藍莓休克病毒IC-RT-nested PCR檢測技術

謝麗雪，鄭 姍，張立杰，張小艷，李 韜

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藍莓休克病毒IC-RT-nested PCR檢測技術

謝麗雪，鄭 姍，張立杰，張小艷，李 韜

（福建省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，福州350013）

【目的】藍莓休克病毒（，BlShV）是藍莓上主要病毒之一，侵染藍莓后能夠?qū)ζ洚a(chǎn)量造成嚴重影響。研究旨在建立用于BlShV快速檢測的IC-RT-nested PCR技術，為該病毒的檢測鑒定提供可靠的技術手段?！痉椒ā扛鶕?jù)GenBank已報道的BlShV基因序列，設計一對外側(cè)引物（BlShV-F/BlShV-R）和一對內(nèi)側(cè)引物（BlShV-1/BlShV-2），以感染BlShV的藍莓病葉為材料，利用免疫IC-RT-PCR（免疫捕獲RT-PCR）和nested PCR（巢式PCR）建立BlShV的IC-RT-nested PCR檢測技術；分別以BlShV、藍莓焦枯病毒（，BlScV）、藍莓帶化病毒（，BSSV）、藍莓葉斑駁病毒（，BLMoV）、煙草環(huán)斑病毒（，TRSV）、番茄環(huán)斑病毒（，ToRSV）和健康藍莓葉片為對象，測定該檢測技術的特異性；將BlShV第1輪、第2輪PCR產(chǎn)物分別回收純化后連接到pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5后篩選陽性克隆，進行測序和序列比對驗證該檢測技術的準確性；將感染BlShV的藍莓病葉提取液用健康藍莓葉片提取液進行10倍梯度稀釋，測定該檢測技術的靈敏度，并與DAS-ELISA方法相比較；利用建立的IC-RT-nested PCR對收集的中國福建、吉林、遼寧地區(qū)藍莓葉片樣品（53份）和進境美國藍莓葉片（15份）進行實際檢測，并對上述樣品采用普通RT-PCR方法進行驗證?！窘Y(jié)果】建立的IC-RT-nested PCR方法成功從感染BlShV病葉提取液第1輪PCR擴增出約746 bp大小的目的片段，第2輪PCR擴增出約486 bp大小的目的片段，未從健康藍莓葉片提取液和空白對照擴增出目的片段；特異性測定結(jié)果表明，IC-RT-nested PCR具有良好的特異性，僅從感染BlShV藍莓病葉提取液第1輪、第2輪PCR分別擴增到目的片段，而從BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康藍莓葉片提取液第1輪、第2輪均未擴增到相應的目的片段；序列分析結(jié)果顯示，感染BlShV藍莓病葉提取液第1輪、第2輪PCR產(chǎn)物的序列同預期大小完全一致，分別為746、486 bp，將獲得的兩輪PCR產(chǎn)物序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的BlShV基因序列進行比對，結(jié)果顯示第1輪、第2輪PCR產(chǎn)物的序列與已報道的BlShV核苷酸序列一致性均達99%，證實兩輪PCR產(chǎn)物均為BlShV特異性產(chǎn)物，進一步驗證了擴增結(jié)果的準確性；靈敏度測定結(jié)果表明，IC-RT-nested PCR的第1輪PCR能夠檢測到稀釋102倍的BlShV病葉提取液，靈敏度與DAS-ELISA相當，經(jīng)過第2輪PCR，靈敏度提高100倍，能夠檢測到稀釋104倍的BlShV病葉提取液；藍莓樣品IC-RT-nested PCR測定結(jié)果顯示，2份來自于美國的藍莓葉片樣品擴增出大小約486 bp的目的片段，BlShV檢出率為13.3%，而中國福建、吉林、遼寧地區(qū)藍莓葉片樣品上均未擴增出相應的目的片段，未檢測到BlShV，該檢測結(jié)果與普通RT-PCR驗證結(jié)果完全相符，表明建立的IC-RT-nested PCR能夠用于藍莓樣品的實際檢測?！窘Y(jié)論】建立的IC-RT-nested PCR具有快速、特異、準確和靈敏的優(yōu)點，適合于田間和進出境口岸藍莓樣品上BlShV的檢測鑒定。

藍莓休克病毒；IC-RT-nested PCR；檢測

0 引言

【研究意義】藍莓（spp.）為杜鵑花科越桔屬（）多年生灌木，原產(chǎn)于北美，在北美、歐洲、南美和亞洲等地均有種植，其中美國和加拿大為主要生產(chǎn)國，約占世界藍莓總產(chǎn)量的80%[1]。藍莓被喻為世界第3代水果，具有抗氧化、抗癌、明目等功效，已被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一，其果實在鮮食、加工或作為高級化妝品原料等方面具有廣闊的市場前景和較高的經(jīng)濟價值[2-3]。病毒病是藍莓生產(chǎn)上的一種重要病害，對藍莓的產(chǎn)量和品質(zhì)能夠造成不同程度的影響。藍莓休克病毒（，BlShV）是侵染藍莓的主要病毒之一，該病毒屬于雀麥花葉病毒科（）、等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬（）成員，最早在美國被發(fā)現(xiàn)[4]。BlShV能夠侵染絕大多數(shù)藍莓品種，引起的典型癥狀為開花期時花和葉片突然完全壞死，造成的產(chǎn)量損失可達34%—90%[5-6]。由于BlShV引起的藍莓休克病至今尚無有效防治藥劑，采用無毒苗是預防該病毒發(fā)生的關鍵，因此加強該病毒檢測技術的研究，建立特異性強、準確性好、靈敏度高的快速檢測技術具有重要意義。【前人研究進展】目前，用于BlShV檢測的主要方法包括血清學ELISA和分子生物學RT-PCR技術。應用商品化的ELISA試劑盒檢測BlShV，具有操作簡便、特異性好、樣品檢測量大的優(yōu)點。Spak等[7-8]利用ELISA檢測試劑盒，分別對捷克、塞爾維亞藍莓上的BlShV、藍莓焦枯病毒（，BlScV）、藍莓帶化病毒（，BSSV）等多種病毒的發(fā)生情況進行了調(diào)查。Sedegui等[9]建立了一種能用于藍莓葉片上BlShV檢測的高通量ELISA方法，其特異性、靈敏度與標準ELISA方法相當或更高。由于靈敏度的限制，ELISA方法可能無法準確檢測含量較低的病毒，容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。相對于ELISA方法，利用RT-PCR檢測BlShV具有時間快、靈敏度高和特異性強的突出優(yōu)點，該技術已成功用于BlShV的檢測。筆者前期根據(jù)BlShV外殼蛋白基因序列設計一對特異性引物，建立了以RNA為模板的普通RT-PCR檢測方法[10]。因RNA提取步驟較多，不僅操作過程RNA易出現(xiàn)污染，而且操作者需要接觸有毒試劑，所以在實際檢測中仍有一定的不足。在RT-PCR基礎上改進的IC-RT-PCR技術，無需提取RNA作為模板，該技術直接以抗體特異性捕捉病毒粒體，在簡化操作、避免接觸有毒試劑的同時減少了污染，近年來在病毒檢測中應用越來越廣泛。代歡歡等[11]以帶有鳶尾黃斑病毒（，IYSV）的煙草葉片為材料，建立了IYSV的IC-RT-PCR檢測技術，靈敏度是普通RT-PCR的4倍、DAS-ELISA的100倍以上。Kumar等[12]通過對病毒提取液和RNA釋放條件的優(yōu)化，建立了用于葡萄卷葉伴隨病毒-3（3，GLRaV-3）快速檢測的IC-RT-PCR技術。Viswanathan等[13]利用能夠捕捉甘蔗線條花葉病毒（，SCSMV）和甘蔗花葉病毒（，SCMV）的重組抗體，建立了同時檢測兩種病毒的雙重IC-RT-PCR方法，其靈敏度高于ELISA。Nested PCR是根據(jù)已報道的病毒基因序列，設計外側(cè)、內(nèi)側(cè)兩套引物，先以外側(cè)引物進行第1輪擴增，再以擴增產(chǎn)物為模板，利用內(nèi)側(cè)引物進行第2輪擴增，該技術與普通RT-PCR相比，特異性更強、靈敏度更高。周彥等[14]針對柑橘黃化脈明病毒（，CYVCV）核酸結(jié)合蛋白基因的保守序列設計兩對特異性引物，通過優(yōu)化退火溫度，建立了CYVCV巢式RT-PCR檢測方法，靈敏度較RT-PCR提高100倍。Adkar-Purushothama等[15]根據(jù)柑橘衰退病毒（，CTV）外殼蛋白CP基因序列，設計特異性巢式PCR引物，建立了CTV特異、靈敏的RT-Nested PCR檢測技術，用于顯癥和無癥植株上CTV的快速檢測，檢測效果與熒光定量RT-PCR相當。Lee等[16]通過特異性引物設計和篩選，建立了桃叢簇花葉病毒（，PRMV）RT- nested PCR檢測方法?！颈狙芯壳腥朦c】IC-RT-nested PCR是一種將IC-RT-PCR與nested PCR相結(jié)合的病毒檢測技術，能夠進一步提高檢測的特異性和靈敏度。關于應用該技術檢測BlShV，到目前為止尚未見相關研究報道?！緮M解決的關鍵問題】以BlShV為研究對象，藍莓葉片提取液為材料，設計兩對特異性引物，通過病毒抗體免疫捕捉病毒粒體和RT-nested PCR，建立BlShV的IC-RT-nested PCR分子檢測技術，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和進出境口岸對藍莓上BlShV的檢測、監(jiān)測提供有效的技術手段。

1 材料與方法

試驗于2014年10月至2016年3月在福建省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所完成。

1.1 材料

供試藍莓休克病毒（BlShV）、藍莓焦枯病毒（BlScV）、藍莓帶化病毒（BSSV）、藍莓葉斑駁病毒（，BLMoV）、煙草環(huán)斑病毒（，TRSV）、番茄環(huán)斑病毒（，ToRSV）毒源由筆者實驗室保存；藍莓樣品為中國福建、吉林、遼寧地區(qū)藍莓葉片和進境美國藍莓葉片；BlShV抗體、酶標抗體購自Adgen公司；TrizoL試劑購自Invitrogen公司；RT試劑、PCR mix購自Promega公司；pMD-18T載體購自寶生物（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA Marker、膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank已公布的BlShV運動蛋白基因（movement protein，MP）與外殼蛋白（coat protein，CP）的間隔區(qū)及CP基因部分區(qū)域序列，設計兩對特異引物：BlShV-F（外側(cè)正向引物）/BlShV-R（外側(cè)反向引物）、BlShV-1（內(nèi)側(cè)正向引物）/BlShV-2（內(nèi)側(cè)反向引物），引物序列見表1。引物委托上海生物工程技術服務有限公司合成。

表1 引物序列

1.3 樣品提取液的制備

稱取藍莓葉片0.3 g，加入3 mL樣品提取緩沖液（磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，內(nèi)含2% PVP，0.2%卵清蛋白，0.05%吐溫20），研磨后4℃下8 000 r/min 離心10 min，取上清液作為樣品提取液。以健康藍莓葉片采用上述方法制備的提取液作為陰性對照。

1.4 DAS-ELISA

BlShV抗體用包被緩沖液（pH 9.6）稀釋后，在酶標板中每孔加入100 μL，室溫放置4 h或4℃下包被過夜；倒去酶標板中包被抗體溶液，PBST洗3次；在酶標板中每孔加入100 μL樣品提取液，室溫放置2 h或4℃下包被過夜；倒去酶標板中樣品提取液，PBST洗3次；BlShV酶標抗體用酶標抗體緩沖液稀釋后，在酶標板中每孔加入100 μL，室溫放置2 h；倒去酶標板中酶標抗體溶液，PBST洗3次；在酶標板中每孔加入100 μL新配制的硝基苯磷酸二鈉鹽（pNPP）底物溶液。室溫下避光放置，至陽性對照孔明顯顯色，用酶標儀測定405 nm下的OD值，若樣品OD405 nm/陰性對照OD405 nm≥2，判為陽性；樣品OD405 nm/陰性對照OD405 nm＜2，判為陰性。試驗以健康藍莓葉片提取液作為陰性對照、感染BlShV病葉提取液作為陽性對照，重復2次。

1.5 普通RT-PCR

1.5.1 RNA提取 取樣品提取液250 μL，加入1 mL TrizoL試劑，室溫劇烈振蕩后靜置5 min；加入氯仿300 μL，充分顛倒混勻30 s，室溫下靜置5 min，4℃下12 000 r/min離心15 min，小心吸取上層水相；加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置15 min，4℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清；沉淀用1 mL 75%冷乙醇洗滌，4℃下7 500 r/min離心3 min，棄上清，重復2次；沉淀充分干燥后用20 μL DEPC-H2O溶解沉淀。

1.5.2 RT-PCR 取3 μL RNA，加入外側(cè)反向引物BlShV-R 1 μL、ddH2O 7 μL，70℃水浴10 min后迅速冰浴5 min，再加入5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μL、dNTPs（10 mmol·L-1）2 μL、RNasin（40 U·μL-1）1 μL、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U·μL-1）1 μL。經(jīng)42℃ 1 h、70℃ 10 min合成cDNA。PCR采用25 μL反應體系：外側(cè)正向引物BlShV-F（10 μmol·L-1）1 μL，外側(cè)反向引物BlShV-R（10 μmol·L-1）1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，cDNA模板3 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s、51℃ 45 s、72℃ 1 min，35個循環(huán)，最后一輪循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.6 IC-RT-nested PCR

1.6.1 免疫捕獲病毒粒子 將100 μL用包被緩沖液稀釋200倍的BlShV抗體加入PCR管中，37℃孵育2 h；倒去抗體溶液，PBST洗3次，再加入100 μL用于DAS-ELISA檢測的樣品提取液，4℃包被過夜。

1.6.2 反轉(zhuǎn)錄 倒去PCR管中樣品提取液，先后用PBST洗3次、DEPC-H2O洗2次，在PCR管中進行反轉(zhuǎn)錄。先向PCR管中加入外側(cè)反向引物BlShV-R（10 μmol·L-1）1 μL、ddH2O 10 μL，70℃水浴10 min后立即冰浴5 min，再加入下列試劑：5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 μL，dNTPs（10 mmol·L-1）2 μL，RNasin（40 U·μL-1）1 μL、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U·μL-1）1 μL。經(jīng)42℃ 1 h、70℃ 10 min合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 第1輪PCR擴增 以合成的cDNA為模板，進行第1輪PCR擴增。PCR反應體系：外側(cè)正向引物BlShV-F（10 μmol·L-1）1 μL，外側(cè)反向引物BlShV-R（10 μmol·L-1）1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR反應條件同1.5.2。

1.6.4 第2輪PCR擴增 取第1輪PCR產(chǎn)物0.5 μL作為模板，進行第2輪PCR擴增。PCR反應體系：內(nèi)側(cè)正向引物BlShV-1（10 μmol·L-1）1 μL，內(nèi)側(cè)反向引物BlShV-2（10 μmol·L-1）1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)，最后一輪循環(huán)后72℃延伸10 min。

1.7 IC-RT-nested PCR特異性測定

分別以BlShV、BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康藍莓的葉片提取液為材料，進行IC-RT-nested PCR，測定特異性。

1.8 IC-RT-nested PCR靈敏度測定

將感染BlShV藍莓病葉提取液用健康藍莓葉片提取液進行10倍梯度稀釋，依次稀釋101、102、103、104、105和106倍，以健康藍莓葉片提取液作為陰性對照，進行IC-RT-nested PCR和DAS-ELISA，測定靈敏度。

1.9 PCR產(chǎn)物的克隆和測序

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒回收后，連接到pMD18- T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，然后涂布含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，篩選陽性克隆，送上海生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.10 藍莓樣品的IC-RT-nested PCR檢測

應用IC-RT-nested PCR技術對收集的中國福建、吉林、遼寧地區(qū)藍莓葉片樣品和進境美國藍莓葉片樣品進行實際檢測，同時利用普通RT-PCR方法進行測定。

2 結(jié)果

2.1 IC-RT-nested PCR擴增

設計的兩對特異性引物對，外側(cè)引物對（BlShV- F/BlShV-R）預期擴增片段大小為746 bp，內(nèi)側(cè)引物對（BlShV-1/BlShV-2）預期擴增片段大小為486 bp。利用藍莓葉片提取液進行IC-RT-nested PCR，結(jié)果從感染BlShV病葉提取液中第1輪PCR擴增出約746 bp大小的目的片段，第2輪PCR擴增出約486 bp大小的目的片段，而健康藍莓葉片提取液和空白對照經(jīng)兩輪PCR，未擴增出相應的目的片段（圖1）。

M：DNA分子量標準（100 bp） DNA Marker (100 bp)；1、4：BlShV樣品 BlShV sample；2、5：陰性對照 Negative control；3、6：空白對照 Blank control

2.2 IC-RT-nested PCR特異性測定

應用建立的IC-RT-nested PCR方法分別對BlShV、BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV和健康藍莓葉片提取液進行檢測，結(jié)果除BlShV第1輪、第2輪PCR擴增出特異性目的片段外，其余BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV及健康藍莓葉片兩輪PCR均未擴增出目的片段（圖2），表明建立的IC-RT-nested PCR方法具有很強的特異性。

M：DNA分子量標準（100 bp） DNA Marker (100 bp)；1：BlShV樣品BlShV sample；2：BlScV樣品BlScV sample；3：BSSV樣品BSSV sample；4：BLMoV樣品BLMoV sample；5：TRSV樣品TRSV sample；6：ToRSV樣品ToRSV sample；7：陰性對照Negative control

2.3 PCR產(chǎn)物序列分析

將IC-RT-nested PCR獲得的BlShV第1輪、第2輪PCR產(chǎn)物分別回收純化后，進行克隆測序。序列測定結(jié)果表明，BlShV的第1輪、第2輪PCR產(chǎn)物的序列全長為746、486 bp，與預先設計的片段大小完全相同。Blast比對發(fā)現(xiàn)，兩輪PCR產(chǎn)物的序列與GenBank已報道的BlShV病毒基因序列高度一致，一致性達99%。序列測定結(jié)果表明，擴增到的目的片段為BlShV特異性產(chǎn)物，進一步驗證了IC-RT-nested PCR擴增結(jié)果的準確性。

2.4 IC-RT-nested PCR靈敏度測定

將感染BlShV病葉提取液用健康藍莓葉片提取液按10倍梯度稀釋后，分別進行IC-RT-nested PCR和DAS-ELISA，比較兩種方法的靈敏度。測定結(jié)果表明，IC-RT-nested PCR靈敏度較高，第1輪PCR能夠檢測到稀釋102倍的BlShV病葉提取液，經(jīng)nested PCR，靈敏度提高100倍，能夠檢測到稀釋104倍的BlShV病葉提取液（圖3）；DAS-ELISA靈敏度與IC-RT-nested PCR的第1輪PCR相當，為稀釋102倍的BlShV病葉提取液，當BlShV病葉提取液稀釋103倍以及更高倍數(shù)時，P/N值都＜2（表2）。

2.5 不同來源藍莓樣品檢測

應用建立的IC-RT-nested PCR對中國福建、吉林、遼寧省藍莓樣品和進境美國藍莓樣品進行檢測，結(jié)果從進境美國藍莓2份疑似帶毒樣品上擴增出大小約486 bp的目的片段（圖4），BlShV檢出率為13.3%，而從53份中國福建、吉林、遼寧省藍莓樣品上未擴增出目的片段（表3），該結(jié)果與普通RT-PCR的驗證結(jié)果完全相符，表明IC-RT-nested PCR能夠有效用于田間及進出境樣品上BlShV的檢測。

表2 DAS-ELISA檢測靈敏度

P/N：樣品OD405 nm/陰性對照OD405 nmOD405 nmof sample/OD405 nmof negative control；+：陽性positive；-：陰性negative

A：第1輪PCR The first round PCR；B：第2輪PCR The second round PCR。M：DNA分子量標準（100 bp） DNA Marker (100 bp)； 1：BlShV提取液（100）Crude extract of BlShV (100)；2：101稀釋101 dilution；3：102稀釋102 dilution；4：103稀釋103 dilution；5：104稀釋104 dilution；6：105稀釋105 dilution；7：106稀釋106 dilution；8：陰性對照Negative control

M：DNA分子量標準（100 bp）DNA Marker (100 bp)；1—15：藍莓樣品Blueberry sample；16：陰性對照Negative control

表3 不同地區(qū)藍莓樣品上BlShV的IC-RT-nested PCR、普通RT-PCR檢測

3 討論

藍莓休克病毒（BlShV）是危害藍莓生產(chǎn)安全的一種重要病毒，發(fā)生嚴重時對藍莓產(chǎn)量造成較大的損失。鑒于BlShV的危害性，加強該病毒檢測技術的研究，建立快速、準確、靈敏的檢測方法，提高早期病毒檢出率，對于藍莓無毒苗的篩選和最大程度地預防該病毒的發(fā)生有著重要意義。BlShV侵染藍莓后引起的癥狀與藍莓上另一種病毒藍莓焦枯病毒（BlScV）極其相似，單從癥狀上難以區(qū)分，BlShV曾被誤認為BlScV[17]。近年來，關于BlShV檢測技術的研究較少，已報道的檢測技術主要為血清學ELISA和普通RT-PCR兩種。利用ELISA檢測存在靈敏度低，易造成漏檢的問題，而RT-PCR檢測需要相對較為繁雜的RNA提取步驟，且對操作人員的技術要求較高，因此生產(chǎn)上有必要建立一種靈敏度高、操作簡便的BlShV檢測技術，以滿足常規(guī)檢測的需求。本研究以藍莓葉片提取液為材料，利用IC-RT-PCR和Nested PCR技術，建立了用于BlShV快速檢測的IC-RT-nested PCR分子檢測技術，該技術首先以病毒抗體特異性吸附病毒粒體，再進行反轉(zhuǎn)錄和巢式PCR，能夠?qū)lShV進行有效檢測。

應用IC-RT-PCR檢測植物病毒的突出優(yōu)點在于省去了RNA提取步驟，可以避免因某些植物組織成分的影響造成無法提取高質(zhì)量的RNA。此外，還可以去除樣品中PCR抑制因子，有利于植株體內(nèi)低濃度病毒的檢測[18]。本研究利用BlShV抗體在PCR管中免疫捕捉病毒粒體后，以設計的特異性外側(cè)引物對（BlShV-F/BlShV-R）進行IC-RT-PCR，結(jié)果證實該方法能夠從BlShV成功擴增出大小約746 bp的特異性目的片段。方法的特異性對于病毒的檢測至關重要，直接影響到檢測結(jié)果的準確性。本研究根據(jù)BlShV基因序列設計的引物具有較好的特異性，第1輪PCR外側(cè)引物對、第2輪PCR內(nèi)側(cè)引物對，結(jié)果都僅從BlShV擴增出特異性目的片段，未從其他5種藍莓RNA病毒（BlScV、BSSV、BLMoV、TRSV、ToRSV）和健康藍莓葉片上擴增出目的片段。實際上，因內(nèi)側(cè)引物對的擴增片段位于外側(cè)引物對的擴增片段內(nèi)部，非特異性目的片段同時包含兩對引物結(jié)合位點的可能性極小，因此內(nèi)、外側(cè)兩對引物組成的巢式引物，大大提高了檢測方法的特異性。除巢式引物的特異性外，BlShV抗體對病毒粒體的特異吸附可能也有助于進一步提高檢測的特異性。在病毒的分子檢測中，通常需要對PCR產(chǎn)物進行測序驗證，以明確PCR產(chǎn)物是否為特異性產(chǎn)物。本研究針對第1輪PCR（IC-RT-PCR）產(chǎn)物及第2輪PCR（巢式PCR）產(chǎn)物分別進行了克隆測序，序列結(jié)果證實兩輪PCR產(chǎn)物都為BlShV特異性產(chǎn)物，大小分別與預期完全相符，并且與已報道的BlShV序列高度一致，一致性均達99%。

除特異性外，靈敏度是病毒檢測方法的另一項重要評價指標。在病毒侵染寄主早期，寄主體內(nèi)的病毒含量往往很低，因此建立的檢測方法靈敏度必須達到一定的水平，才能準確檢測到病毒的存在。前人研究表明，IC-RT-PCR的靈敏度比常規(guī)血清學ELISA具有更高的靈敏度[19-20]。Wu等[21]利用制備的水稻矮縮病毒（，RDV）單克隆抗體，建立了PTA-ELISA、dot-ELISA和IC-RT-PCR檢測方法，靈敏度測定結(jié)果表明IC-RT-PCR的靈敏度最高，在檢測水稻組織內(nèi)RDV時分別是PTA-ELISA、dot-ELISA的8倍和64倍；聞偉剛等[22]報道，IC-RT-PCR檢測齒蘭環(huán)斑病毒（，ORSV）的靈敏度比DAS-ELISA高10倍，檢測建蘭花葉病毒（，CyMV）的靈敏度比TAS-ELISA高100倍。但在本研究中，IC-RT-PCR（第1輪PCR）的靈敏度僅與DAS-ELISA相同，為稀釋102倍BlShV病葉提取液，當稀釋倍數(shù)達103倍或更高時，兩種方法均無法檢測到BlShV。Nested PCR能夠顯著提高檢測方法的靈敏度，可比普通RT-PCR方法高100倍以上，如宋震等[23]在柑橘碎葉病毒（，CTLV）一步法RT-PCR檢測體系基礎上建立的巢式RT-PCR檢測方法，靈敏度比一步法RT-PCR至少提高100倍，檢測模板總核酸最低濃度約1.27 μg·L-1；Morris等[24]建立的甜菜壞死黃脈病毒（，BNYVV）巢式RT-PCR，檢測靈敏度比普通RT-PCR高103倍；聞偉剛等[25]報道的煙草環(huán)斑病毒（TRSV）和番茄環(huán)斑病毒（ToRSV）半巢式RT-PCR檢測法也比普通RT-PCR提高103倍以上。本研究為提高IC-RT-PCR方法的檢測靈敏度，在外側(cè)引物對擴增區(qū)域內(nèi)設計一對內(nèi)側(cè)引物，通過反應條件和程序優(yōu)化，建立了IC-RT-nested PCR。經(jīng)nested PCR，IC-RT-PCR的靈敏度提高了100倍，即通過第2輪PCR，靈敏度達到稀釋104倍BlShV病葉提取液，這與前人報道的結(jié)果相吻合。

本研究建立的IC-RT-nested PCR快速檢測技術具有較好的特異性和靈敏度，利用該技術對來自不同國家和地區(qū)的68份藍莓葉片樣品進行BlShV檢測，檢出的陽性樣品及數(shù)量與普通RT-PCR方法驗證的結(jié)果完全一致，表明該體系在實際檢測應用中具有很強的可行性。然而，與普通RT-PCR檢測相比，IC-RT-nested PCR雖然簡化了操作步驟，但整個檢測時間相對較長，特別是抗原需要包被較長時間才能進行RT-nested PCR，因此，在后期檢測應用中，抗原的包被時間以及病毒粒體釋放條件仍需進一步優(yōu)化，以縮短檢測時間，進一步提高檢測效率。

4 結(jié)論

針對藍莓上的藍莓休克病毒（BlShV），建立了IC-RT-nested PCR快速檢測技術。該技術特異性強、準確性好、靈敏度高，在藍莓生產(chǎn)和進出境口岸上對BlShV的檢測具有較好的應用價值，尤其是對低濃度病毒藍莓樣品的檢測鑒定。

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（責任編輯 岳梅）

Development ofIC-RT-nested PCR for the Detection of

XIE Li-xue, ZHENG Shan, ZHANG Li-jie, ZHANG Xiao-yan, LI Tao

(Fruit Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013)

【Objective】(BlShV) is one of the major viruses infecting blueberry, which can cause serious impacts on the yield of blueberry. In order to provide a reliable technique for rapid detection and identification of BlShV, IC-RT-nested PCR assay was developed.【Method】 A primer set containing outer primers (BlShV-F/BlShV-R) and inner primers (BlShV-1/BlShV-2) was designed according to the reported BlShV gene sequences, and IC-RT-nested PCR assay was established by combining immunocapture reverse transcriptase polymerase chain reaction and nested PCR with BlShV infected leaf as material. The specificity of the IC-RT-nested PCR was determined by testing extracts of leaf tissues from BlShV,(BlScV),(BSSV),(BLMoV),(TRSV),(ToRSV)and healthy blueberry leaf. PCR products were purified, and then ligated to pMD18-T vector. After transformed intoDH5, positive clones were screened and sequenced to further confirm the validation of the IC-RT-nested PCR assay. To test the sensitivity of the IC-RT-nested PCR, serial ten-fold dilution of the extracts prepared from BlShV-infected blueberry leaves was made by addition of corresponding amount of healthy plant extracts. The solutions were subsequently subjected to the IC-RT-nested PCR assay and DAS-ELISA, respectively. A total of 68 samples of blueberry from different regions (53 samples from Fujian, Jilin and Liaoning regions in China and 15 samples from America) were collected and detected for the presence of BlShV with the established IC-RT-nested PCR, and the result was validated by conventional RT-PCR. 【Result】The established IC-RT-nested PCR amplified fragment of about 746 and 486 bp only from BlShV infected leaf extract by the first and second round PCR, respectively. No target fragment was observed from healthy blueberry leaves extract and blank control. The IC-RT-nested PCR assay showed a good specificity to BlShV with the expected 746 and 486 bp fragments for the first and second round PCR, respectively. No cross-reaction was observed from BlScV, BSSV, BLMoV, TRSV, ToRSV and healthy blueberry leaves. Sequence analysis showed that the sequences of the first and second round PCR product (746 and 486 bp, respectively) was identical with the expected size, and shared an extremely high homology (99%) with the previously published BlShV gene sequence. The results of sequence analysis confirmed that the two PCR products were BlShV specific products, and further verified the accuracy of amplification results. Sensitivity assay showed that the first round of IC-RT-nested PCR could successfully detect BlShV from leave extracts diluted up to 102, which was as sensitive as DAS-ELISA. After the second round PCR, the sensitivity of IC-RT-nested PCR was increased by 100 times, with a limit of 104dilution of BlShV infected leaf extract.Field sample test revealed that the target fragment (about 486 bp) was amplified from two blueberry leaf samples from America by IC-RT-nested PCR, and the detection rate was 13.3%. However, no corresponding target fragment was amplified from samples from Fujian, Jilin, Liaoning regions of China. The result of field sample test was in accord with the results of conventional RT-PCR. 【Conclusion】The established IC-RT-nested PCR is a rapid, specific, accurate and sensitive method for the detection and identification of BlShV on blueberry samples from field and port of entry-exit.

(BlShV);IC-RT-nested PCR; detection

2016-08-08；接受日期：2016-09-22

國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201410076）、福建省公益類科研院所專項（2015R1014-5，2014R1014-15）、福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程項目（2014S1477-22）

謝麗雪，E-mail：xielx_faas@126.com。通信作者李韜，Tel：0591-87573907；E-mail：leetao06@163.com