Z，Dai H，Che B Q，Wang Z B.Chin.Pharm.J.(高青，張喆，郭洪祝，戴紅，車寶泉，王志斌．中國藥學(xué)雜志),2008，43(1)：142-146.

[12] Xu Y J，Xu G P，Wei Y A.J.Instrum.Anal.(徐遠(yuǎn)金,許桂蘋,魏遠(yuǎn)安.分析測試學(xué)報),2006，25(2)：35-38.[13] Xing J，Sun L，Zhong D F.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(邢杰，孫璐，鐘大放.質(zhì)譜學(xué)報),2002，23(1)：1-6.[14] Shi Y，Wei F，Zhu X P，Xiong J，Ma S C，Lin R C.Chin.J.Pharm.Anal.(石巖，魏鋒，朱曉鵬，熊婧，馬雙成，林瑞超.藥物分析雜志),2014，34(1)：121-129.

[15] Wu S，Wang H，Zhu H G，Zhao Y，Tian Q Q，Sun W J，Ding L，Chen B.Chin.J.Anal.Chem.(吳雙，王華，朱慧果，趙勇，田清青，孫文劍，丁力，陳波.分析化學(xué)),2012，40(7)：1081-1085.

Discovery and Structure Identification of a New Phosphodiesterase-5 Inhibitor Derivative

MA Chun-yan,DUAN Qiong,FENG Shu-hua*

(Hebei Institute for Drug Control,Shijiazhuang 050011,China)

One suspected phosphodiesterase-5 inhibitor(PDE-5) derivative was found in a kind of medicinal liquor by UPLC-DAD-QTOF-MS.Sample purification was carried out by a preparative HPLC system，and its structure was determined by NMR,IR and UPLC-DAD-QTOF-MS methods.The results showed that the compound is a new aildenafil derivative which has never been reported at home and abroad.

PDE-5 inhibitor analogue;UPLC-QTOF-MS;NMR;IR;structure identification

2015-11-26；

2015-12-17

河北省食品藥品監(jiān)督管理局重點(diǎn)科技項(xiàng)目(ZD2014006)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.009

O657.65；TQ460.72

A

1004-4957(2016)05-0551-06

*通訊作者：封淑華，碩士，主任藥師，研究方向：保健食品和藥物分析，Tel：0311-89892090，E-mail：shuhua08@sina.com