氣相色譜-飛行時間質譜快速鑒定和定量測定煙草中43種農藥

司曉喜，朱瑞芝，劉志華，馬雪英，朱 麗，張鳳梅，劉春波，陸舍銘*

(1.云南省煙草化學重點實驗室 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231；2.云南中煙物資(集團)有限責任公司，云南 昆明 650031)

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氣相色譜-飛行時間質譜快速鑒定和定量測定煙草中43種農藥

司曉喜1，朱瑞芝1，劉志華1，馬雪英1，朱 麗2，張鳳梅1，劉春波1，陸舍銘1*

(1.云南省煙草化學重點實驗室 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231；2.云南中煙物資(集團)有限責任公司，云南 昆明 650031)

建立了煙草中43種農藥的氣相色譜-飛行時間質譜(GC-TOF MS)分析方法。采用改進的QuEChERS前處理方法，樣品以丙酮-正己烷(1∶1)進行萃取，萃取液經(jīng)N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑分散固相萃取凈化后，用GC-NCI-TOF MS進行檢測。通過高分辨飛行時間質譜的精確質量數(shù)測定，建立了農藥的特征離子數(shù)據(jù)庫，結合目標物保留時間、碎片離子的豐度比、裂解規(guī)律、同位素離子峰簇等進行目標物定性鑒定。配制基質匹配標準曲線，以磷酸三苯酯(TPP)為內標進行定量測定。43種農藥的線性相關系數(shù)(r2)均不小于0.993，相對標準偏差不大于9.6%，定量下限為1.3 ～5.0 μg/kg；在3個水平下的加標回收率為76.4%～96.6%。該方法簡單快速，準確性和靈敏度高，滿足煙草中多農藥殘留的定性和定量檢測要求。

煙草；農藥；QuEChERS；電子轟擊電離；氣相色譜；飛行時間質譜

為了綜合防治煙草生長過程中多種病蟲害，往往需要使用殺蟲劑、殺菌劑等多類農藥，加之農藥不合理使用的現(xiàn)象時有發(fā)生，容易導致多種農藥殘留，危害人體健康和污染環(huán)境[1-2]。GB 2763-2014規(guī)定了食品中387種農藥的最大殘留限量，國際煙草科學研究合作中心(CORESTA)2003 年首次提出煙草中農用化學品指導性殘留限量(GRLs)，2013年更新至第三版，涉及 120 種農藥，均對煙葉中農藥殘留作出嚴格規(guī)定。隨著農藥限量數(shù)目的增多和限量值的日益嚴格，開發(fā)高選擇性、高靈敏度的農藥檢測技術，已成為各國煙草質量控制中的重要內容[3]。

氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)是多農殘分析的一種主要方法，相比氣相色譜法該法能提供化合物的質譜信息，增加定性的準確性[4]。目前大多采用四極桿[5]、離子阱質譜[6]作為質量分析器，分辨率較低。高分辨飛行時間質譜(TOF MS)可實現(xiàn)精確質量數(shù)的測定，具有快速、分辨率高、全掃描下靈敏度高等優(yōu)點[7]，可對復雜基質中的化合物進行定性和定量分析，目前GC-TOF MS分析技術已應用于葡萄[8]、桃子[9]、谷物[10]等樣品中農藥殘留的分析。TOF MS 可將化合物的精確質量數(shù)與保留時間、同位素強度、同位素分布等信息結合，從而實現(xiàn)農藥的快速篩查，提高痕量物質鑒定的準確性[9,11]。在質譜測定時為減小基質造成的干擾，要求樣品前處理過程有嚴格的凈化步驟，一般需要液液萃取、固相萃取、凝膠滲透色譜等步驟的凈化，操作繁瑣，有機溶劑用量大[12]。QuEChERS前處理方法簡單、快速且回收率高，已被廣泛用于果蔬等基質的前處理[12-13]。

本文選擇可能殘留于煙草中的農藥為目標物，結合QuEChERS法在復雜樣品前處理中簡便快速、凈化效果好的優(yōu)勢，以及氣相色譜-飛行時間質譜法快速、選擇性高、定性準確的特點，建立了一種快速、準確的GC-TOF MS方法快速篩查和定量測定煙草中的43種農藥。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 實驗儀器 氣相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用儀GCT Premier(Waters公司，美國)，配備MassLynx 4.0工作站和NIST 5.0質譜數(shù)據(jù)庫；VX-200旋渦混合儀(Labnet公司，美國)；樣品定量濃縮儀(Buchi 公司，瑞士)；BT224S電子天平(感量：0.000 1 g，賽多利斯科學儀器有限公司，德國)；Milli-Q超純水器(Millipore公司，美國)；3K30高速冷凍離心機(Sigma公司，德國)。

1.1.2 試劑與材料 丙酮、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯(色譜純，Merck公司，德國)；43種農藥標準品(純度≥99%，Dr.Ehrenstorfer公司，德國)；磷酸三苯酯(標準品，純度≥99%，Dr.Ehrenstorfer公司，德國)；SampliQ QuEChERS EN萃取試劑盒，內含4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉(Agilent公司，美國)；QuEChERS 2 mL分散固相萃取試劑盒，內含150 mg無水硫酸鎂、50 mg N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑(Agilent公司，美國)；煙葉樣品產自云南、貴州、廣西。

1.2 實驗方法

1.2.1 提 取 制備煙末(40目)，稱取約2 g煙末樣品(精確至0.000 1 g)，置于50 mL 具蓋離心管中，加入20 μL 10 mg/L的磷酸三苯酯內標溶液和10 mL水，振蕩至樣品被水充分浸潤后靜置10 min。準確移取10 mL丙酮-正己烷(1∶1)溶液至離心管中，并置于旋渦混合振蕩儀上以2 000 r/min振蕩2 min。將離心管在冰箱冷凍室(-18 ℃)中冷凍10 min后，加入試劑包(4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉)，立即于旋渦混合儀上以2 000 r/min振蕩2 min，然后以6 000 r/min離心5 min。將提取液轉移至定量濃縮儀中，于35 ℃下濃縮至1 mL。

1.2.2 凈 化 將上述提取液轉移至含有50 mg PSA和150 mg無水硫酸鎂的離心管中，于旋渦混合儀上以2 000 r/min振蕩2 min，然后以6 000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾，待進樣。

1.2.3 分析條件 氣相色譜條件：色譜柱：DB-35ms毛細管柱(30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.)；進樣口溫度：220 ℃；載氣：氦氣，純度≥99.999%，恒流流速：1 mL/min；進樣量：1 μL；不分流進樣：1 min；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持1 min，以25 ℃/min 升至180 ℃，以2 ℃/min升至210 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃保持5 min。

質譜條件：離子源：EI+；電子能量：70 eV；離子源溫度：220 ℃；發(fā)射電流：40 μA；傳輸線溫度：250 ℃；溶劑延遲：8 min；采集方式：總離子流色譜圖(TIC)；掃描范圍：m/z50～600。質譜將全氟三丁胺(PFPBA)作為內標進行調諧，以m/z218.985 6作為鎖定離子校正分析物碎片的精確質量數(shù)。表1列出了43種農藥和內標物的保留時間及GC-TOF MS監(jiān)測的特征離子。

表1 43種農藥的保留時間及特征離子(m/z)

Table 1 Retention times and characteristic ions(m/z) of 43 pesticides

NoCompoundRetentiontime(min)CharacteristicionsMeasured(m/z)Predicted(m/z)Error(ppm)Elementalcomposition1Trifluralin(氟樂靈)93530607023060692320C11H11N3O4F32Benfluralin(氟草胺)94629205452920548-096C10H9N3O4F33Propoxur(殘殺威)105315208381520838-013C9H12O24Demeton?S?methyl(甲基內吸磷)1083880347880346125C4H8S5Hexachlorobenzene(六氯苯)116728381022838109-264C635Cl537Cl6Tefluthrin(七氟菊酯)117019703451970348-142C8H9F335Cl7α?BHC(α?六六六)120918293491829351-098C6H435Cl337Cl38Diazinon(二嗪磷)128130410113041011010C12H21N2O3PS9Atrazine(莠去津)130620007032000704-035C7H11N535Cl10Clomazone(異草酮)131712501581250160-136C7H635Cl11Dichloran(氯硝銨)134920596502059656-301C6H4N2O235Cl212γ?HCH(Lindane)(林丹)137618093791809377094C6H435Cl313Dimethoate(樂果)140912498261249824184C2H6O2PS14β?HCH(β?六六六)151418293491829352-153C6H435Cl237Cl15Pirimicarb(抗蚜威)157316609811660979108C8H12N3O16Metolachlor(異丙甲草胺)161118810761881074106C12H14NO17Chlorpyrifos?methyl(甲基毒死蜱)164728592612859263-056C7H7NO3PS35Cl218δ?HCH(δ?六六六)166218293491829352-153C6H435Cl237Cl19Chlorothalonil(百菌清)169226587862658789-117C8N235Cl337Cl20Pirimiphos?methyl(甲基嘧啶磷)173929007292900728028C10H17N3O3PS21Metalaxyl(甲霜靈)174120611822061174374C12H16NO222Metolachlor(異丙甲草胺)181016212841621281154C11H16N23Dacthal(氯酞酸甲酯)184830088073008808-043C9H3O335Cl337Cl24Chlorpyrifos(毒死蜱)186231395753139582-236C9H11NO3PS35Cl225Fenitrothion(殺螟硫磷)188027701742770163401C9H12NO5PS26Isopropalin(異丙樂靈)189628012982801288353C13H18N3O427Methiocarb(甲硫威)191215303751530382-490C8H9OS28Fenthion(倍硫磷)199927802012780192317C10H15O3PS229Bromophos(溴硫磷)201933087833308768465C8H8O3PS35Cl81Br30Pendimethalin(二甲戊靈)208425209852520974424C11H14N3O431Penconazole(戊菌唑)215624809552480960-198C13H15N335Cl32Diphenamid(雙苯酰草胺)219716708611670867-341C13H1133trans?Chlordane(反?氯丹)221437282603728259021C10H635Cl637Cl34cis?Chlordane(順?氯丹)225437282603728260-005C10H635Cl637Cl35Tetrachlorvinphos(殺蟲畏)231910900551090055-028C2H6O3P36Chinomethionate(滅螨猛)234320599732059975-117C9H6N2S237Napropamide(敵草胺)2354720814720811375C4H10N38Isoprothiolane(稻瘟靈)243511799111179909186C4H6S239p，?DDT(p，?滴滴涕)245223500822350083-055C13H935Cl240o，?DDT(o，?滴滴涕)252723500822350086-183C13H935Cl241Bifenthrin(聯(lián)苯菊酯)255818110181811023-282C14H1342Cyhalothrin(氯氟氰菊酯)269218106541810662-453C13H9O43Mirex(滅蟻靈)275727181022718103-055C535Cl537ClInternalstandardTriphenylphosphate(磷酸三苯酯)261332607093260708015C18H15O4P

圖1 不同溶劑對43種農藥萃取率的箱線圖Fig.1 Box-plot graph of extraction yields of 43 pesticides by different extraction solventsA.acetone-n-hexane,B.dichloromethane-n-hexane,C.EtOAc-n-hexane

2 結果與討論

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 萃取條件的優(yōu)化 采用經(jīng)典的QuEChERS方法萃取樣品中的農藥，并對萃取溶劑進行優(yōu)化。QuEChERS方法常以乙腈作為萃取溶劑，但其對脂溶性較強的農藥萃取率偏低[14]，且以其作為溶劑在氣相色譜-質譜檢測時，農藥響應偏低，需要溶劑置換步驟，操作繁瑣，易造成目標物損失[15]。根據(jù)相似相溶原理，選擇使用最多、效果最好的3種萃取溶劑(丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯)進行考察，并加入正己烷，以增加萃取溶劑的鹽析能力并減少雜質的溶出[14]。采用加標的陽性樣品進行試驗，以43種農藥的萃取率為指標，不同溶劑對43種農藥萃取率的分布情況見圖1。由圖1可見，丙酮-正己烷和乙酸乙酯-正己烷兩種混合溶劑對43種農藥的萃取效率普遍高于二氯甲烷-正己烷，且丙酮-正己烷略優(yōu)于乙酸乙酯-正己烷。圖中異常值代表乙酸乙酯-正己烷對百菌清的萃取率，其萃取率較低(67.8%)。綜上分析，選擇丙酮-正己烷作為萃取溶劑。

2.1.2 凈化條件的優(yōu)化 煙葉樣品萃取液中含有大量的色素、脂肪等基體組分，比較了QuEChERS方法采用的分散固相萃取(d-SPE)和常用的固相萃取(SPE)對43種農藥的凈化效果。d-SPE考察了以N-丙基乙二胺(PSA)、C18以及PSA為吸附劑的凈化效果，SPE考察了弗羅里硅土(Florisil)萃取小柱和硅膠(Silica gel)萃取小柱的凈化效果。結果顯示，d-SPE以PSA為吸附劑時目標物的回收率最高，凈化效果最好。對比該法凈化前后的萃取液，發(fā)現(xiàn)凈化后溶液顏色由黃色轉變至接近無色，表明溶液中大部分色素已被去除。加入C18雖可去除部分脂肪，但降低了農藥的回收率[16]。弗羅里硅土小柱對色素等雜質的去除效率也較高，且回收率與d-SPE相當，但操作復雜。因此最終選取凈化方式為d-SPE，吸附劑為PSA。

2.2 測定條件優(yōu)化

在優(yōu)化升溫程序條件下，43種農藥分離良好。由于目標物含量低，適當提高了進樣口溫度，選擇不分流進樣，以增加目標物的響應值。以標準溶液進樣，選取響應高、干擾少的碎片離子作為特征離子，確定的質譜參數(shù)列于表1。圖2為優(yōu)化條件下43種農藥混合標準溶液以及煙草樣品的總離子色譜圖。

圖2 43種農藥標準溶液(A)和典型煙草樣品(B)的總離子色譜圖

Fig.2 Total ion chromatograms of 43 pesticides standard solution(A) and typical tobacco sample(B) the peak numbers denoted are same as those in Table 1

2.3 定性鑒定

TOF MS技術是利用特征離子的精確質量數(shù)進行分析，質量精確度能夠到百萬分之一級，再加以原子組成的限定條件，可確定碎片離子的元素組成進而實現(xiàn)目標物定性[8]。表1列出了各化合物特征離子的精確質量數(shù)，其測定值與理論精確質量相差小于1.54 mDa，誤差小于4.9 ppm，屬于可接受的誤差范圍[9]。通過精確質量數(shù)推測出碎片離子的元素組成(見表1)，可對目標物進行定性鑒定。

圖3 戊菌唑的質譜圖(A)和碎片離子的提取離子流圖(B，C)

Fig.3 MS spectrum(A) and fragment ion chromatograms of penconazole(B and C)

EI條件下大部分化合物均獲得較多的碎片離子，結合化合物結構和裂解原理進行分析，對質譜圖中特征碎片離子識別也能輔助目標物的定性。如戊菌唑易通過C—Cl鍵斷裂失去1個Cl自由基得到碎片離子[C13H15N3Cl]+，此外由于含N雜原子，易發(fā)生α-斷裂產生自由基，重排后產生離子[C7H5Cl2]。圖3A為戊菌唑的質譜圖，主要有兩個碎片離子[C13H15N3Cl]和[C7H5Cl2]，與裂解規(guī)律一致，為戊菌唑的鑒定提供了有效信息。

此外，對于含有多種同位素元素(如Cl或Br)組成的化合物，質譜圖中會出現(xiàn)同位素離子峰簇，借助同位素峰簇輪廓以及同位素離子峰簇內各峰的強度比，可對目標物進行定性分析[17]。如圖3A中[C7H5Cl2]碎片離子主要有C7H535Cl2和C7H535Cl37Cl兩個同位素離子，圖3B為該兩個離子的提取離子流圖，兩個離子的豐度比為100∶32.2，與推測值100∶32.0吻合。而A圖中[C13H15N3Cl]碎片離子主要有C13H15N335Cl和C13H15N337Cl兩個同位素離子，由C圖可得到該兩個離子的豐度比為100∶64.0，與推測值100∶64.0吻合。

綜上分析，依據(jù)所建立的由TOF MS得到的各農藥碎片離子的精確質量數(shù)據(jù)庫，結合保留時間、碎片離子豐度比、碎片離子與裂解原理的相符性識別、含同位素元素化合物的特征同位素離子峰簇等信息,可共同用于農藥的篩查和定性鑒定，提高定性分析的可靠性。

2.4 定量方法評價

氣相色譜-質譜聯(lián)用法的基質效應主要來自氣相色譜部分，以基質增強效應為主。本實驗通過配制基質匹配標準曲線減少基質效應。取空白煙草樣品，按“1.2.1”和“1.2.2”方法處理后，凈化液濃縮至干，分別加入1 mL 含內標的43種農藥混合標準溶液復溶，其中混合標準溶液濃度分別為0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 μg/mL，內標磷酸三苯酯濃度均為0.2 μg/mL。對基質配標系列標準工作溶液進行分析，得到每個農藥目標化合物與內標的峰面積之比(Y)以及濃度之比(X)，并據(jù)此繪制標準曲線。

將空白煙葉樣品處理后測定20次，以空白響應的10倍標準偏差作定量下限；選擇陽性樣品按照上述實驗方法處理后測定，以7次平行樣測定的峰面積計算相對標準偏差(RSD)。線性回歸方程、相關系數(shù)、精密度及定量下限見表2。43種農藥的線性相關系數(shù)(r2)均不小于0.993，RSD不大于9.6%，定量下限為1.3 ～5.0 μg/kg，方法簡單快速，精密度好，靈敏度高。

以空白煙樣基質為本底，分別加入低、中、高3種濃度的混合標準溶液，加標水平為0.01，0.05，0.25 mg/kg。加標樣品靜置過夜，待充分吸收后制成試樣。按優(yōu)化的方法平行實驗3次，得回收率為76.4%～96.6%(見表2)，方法的準確度可以滿足農藥殘留分析的要求。

表2 線性方程、相關系數(shù)、方法的精密度、定量下限及回收率

Table 2 Linear equation,correlation coefficient(r2),precision,limit of quantitation(LOQ) and recovery

NoCompoundLinearequationr2RSD(n=7，%)LOQ(μg/kg)Recovery(n=3，%)001mg/kg005mg/kg025mg/kg1TrifluralinY=0884X-0016099346328688888972BenfluralinY=2243X-0039099955268238258573PropoxurY=0669X-0011099944298358038044Demeton?S?methylY=1137X-0029099983427887928325HexachlorobenzeneY=2116X-0009099939138688848566TefluthrinY=3386X-0023099919159099339147α?BHCY=0819X-0010099939208509159028DiazinonY=0867X-0024099841198158408589AtrazineY=1218X-00190999962277585383410ClomazoneY=2647X-00310999892079683985311DichloranY=0288X-00090999714984887389612γ?HCH(Lindane)Y=0768X-00211000832288585385213DimethoateY=0779X-00240999444887285686414β?HCHY=0588X-00130999192685486691215PirimicarbY=2645X-00510999812983080484716MetolachlorY=0823X-00150998362983485682617Chlorpyrifos?methylY=2030X-00490999712289291195518δ?HCHY=0501X-00011000342890186691919ChlorothalonilY=0958X-00160998292678679681920Pirimiphos?methylY=1148X-00211000402479481683621MetalaxylY=0657X-00170999172882580779722MetolachlorY=2536X-00500999674077881185823DacthalY=2097X-00190999561882284889524ChlorpyrifosY=0673X-01490997592383581784725FenitrothionY=0451X-00170996135086787490126IsopropalinY=1292X-00210999964184383482927MethiocarbY=0587X-00130998474577881783428FenthionY=1291X-00250997392277681680229BromophosY=1791X-00540997252493692893530PendimethalinY=1144X-00290999304685184987131PenconazoleY=1008X-00250999203585083585932DiphenamidY=0700X-00130998451782080183333trans?ChlordaneY=1334X-00240999391583187385334cis?ChlordaneY=1111X-00231000391683287385335TetrachlorvinphosY=0919X-00150999272684084789636ChinomethionateY=0445X-00150998303494095396637NapropamideY=0421X-00060999682576483683438IsoprothiolaneY=0602X-00040999281787188390039p，?DDTY=1399X-00250999791977280882940o，?DDTY=0926X-00160999742379885480641BifenthrinY=2309X-00041000601682884588542CyhalothrinY=0139X-00020999363391993795243MirexY=0916X-000510002819786802827

2.5 實際樣品的測定

采用本文建立的方法對30個煙葉樣品中農藥進行篩查和定量測定，5個樣品中檢出七氟菊酯，含量為0.004～0.008 mg/kg，7個樣品中檢出二甲戊靈，含量為0.007～0.043 mg/kg，6個樣品中檢出聯(lián)苯菊酯，含量為0.005～0.047 mg/kg，其余農藥未檢出。

3 結 論

本文將改進的QuEChERS前處理方法和GC-TOF MS檢測技術結合應用于煙草中43種農藥殘留的定性篩查和定量分析。通過高分辨飛行時間質譜的精確質量數(shù)測定，建立了農藥特征離子數(shù)據(jù)庫，結合目標物保留時間、碎片離子的豐度比、裂解規(guī)律、同位素離子峰簇等實現(xiàn)了目標物的定性篩查。此外，定量方法準確、方法檢出限低等特點使得該法也可用于其他樣品中農藥殘留的檢測分析。

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Rapid Screening and Determination of 43 Pesticide Residues in Tobacco by Gas Chromatography-Time of Flight Mass Spectrometry

SI Xiao-xi1,ZHU Rui-zhi1，LIU Zhi-hua1，MA Xue-ying1，ZHU Li2，ZHANG Feng-mei1,LIU Chun-bo1，LU She-ming1*

(1.R&D Center of China Tobacco Yunnan Industrial Co.,Ltd.,Key Laboratory of Tobacco Chemistry of Yunnan, Kunming 650231,China;2.Yunnan Tobacco Materials(group) Co.,Ltd.,Kunming 650031,China)

A rapid and accurate method was developed for the analysis of 43 pesticide residues in tobacco based on gas chromatography-time of flight mass spectrometry(GC-TOF MS).By modified QuEChERS method,tobacco samples were extracted with acetone-hexane(1∶1),and cleaned up with primary secondary amine(PSA),then detected by GC-TOF MS.Precise mass database of characteristic ions by TOF MS,coupled with retention time,fragment ion abundance ratios,fragmentation patterns of characteristic fragment ions,isotopic peak clusters were employed for the qualitative identification of pesticides.The quantatative method was established using the matrix-matched calibration standards with triphenyl phosphate(TPP) as the internal standard.The results indicated that the linear correlation coefficients(r2) were not less than 0.993 with relative standard deviations(RSD) not more than 9.6%,and quantitation limits of 1.3-5.0 μg/kg.The recoveries of 43 pesticides at three spiked concentration levels ranged from 76.4% to 96.6%.The method is simple,rapid,accurate and sensitive,and is appropriate for the determination of multi-residues in tobacco.

tobacco;pesticide;QuEChERS;electron impact ionization;gas chromatography;TOF MS

2015-11-04；

2015-12-05

云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心科技項目(S-6013047)；紅塔煙草(集團)有限責任公司科技項目(K-10006.14)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.006

O657.63;F767.2

A

1004-4957(2016)05-0532-07

*通訊作者：陸舍銘，博士，工程師，研究方向：煙草化學、產品質量安全，Tel:0871-65869797，E-mail:474629695@qq.com