灰飛虱鞘氨醇激酶時空表達(dá)分析及其對殺蟲劑脅迫的響應(yīng)

焦文娟，李飛強，張敏菁，史肖肖，朱木菲，毛存貴，祝增榮

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灰飛虱鞘氨醇激酶時空表達(dá)分析及其對殺蟲劑脅迫的響應(yīng)

焦文娟1，李飛強1，張敏菁1，史肖肖1，朱木菲1，毛存貴2，祝增榮1

（1浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所/水稻生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)昆蟲學(xué)重點實驗室，中國杭州 310058；2Department of Medicine，Stony Brook University，Stony Brook，NY，USA）

【目的】明確灰飛虱（Fallén）鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SK）的分子特征，研究SK在攜帶水稻條紋病毒（，RSV）與健康灰飛虱兩個種群的時空表達(dá)及其對殺蟲劑脅迫的響應(yīng)?！痉椒ā坷肞CR技術(shù)克隆灰飛虱SK（）基因序列；使用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析在帶毒種群與健康種群灰飛虱1—5齡若蟲及成蟲期的表達(dá)差異，并檢測該基因在雌雄蟲頭、唾液腺、中腸、馬氏管、卵巢和精巢等組織中相對表達(dá)量；采用手動微量點滴儀將3種殺蟲劑（吡蟲啉、噻嗪酮和溴氰菊酯）點滴于灰飛虱4齡若蟲中胸背板，確定3種殺蟲劑的半致死濃度（LC50）；根據(jù)半致死濃度的3種殺蟲劑處理試蟲后檢測的表達(dá)動態(tài)；采用注射雙鏈RNA（dsRNA）的方法沉默帶毒種群和健康種群4齡若蟲體內(nèi)后，用半致死濃度的3種殺蟲劑處理試蟲并分析死亡率。【結(jié)果】克隆得到一段長度為1 282 bp的基因片段（GenBank登錄號：KT989975）。氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示LsSK與其他半翅目昆蟲SK聚在同一支。LsSK氨基酸序列包含SK酶的4個保守區(qū)域C1—C4，其中SK激酶的活性位點——DAG活性區(qū)域位于C1—C3區(qū)域。qRT-PCR結(jié)果顯示在帶毒種群4齡若蟲中表達(dá)量最高，3齡次之；健康種群5齡若蟲表達(dá)量最高，1、4齡次之。且在帶毒種群3、4齡表達(dá)量顯著高于健康種群同時期若蟲（＜0.05）；帶毒成蟲表達(dá)量顯著高于健康成蟲（＜0.05）。在帶毒雄成蟲各個組織中的表達(dá)量均顯著高于同種群雌成蟲和健康雌雄成蟲的各相應(yīng)組織，且在唾液腺和馬氏管的表達(dá)量最高，頭部次之。用半致死濃度的3種殺蟲劑（吡蟲啉LC50為6.5 ng·μL-1，噻嗪酮為500 ng·μL-1，溴氰菊酯為37.5 ng·μL-1）處理帶毒和健康種群的4齡若蟲后，試蟲含量變化與響應(yīng)速度均不同。噻嗪酮處理后水平升高且響應(yīng)最為迅速，溴氰菊酯處理后表達(dá)水平無變化（＞0.05）。用3種殺蟲劑處理帶毒和健康試蟲，其死亡率分析結(jié)果表明，兩種群注射dsSK組3種殺蟲劑處理后死亡率均顯著高于兩種群注射dsGFP組和不注射組。【結(jié)論】克隆了基因片段且其在帶毒灰飛虱4齡若蟲中表達(dá)量最高。沉默后，帶毒和健康種群灰飛虱在殺蟲劑處理后的死亡率均顯著上升，表明SK基因有利于灰飛虱抵抗殺蟲劑脅迫。

鞘脂質(zhì)；鞘氨醇激酶；灰飛虱；RNA干擾；熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】鞘脂質(zhì)是生物膜的重要成分，它可維持細(xì)胞膜的流動性并穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)[1]。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine 1 phosphate，S1P）是一類具有生物功能的鞘脂質(zhì)，其在細(xì)胞死亡途徑（凋亡、壞死、自噬）、癌細(xì)胞增生、遷移、炎癥和抗藥性中都發(fā)揮重要作用[2]。S1P的合成需要一個關(guān)鍵的鞘脂質(zhì)代謝酶——鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SK）參與。雖有研究表明SK可參與細(xì)胞抗藥性、病毒傳播與復(fù)制[3-4]，但SK的相關(guān)研究均在人體細(xì)胞或哺乳動物中進(jìn)行，昆蟲中還未見報道。以重要水稻害蟲灰飛虱（Fallén）為研究對象，探究SK在攜帶水稻條紋病毒（，RSV）種群和健康種群灰飛虱不同發(fā)育時期和不同組織的表達(dá)特征，及殺蟲劑脅迫后表達(dá)水平的變化，對后續(xù)深入研究SK與灰飛虱RSV病毒傳播的關(guān)系以及開發(fā)灰飛虱的新型防治技術(shù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】SK/S1P信號途徑可保護(hù)癌癥細(xì)胞免除藥物引發(fā)的細(xì)胞死亡，表明SK和S1P可調(diào)控細(xì)胞抗藥性。在PC3癌癥細(xì)胞中，上調(diào)SK含量可增加細(xì)胞對喜樹堿的抗性，而抑制SK表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞對該藥物敏感[5]。大量研究表明，在慢性白細(xì)胞病CML細(xì)胞中過表達(dá)SK后，神經(jīng)酰胺/S1P的動態(tài)平衡改變，使得S1P含量增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞對藥物產(chǎn)生抗性[6]。Schnitzer等[4]也闡述了SK在A549肺癌細(xì)胞中的抗藥作用。A549細(xì)胞在低氧條件下可誘導(dǎo)SK表達(dá)，從而導(dǎo)致S1P分泌，激活MAPK代謝途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡。在HCT116癌細(xì)胞中，SK也表現(xiàn)出對丁酸鈉誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抗性[7]。此外，SK和S1P也參與病毒的傳播和復(fù)制。在人體感染巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus）和上呼吸道合胞體病毒（respiratory syncytial virus）后，SK酶活顯著提升，且過表達(dá)SK可增強人流感病毒（influenza virus）的傳播[3]。相反，在感染牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus）和登革熱病毒（dengue virus）后，該酶的活性反而下降[8]。Monick等[9]研究表明，細(xì)胞感染上呼吸道合胞體病毒后，SK含量上升，胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-related kinase，ERK）和蛋白激酶（Akt）兩條途徑被激活，使得細(xì)胞存活時間和存活率都顯著增加。SK與病毒傳播間的關(guān)系在人體及哺乳動物細(xì)胞中已有大量研究，但在昆蟲及其病毒傳播體系中關(guān)于SK的研究還很缺乏?；绎w虱是東亞重要水稻害蟲之一，也是RSV及小麥、玉米多種禾谷類作物病毒病的重要傳播媒介[10-12]，且其傳毒對水稻的危害遠(yuǎn)大于直接刺吸造成的危害[12]。目前防治灰飛虱的主要方法是噴施化學(xué)殺蟲劑[13-14]，但化學(xué)殺蟲劑的不合理使用，造成灰飛虱對常用的殺蟲劑均產(chǎn)生了不同程度的抗性。盡管已有大量研究報道了灰飛虱的化學(xué)殺蟲劑抗藥性機制[15]，但鞘脂類代謝與殺蟲劑抗性之間的關(guān)系卻未有涉及。參考SK與人體細(xì)胞抗藥性的相關(guān)研究，SK不僅可以通過控制S1P含量而影響細(xì)胞程序性死亡，還能影響與S1P受體相關(guān)的鈉離子通道等信號途徑[16-17]，因此SK可能影響昆蟲對殺蟲劑的敏感性。而且，根據(jù)Zhou等[18]研究，殺蟲劑處理灰飛虱若蟲后，SK的上游代謝酶中性神經(jīng)酰胺酶的活性顯著升高。【本研究切入點】目前，有關(guān)SK生物特性及其與病毒傳播、抗藥性關(guān)系的研究均在人體或哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行，而昆蟲SK的相關(guān)研究卻尚未有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對灰飛虱鞘氨醇激酶進(jìn)行克隆和序列分析，利用qRT-PCR技術(shù)確定該基因在帶毒和健康種群灰飛虱的時空表達(dá)特征，以及不同殺蟲劑處理后表達(dá)水平的變化，通過RNA干擾技術(shù)沉默帶毒種群和健康種群灰飛虱的該基因后，觀察兩個灰飛虱種群在殺蟲劑處理后死亡率變化，進(jìn)一步探索功能。

1 材料與方法

試驗于2015年6月至2016年3月在浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所完成。

1.1 供試材料

帶毒種群和健康種群灰飛虱由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所周益軍教授實驗室提供，帶毒種群置于燒杯中小范圍飼養(yǎng)。帶毒種群與健康種群的培養(yǎng)條件均為溫度26℃，相對濕度70%，光周期L﹕D=16 h﹕8 h，所用水稻為秀水品系。帶毒灰飛虱種群擴張后，設(shè)計針對RSV特有基因——coat protein（CP）的引物，用反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測，確定健康種群灰飛虱不帶毒。定期檢測帶毒群帶毒率，通過純化帶毒種群[19]，維持帶毒率在90%左右。

1.2 RNA提取與第一鏈cDNA合成

取5頭灰飛虱成蟲，參照trizol（Invitrogen，USA）說明書提取總RNA，使用NanoDrop 2000微量分光光度計測定RNA質(zhì)量與濃度。以1 μg總RNA為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）合成第一鏈cDNA。

1.3 基因克隆

以模式昆蟲SK基因為模板，搜索此前公開的灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[20]，獲得一條基因序列，并設(shè)計引物克隆驗證。所用引物均用Primer Premier 5.0設(shè)計（表1）。以1.2中的第一鏈cDNA為模板參照ExTaq 酶（Takara）說明書進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化并測序驗證。

表1 本試驗所用引物

1.4 殺蟲劑處理

將吡蟲啉（imidacloprid）、噻嗪酮（buprofezin）和溴氰菊酯（deltamethrin）3種殺蟲劑（浙江新農(nóng)化工有限公司，純度均≥95%）用丙酮配制成儲存液，逐級稀釋成5個濃度后點滴灰飛虱4齡若蟲。參見半致死濃度（LC50）計算方法[21]，計算得出吡蟲啉LC50為6.5 ng·μL-1，噻嗪酮為500 ng·μL-1，溴氰菊酯為37.5 ng·μL-1。用手動微量點滴儀（Hamilton）將0.1 μL的3種殺蟲劑點滴于灰飛虱4齡若蟲中胸背板，每種殺蟲劑點滴50頭，試驗設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。24 h后觀察死亡情況并統(tǒng)計死亡率。收集帶毒種群與健康種群灰飛虱4齡若蟲各300頭，CO2麻醉（約30 s）后，用半致死劑量（LD50）的3種殺蟲劑處理，每頭試蟲劑量為0.1 μL。分別于處理后1、4、8、12、24和48 h隨機選擇帶毒試蟲與健康試蟲各10頭，提取總RNA，用于檢測表達(dá)水平的變化。試驗設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.5 熒光定量PCR

使用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)檢測的相對表達(dá)水平。供試樣本包括帶毒和健康灰飛虱的1—5齡若蟲和雌雄成蟲，以及雌雄成蟲的不同組織（頭部、唾液腺、中腸、馬氏管、精巢和卵巢）。參照qRT-PCR試劑盒（TransStart Top Green qPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司）說明書設(shè)置反應(yīng)體系：10 ng模板cDNA，10 μL 2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix，上下游引物各0.4 μL，用無核酸酶的水將反應(yīng)體系補足至20 μL。反應(yīng)條件：94℃，30 s，1個循環(huán)；94℃，5 s，60℃，30 s，40個循環(huán)。試驗設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，內(nèi)參基因為。所用引物見表1。

1.6 RNA干擾

設(shè)計一對基因特異性引物（引物5′端添加T7 RNA聚合酶的啟動子序列，表1），以1.2中的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物回收后，作為合成雙鏈RNA（dsRNA）的模板。參考Xu等[22]的步驟，使用MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit試劑盒（Ambion，USA）合成dsRNA。將合成的dsRNA稀釋至2 mg·mL-1后，置于-80℃存儲待用。RNA干擾試驗所用儀器為TransferMan NK2顯微操作系統(tǒng)，試蟲為蛻皮48 h的3齡若蟲，注射部位為前胸與中胸之間，注射量為每試蟲200 ng[23]。采用注射綠色熒光蛋白（GFP）dsRNA的試蟲作為對照。將注射后的試蟲置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為了確定dsRNA注射后的基因干擾水平，選取SK dsRNA（簡寫為dsSK）和對照組GFP dsRNA（簡寫為dsGFP）注射48 h后的試蟲各5頭用于檢測干擾效率。試驗設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。為避免注射引起機械損傷而導(dǎo)致的死亡，將試蟲在注射試驗后恢復(fù)48 h，再以半致死濃度的3種殺蟲劑處理存活的試蟲，點滴量為0.1 μL。殺蟲劑處理24 h后，記錄帶毒種群與健康種群灰飛虱的死亡率。每種殺蟲劑處理均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)試蟲為90頭。

1.7 數(shù)據(jù)分析

LsSK氨基酸序列采用Clustal Omega在線序列比對；使用MEGA6軟件以鄰近法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹。熒光定量結(jié)果用2-ΔΔCt法分析[24]，再使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Data Processing System，V9.5版）的一般線性模型（general linear model），用雙因素或多因素方差分析（ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）比較不同處理組平均值間的差異[21]；因灰飛虱死亡率的原始數(shù)據(jù)變化幅度在38%—90%，故先進(jìn)行反正弦平方根（arcsine square root）轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果

2.1 LsSK序列分析

通過搜索灰飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得一條編碼SK的cDNA片段，長度為1 282 bp，該序列經(jīng)PCR擴增和測序得以驗證，登錄號為KT989975。Blast結(jié)果表明灰飛虱與點蜂緣蝽（）、內(nèi)華達(dá)古白蟻（）的SK氨基酸序列一致性分別為63%和62%。以模式昆蟲黑腹果蠅（）的SK氨基酸序列為模板在灰飛虱轉(zhuǎn)錄組中搜索，確定灰飛虱在mRNA水平上不存在其他SK同源基因，說明SK在灰飛虱體內(nèi)只有一種轉(zhuǎn)錄形式。為分析LsSK的蛋白質(zhì)特征，將LsSK氨基酸序列與其他昆蟲SK進(jìn)行比對，結(jié)果表明LsSK的開放閱讀框雖不完整，但該序列包括SK酶的4個保守區(qū)域，其中SK酶的Diacylglycerol（DAG）活性位點位于C1—C3區(qū)域（圖1）。

方框內(nèi)表示Diacylglycerol（DAG）區(qū)域，其為激酶活性位點，陰影部分為SK的5個保守區(qū)域C1—C5 Diacylglycerol (DAG) region was boxed, which was the active site of protein kinase. The shadowed regions indicated the five conserved domains of the SK superfamily?；绎w虱Laodelphax striatellus （Lstr）、褐翅椿象Halyomorpha halys（Hhal）、赤擬谷盜Tribolium castaneum（Tcas）、內(nèi)華達(dá)古白蟻Zootermopsis nevadensis（Znev）、黑腹果蠅Drosophila melanogaster（Dmel）

2.2 LsSK氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

SK進(jìn)化樹分化成7個分支，其中來自于鞘翅目、膜翅目、鱗翅目、雙翅目、半翅目，哺乳動物和植物的SK各聚為獨立的分支，且置信度均高于50（圖2）?；绎w虱與褐飛虱SK氨基酸序列有較高的一致性，并分布在同一分支且置信度為100，表明它們親緣關(guān)系較近。LsSK與其他半翅目昆蟲如豌豆長管蚜（）、點蜂緣蝽聚集在半翅目分支，置信度為70。由圖2可知，SK基因相對保守，植物、哺乳動物以及昆蟲體內(nèi)SK間的遺傳距離明顯較遠(yuǎn)。

2.3在灰飛虱體內(nèi)的時空表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果表明，的時空表達(dá)模式在兩個灰飛虱種群之間存在差異。在若蟲期，在帶毒種群的4齡若蟲中表達(dá)量最高，3齡次之；在健康種群中，在5齡若蟲最高，1、4齡次之。并且?guī)Ф痉N群在3、4齡的表達(dá)量顯著高于健康種群同時期若蟲（＜0.05）；在成蟲期，帶毒種群的表達(dá)量顯著高于健康種群，且?guī)Ф拘巯x整頭的表達(dá)量高于帶毒雌蟲整頭的表達(dá)量（圖3-A）。在帶毒種群的雄蟲的各個組織的表達(dá)量顯著高于帶毒種群的雌蟲與健康種群雌、雄蟲各個組織，且在唾液腺和馬氏管的表達(dá)量最高，頭部次之。而該基因在帶毒雌蟲、健康雌、雄蟲的各個組織的表達(dá)量沒有顯著差異（＞0.05）（圖3-B）。

各分支置信度（boostrap）均進(jìn)行1 000次重復(fù)檢驗，且置信度低于50不顯示

1st：1齡若蟲First instar nymph；2nd：2齡若蟲second instar nymph；3rd：3齡若蟲third instar nymph；4th：4齡若蟲fourth instar nymph；5th：5齡若蟲fifth instar nymph；Female：雌蟲；Male：雄蟲；SB：健康灰飛虱RSV-free SBPH；VSB：帶毒灰飛虱virus-infected SBPH；Head：頭；Salivary：唾液腺；Midgut：中腸；Malpighian tubules：馬氏管；Reproduce organ：精巢和卵巢ovary and spermary；SBF：灰飛虱雌蟲RSV-free SBPH female；SBM：灰飛虱雄蟲RSV-free SBPH male；VSBF：帶毒灰飛虱雌蟲virus-infected SBPH female；VSBM：帶毒灰飛虱雄蟲virus-infected SBPH male。數(shù)據(jù)分析均用一般線性分析，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05） All the data were analyzed by GLM, different lowercases on the bar meant significant differences (P＜0.05)

2.4 殺蟲劑處理后的表達(dá)動態(tài)

帶毒種群與健康種群灰飛虱在3種殺蟲劑處理后的的相對表達(dá)分析結(jié)果顯示，健康若蟲在噻嗪酮處理1 h后，mRNA水平開始升高，8 h后達(dá)到最高；溴氰菊酯處理后，表達(dá)量無顯著變化（＞0.05）；吡蟲啉處理1 h后SK表達(dá)量下降后上升，且在16 h上升至0 h的1.4倍（圖4-A）。帶毒種群在吡蟲啉和噻嗪酮處理4 h和8 h后該基因的表達(dá)量顯著提高（＜0.05），且在噻嗪酮處理8 h后表達(dá)量最高，這與健康種群處理組的結(jié)果基本一致；而溴氰菊酯處理后，帶毒灰飛虱的表達(dá)量無顯著變化（＞0.05）（圖4-B）。帶毒種群和健康種群灰飛虱在噻嗪酮處理8 h后表達(dá)量均顯著上升（＜0.05），而兩種群對吡蟲啉和溴氰菊酯的響應(yīng)則不同。根據(jù)帶毒與否、殺蟲劑種類、殺蟲劑處理時間三因素方差分析（ANOVA）結(jié)果表明，帶毒種群與健康種群灰飛虱在殺蟲劑處理后SK含量的變化趨勢一致，帶毒與否因素對SK mRNA含量變化趨勢影響不顯著（(1, 107)=1.877；=0.175），故將帶毒種群與健康種群的數(shù)據(jù)合并分析（圖4-C）：對噻嗪酮的響應(yīng)最為迅速，處理后8 h mRNA水平即達(dá)到最高（2.27倍），而對吡蟲啉的響應(yīng)較緩慢，在處理16 h后表達(dá)量達(dá)到最高（升高2.21倍）。對溴氰菊酯無響應(yīng)，表達(dá)水平無顯著變化（＞0.05）。

A：健康灰飛虱種群RSV-free L. striatellus；B：帶毒灰飛虱種群RSV-infected L. striatellus；C：健康和帶毒灰飛虱種群RSV-free and RSV-infected L. striatellus。數(shù)據(jù)均采用多因素ANOVA分析 All the data were analyzed by ANOVA

2.5 RNA干擾效果

通過qRT-PCR檢測健康灰飛虱在干擾48 h后的表達(dá)水平，確定dsSK干擾效率。由圖5可知，注射dsSK后，試蟲體內(nèi)表達(dá)量明顯低于注射dsGFP的試蟲，平均下降75%。表明注射dsSK后，被成功沉默。

圖5 注射dsSK后灰飛虱體內(nèi)LsSK的mRNA水平

2.6 沉默SK基因后健康與帶毒灰飛虱種群在殺蟲劑處理后的死亡率

注射dsRNA 48 h后，用LC50濃度的3種殺蟲劑處理灰飛虱，24 h后記錄試蟲死亡情況。以注射dsGFP和未注射的灰飛虱作為對照。

由兩因素ANOVA（RNAi：（2, 17）=117.46；= 1E-07；帶毒因子：（1, 17）= 1.02；= 0.33）和圖6-A可知，帶毒種群與健康種群灰飛虱在注射dsGFP后，用吡蟲啉處理24 h后的死亡率相似，差異不顯著，且接近50%，與未注射組的結(jié)果相似。當(dāng)沉默后，帶毒種群與健康種群間的死亡率差異不顯著，但SK沉默組在吡蟲啉處理后的死亡率都顯著高于dsGFP注射組和未注射組（＜0.05）。

由兩因素ANOVA（RNAi：（2, 17）=117.46；= 0.00；帶毒因子：（1, 17）= 15.00；= 0.0022）和圖6-B中可知，帶毒種群與健康種群注射dsGFP后噻嗪酮處理24 h后的死亡率差異不顯著，也接近50%，與未注射組結(jié)果相似。但沉默后，帶毒種群與健康種群對噻嗪酮的敏感性明顯上升，死亡率均顯著高于dsGFP注射組和未注射組，且健康種群的死亡率顯著高于帶毒種群（＜0.05）。

兩因素ANOVA（RNAi：（2, 17）= 84.87；= 1E-07；帶毒因子：（1,17）= 45.25；= 2.11E-05）和圖6-C顯示，dsGFP注射組和未注射組中健康種群在溴氰菊酯處理后的死亡率顯著低于帶毒種群。在干擾SK后，帶毒種群與健康種群的死亡率都顯著高于dsGFP注射組和未注射組（＜0.05）。

綜合圖6結(jié)果可知，帶毒種群與健康種群在沉默SK后，3種殺蟲劑處理后死亡率均顯著高于兩個對照組（圖6-A、6-B）；而對于注射dsGFP和不注射的試蟲而言，帶毒種群與健康種群對每種殺蟲劑的敏感性也存在一定差異，其中帶毒種群灰飛虱對溴氰菊酯的敏感性高于健康種群（圖6-C）。

A：吡蟲啉Imidacloprid；B：噻嗪酮Buprofezin；C：溴氰菊酯Deltamethrin。SB：健康灰飛虱RSV-free SBPH；VSB：帶毒灰飛虱RSV-infected SBPH；CK：未注射灰飛虱組uninjected SBPH；dsGFP：注射雙鏈GFP灰飛虱組dsGFP-injected L. striatellus；dsSK：注射雙鏈SK灰飛虱組dsSK- injected L. striatellus。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）Different lowercases on the bar meant significant differences (P＜0.05)

3 討論

SK/S1P途徑調(diào)控多種重要的細(xì)胞過程，如細(xì)胞存活、細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡和細(xì)胞免疫[25-26]，而且不少報道表明SK與病毒傳毒相關(guān)[27-28]。SK是一種脂類激酶，其在進(jìn)化過程中比較保守。該酶屬于甘油二脂（diacylglycerol，DAG）激酶家族，包含5個保守區(qū)域C1—C5[29]。本研究克隆得到了長度為1 282 bp的SK基因序列，且與其他昆蟲的SK基因有較高的一致性。LsSK氨基酸序列包含SK酶的4個保守區(qū)域C1—C4，其中SK激酶的活性位點——DAG活性區(qū)域位于C1—C3區(qū)域[29]（圖1）。SK氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）結(jié)果表明，LsSK與半翅目昆蟲聚在同一支，說明其親緣關(guān)系較近，SK比較保守[30]。

RSV可在植物及昆蟲寄主如灰飛虱體內(nèi)復(fù)制[31]，通常情況下灰飛虱在3、4齡若蟲期帶毒量最高；且該齡期若蟲傳毒能力很強，到成蟲傳毒能力略有下降[32-33]。在本研究中，帶毒種群3、4齡表達(dá)量顯著高于健康種群3、4齡若蟲，筆者推測SK可能參與了RSV在灰飛虱體內(nèi)復(fù)制和傳播。另外，帶毒雄成蟲各個組織中的表達(dá)量都顯著高于同種群雌成蟲和健康雌雄蟲的相應(yīng)組織，且?guī)Ф拘鄢上x唾液腺中的表達(dá)量極高；帶毒雄成蟲（整蟲）中表達(dá)量也要高于帶毒雌成蟲。大量研究表明，增加SK含量有助于病毒的復(fù)制和傳播[8]，因此推測可能與雄蟲體內(nèi)RSV復(fù)制有關(guān)。Phan等[34]在缺少S1P裂解酶的果蠅突變體中發(fā)現(xiàn)，S1P裂解酶的缺少使得S1P等鞘脂質(zhì)的積累，導(dǎo)致果蠅精巢發(fā)育畸形，表明S1P對精巢的發(fā)育十分重要，由此推測SK可能影響帶毒雄蟲的生長發(fā)育，這還需進(jìn)一步試驗證實。

在真核生物中，神經(jīng)酰胺和S1P含量的平衡可以調(diào)控細(xì)胞程序性死亡[35]。有研究表明，在SK抑制劑作用下，S1P含量降低，神經(jīng)酰胺含量上升，顯著抑制促存活A(yù)KT代謝途徑[36]，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[37]；但在MCF7細(xì)胞中過表達(dá)SK基因，細(xì)胞則對三苯氧胺誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡產(chǎn)生抗性[38]。由于SK基因被報道參與調(diào)控細(xì)胞抗藥性[39]，而且周瀛[40]發(fā)現(xiàn)灰飛虱受到殺蟲劑脅迫后，中性神經(jīng)酰胺酶的活性顯著上升，說明殺蟲劑處理可誘導(dǎo)灰飛虱表達(dá)中性神經(jīng)酰胺酶。本研究中，帶毒種群與健康種群在吡蟲啉和噻嗪酮處理后的表達(dá)水平均有提升，說明這兩種殺蟲劑可誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，這與周瀛[40]的結(jié)果一致。三因素方差分析表明，帶毒與否對mRNA水平變化影響不顯著。帶毒種群與健康種群灰飛虱在沉默SK后，3種殺蟲劑脅迫處理后死亡率均顯著升高，說明可影響灰飛虱對殺蟲劑的敏感性。在SK干擾組中，帶毒種群對吡蟲啉和溴氰菊酯的敏感性顯著高于健康種群，而帶毒種群對噻嗪酮敏感性卻低于健康種群，這可能與殺蟲劑的作用機制不同有關(guān)。

根據(jù)人體細(xì)胞SK對藥物抗藥性有關(guān)的報道[16]，結(jié)合本試驗沉默SK基因后，灰飛虱對殺蟲劑敏感性顯著上升的結(jié)果，可以進(jìn)一步推斷在灰飛虱抵抗殺蟲劑脅迫中可能發(fā)揮著重要作用。由于SK直接調(diào)控神經(jīng)酰胺/S1P的平衡，當(dāng)神經(jīng)酰胺含量升高時，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而S1P含量更高時，則誘導(dǎo)細(xì)胞生長[16]。免疫細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，SK可通過S1P激活胞內(nèi)鈣離子信號通道，調(diào)控細(xì)胞的增生、分化和死亡[41]。鈣離子與鈉離子交換是鈣離子信號傳導(dǎo)途徑的重要組成部分[42]。抑制淋巴細(xì)胞SK的活性將減少JAK-STAT信號傳導(dǎo)，降低細(xì)胞活力[43]。在頭頸鱗狀細(xì)胞癌研究中也有相似發(fā)現(xiàn)，抑制SK可增加細(xì)胞對輻射的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加[44]。綜上所述，被沉默后，推測S1P的合成被抑制，破壞了神經(jīng)酰胺/S1P的平衡，一方面促使神經(jīng)酰胺含量更高而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，另一方面抑制了S1P誘導(dǎo)的促細(xì)胞生長代謝途徑；造成細(xì)胞存活力下降；還可能抑制了S1P受體1而破壞鈉離子和鈣離子通道，最終導(dǎo)致灰飛虱對殺蟲劑更為敏感。

本試驗探索了在帶毒種群和健康種群灰飛虱的表達(dá)模式，為研究SK與RSV傳播關(guān)系提供了部分鞘脂類代謝學(xué)基礎(chǔ)；SK的干擾與3種類型的殺蟲劑對灰飛虱有協(xié)同“增效”作用，這為從水稻-媒介昆蟲-病毒生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)掘內(nèi)稟控制因子，調(diào)控灰飛虱及其傳播的病毒病[10]提供了一種潛在的新方法。

4 結(jié)論

從灰飛虱中克隆得到基因片段，生物信息分析表明該基因在不同物種間比較保守。qRT-PCR結(jié)果表明在帶毒灰飛虱4齡若蟲表達(dá)量最高，3齡次之；在健康種群中，在1、4和5齡若蟲最高。且在帶毒種群3、4齡若蟲的表達(dá)量顯著高于健康種群的3、4齡若蟲；在成蟲期，帶毒種群灰飛虱表達(dá)量明顯高于健康種群。3種殺蟲劑處理灰飛虱后，對噻嗪酮的反應(yīng)最為迅速。干擾后帶毒種群與健康種群對3種殺蟲劑的敏感性均顯著升高，表明SK基因有利于灰飛虱抵抗殺蟲劑脅迫。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Spatio-temporal expression of sphingosine kinase and its response to insecticide stress inFallén

JIAO Wen-juan1, LI Fei-qiang1, ZHANG Min-jing1, SHI Xiao-xiao1, ZHU Mu-fei1, Mao Cun-gui2, ZHU Zeng-rong1

(1Institute of Insect Sciences, Zhejiang University/State Key Laboratory of Rice Biology/Key Laboratory of Agricultural Entomology, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310058, China;2Department of Medicine, Stony Brook University, Stony Brook, NY, USA)

【Objective】The objective of this study is to understand the characteristics of sphingosine kinase (SK) and research on the spatio-temporal expression of SK and its response to insecticide stress in(RSV) -infectedFallén (small brown planthopper, SBPH) and RSV-free.【Method】A SK sequence () fromwas cloned using PCR. qRT-PCR was employed to analyze the expression pattern of SK gene at different stages (1st-5th instar nymphs, female and male adult) and various organs (head, salivary, midgut, malpighian tubules, ovary and spermary) of the two above mentionedcolonies. In order to calculate the sublethal concentration (LC50) of three insecticides (deltamethrin, buprofezin and imidacloprid), those insecticides solutions were applied topically to the mesonotum of4th-instar nymphs with a hand microapplicator. The SK mRNA level ofwas detected after exposure to LC50of three insecticides. After knockdown SK of twocolonies by using dsRNA injection,was exposed to LC50of three insecticides and the mortality was recorded.【Result】asequence fromwas cloned and its length is 1 282 bp(GenBank accession number KT989975). According to the phylogenetic analysis, SK ofwas clustered together with those from hemipteran insects. The amino-acid sequences of LsSK contained four conserved domains (C1-C4), and the catalytic domain–Diacylglycerol active site formed within C1-C3. qRT-PCR results showed thatwas most highly expressed in the 4th-instar nymphs of RSV-infected, followed by 3rd-instar nymphs. In RSV-free,was most highly expressed in 5th-instar nymphs, followed by 1st- and 4th-instar nymphs. Furthermore,levels were significantly higher in RSV-infected 3rd- and 4th-instar nymphs than that in RSV-free 3rd- and 4th-instar nymphs(＜0.05). At the adult stage,levels were significantly higher in RSV-infected adults than in RSV-free adults (＜0.05). Interestingly,showed extremely higher expression in the tissues of viruliferous males than that of viruliferous females and nonviruliferous adults. The highest expression ofwas found in salivary and malpighian tubules of viruliferous males, followed by heads. After exposure to sublethal concentrations (LC50) of three insecticides (imidacloprid 6.5 ng·μL-1, buprofezin 500 ng·μL-1and deltamethrin 37.5 ng·μL-1), the mRNA levels ofand response speed of twocolonies were different. Exposure to buprofezin led to significantly increased expression ofwhile no significant changes was observed after exposure to deltamethrin(＞0.05). The response ofexpression to buprofezin was relatively faster than to the other insecticides. Injection ofwith dsRNA against SK reduced the mRNA level ofgreatly, and silencing of SK led to increased susceptibility in RSV-infected and RSV-freeto these three insecticides.【Conclusion】Thewas identified and cloned, and it was found significantly high expression in the 3rd and 4th instar of RSV-infected. Silencing the SK resulted in increased susceptibility into three insecticides, indicated that SK plays a role in facilitatingto response to insecticidal stress.

sphingolipid; sphingosine kinase;; RNA interference; qRT-PCR

2016-07-04；接受日期：2016-09-03

國家自然科學(xué)基金（31575001）、國家科技支撐計劃（2012BAD19B01）、國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（“973”計劃）（2010CB126200）

焦文娟，E-mail：jiaowenjuan1020@163.com。通信作者祝增榮，E-mail：zrzhu@zju.edu.cn