珍龍醒腦膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

項穎卿 涂長春 章國良

(江西科技學(xué)院護(hù)理學(xué)院，江西 南昌 330098)

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珍龍醒腦膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

項穎卿 涂長春1章國良2

(江西科技學(xué)院護(hù)理學(xué)院，江西 南昌 330098)

目的 探討珍龍醒腦膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響。方法 健康SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注損傷模型組、珍龍醒腦低(50 mg·kg-1·d-1)、中(100 mg·kg-1·d-1)和高劑量組(200 mg·kg-1·d-1)。每組6只。術(shù)前實驗性灌胃給藥，珍龍醒腦組分別灌注不同劑量藥液，假手術(shù)組和模型組灌注等量生理鹽水。連續(xù)給藥7 d后采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水。術(shù)后6、12、24、48、72 h斷頭取腦。用TUNEL法檢測大鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，免疫組化法觀察Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，珍龍醒腦組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)、Caspase-3 蛋白表達(dá)下調(diào)(P均<0.01)，珍龍醒腦中、高劑量組與低劑量組比較，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)、Caspase-3 蛋白表達(dá)下調(diào)(P均<0.01)。結(jié)論 珍龍醒腦可抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)缺血腦組織Bcl-2表達(dá)、抑制Caspase-3表達(dá)，以珍龍醒腦中、高劑量效果明顯。

珍龍醒腦；腦缺血再灌注損傷；細(xì)胞凋亡

研究發(fā)現(xiàn)〔1〕，珍龍醒腦膠囊可以溶解血栓、消除動脈粥樣硬化斑塊、解除血管平滑肌痙攣、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、增加血流速度、降低血液黏度、擴(kuò)張微小動靜脈、降低腦血管通透性，減少自由基損傷、改善腦梗死的預(yù)后，尤其在減少腦梗死后遺癥、促進(jìn)語言肢體機(jī)能恢復(fù)等方面療效顯著。動物實驗證明珍龍醒腦膠囊通過降低丙二醛(MDA)含量，升高超氧化物歧化酶(SOD)、Na+-K+-ATP酶活力，有效降低腦含水量，對小鼠腦缺氧及缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其抗腦缺血再灌注損傷作用與保護(hù)腦組織ATP酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和減輕自由基損傷有關(guān)〔2〕。有關(guān)珍龍醒腦膠囊對神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響的報道很少。本實驗觀察珍龍醒腦膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠，雌雄各半，體重220～300 g,由江西中醫(yī)藥大學(xué)動物科學(xué)部提供。合格證號：JZDW No2013-0024。

1.2 藥物與試劑 珍龍醒腦膠囊，青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準(zhǔn)字Z20026000；TUNEL試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供，Bcl-2、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體，SP 法免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒，均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 分組與給藥 健康SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注模型組、珍龍醒腦低(50 mg·kg-1·d-1)、中(100 mg·kg-1·d-1)和高劑量組(200 mg·kg-1·d-1)。每組6只。術(shù)前實驗性灌胃給藥，珍龍醒腦組組分別灌注不同劑量藥液，假手術(shù)組和模型組灌注等量生理鹽水。連續(xù)給藥7 d。采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水。

1.4 造模及取材 采用改良Longa等〔3〕線栓法建立局灶性腦缺血再灌注模型。假手術(shù)組除不插線外，其余步驟相同。 模型制作成功后，在各時間點取材，水合氯醛過量麻醉，迅速開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管后灌注生理鹽水250 ml剪開右耳，快速沖洗，再用4%多聚甲醛250 ml灌注，直到頭部變硬，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和腦干。冰盤上迅速分離大腦半球，棄去健側(cè)，取視交叉前后約20～30 mm范圍的冠狀切片，放入10%福爾馬林中固定，24 h之內(nèi)石蠟包埋。

1.5 TUNEL神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測 腦組織按常規(guī)石蠟包埋，TUNEL法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，蘇木素復(fù)染。在光鏡下，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞核則呈深淺不一的棕褐色。每張切片隨機(jī)選取5個不重疊的視野，輸入計算機(jī)進(jìn)行圖像分析，計算每個視野的凋亡細(xì)胞個數(shù)和正常細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞凋亡指數(shù)，取平均值。

1.6 Bcl-2、Caspase-3免疫組化檢測 取石蠟切片，脫蠟至水。采用SP免疫組化法觀察Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)。陰性對照組以0.01 mol/L PBS代替一抗，其余步驟不變。鏡下觀察胞質(zhì)呈棕褐色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行顯微攝影。每張切片隨機(jī)選取5個不重疊的視野，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集(顯微鏡20×10倍)，測定陽性表達(dá)的面積密度和平均光密度，計算整合光密度(IOD)。IOD=面積密度×平均光密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 假手術(shù)組未見或僅見少量凋亡細(xì)胞。模型組可見缺血半暗帶區(qū)內(nèi)有大量凋亡細(xì)胞存在。光鏡下凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為胞核被染成淡棕色。腦缺血再灌注6 h后，神經(jīng)細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)凋亡，此后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率逐漸升高，腦缺血后24～48 h達(dá)到高峰，72 h后呈現(xiàn)下降趨勢。模型組各時間段神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。珍龍醒腦組各時間段神經(jīng)細(xì)胞凋亡率與模型組比較明顯減少(P均<0.01)；珍龍醒腦中、高劑量組與低劑量組比較，神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯減少(P均<0.01)。見表1。

2.2 大腦皮層及海馬區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)情況 Bcl-2陽性細(xì)胞主要位于海馬及皮層缺血梗死灶邊緣缺血半暗帶區(qū)，梗死灶中心區(qū)少見陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞主要是神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，胞質(zhì)呈棕黃色，染色均勻。結(jié)果顯示，模型組和珍龍醒腦組腦缺血再灌注6 h后Bcl-2表達(dá)增加，12～24 h達(dá)高峰，48 h后呈現(xiàn)下降趨勢，與假手術(shù)組比較差異顯著(P均<0.01)。珍龍醒腦組與模型組比較，大鼠缺血區(qū)皮質(zhì)和海馬Bcl-2陽性表達(dá)均明顯增加(P均<0.01)，珍龍醒腦中、高劑量組與低劑量組比較，Bcl-2表達(dá)明顯增加(P均<0.01)。見表2。

2.3 大腦皮層及海馬區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)情況 假手術(shù)組Caspase-3表達(dá)極少，模型組缺血6 h后Caspase-3表達(dá)增加，12～24 h達(dá)高峰，48 h后呈現(xiàn)下降趨勢。珍龍醒腦組與模型組比較，大鼠缺血區(qū)皮質(zhì)和海馬Caspase-3陽性表達(dá)均明顯減少(P均<0.01)，珍龍醒腦中、高劑量組與低劑量組比較，Caspase-3表達(dá)明顯減少(P均<0.01)。見表3。

表1 珍龍醒腦對大鼠不同時間段腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的影響(n=6,)

組別6h12h24h48h72h假手術(shù)組模型組珍龍醒腦低劑量組珍龍醒腦中劑量組珍龍醒腦高劑量組0.96±0.2838.03±3.121)26.45±1.232)14.25±1.042)3)13.24±1.722)3)1.04±0.1355.67±2.741)26.34±3.192)17.15±2.732)3)16.53±1.652)3)0.90±0.0868.72±2.951)45.37±3.082)22.18±2.772)3)20.72±3.132)3)1.03±0.1874.23±3.541)50.33±3.072)18.65±2.112)3)18.74±1.792)3)0.99±0.1056.64±2.741)40.30±1.192)13.05±1.032)3)12.78±1.172)3)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與低劑量組比較：3)P<0.01，下表同

表2 珍龍醒腦對大鼠不同時間段腦缺血再灌注損傷Bcl-2表達(dá)影響(n=6,)

組別6h12h24h48h72h假手術(shù)組模型組珍龍醒腦低劑量組珍龍醒腦中劑量組珍龍醒腦高劑量組6.38±0.0428.03±3.121)56.64±0.972)54.28±1.852)3)58.55±2.42)3)5.27±0.5465.67±3.141)86.86±3.092)117.15±2.732)3)126.53±1.652)3)4.26±0.7898.72±2.951)163.31±4.082)202.56±3.162)3)217.35±5.362)3)6.03±0.1484.23±3.541)150.63±5.242)158.65±2.112)3)178.74±1.792)3)5.99±0.1166.64±2.741)98.30±4.192)103.05±1.032)3)112.78±1.172)3)

表3 珍龍醒腦對大鼠不同時間段腦缺血再灌注損傷Caspase-3表達(dá)影響(n=6,)

組別6h12h24h48h72h假手術(shù)組模型組珍龍醒腦低劑量組珍龍醒腦中劑量組珍龍醒腦高劑量組4.16±0.3735.03±4.091)26.64±1.262)26.28±1.362)3)28.55±1.522)3)6.04±0.3975.67±3.341)60.86±3.142)57.15±2.602)3)54.70±1.872)3)5.37±0.16148.62±3.971)87.42±3.682)68.46±3.262)3)65.47±3.052)3)4.93±034112.23±4.671)74.53±3.972)58.35±2.452)3)60.74±2.412)3)5.34±0.1689.64±5.301)60.30±2.542)45.05±1362)3)42.33±1.372)3)

3 討 論

局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的死亡包括壞死和凋亡兩種方式，在缺血嚴(yán)重的梗死中心區(qū)神經(jīng)元的死亡以壞死為主，而在缺血半暗帶區(qū)，存在大量的凋亡細(xì)胞。Caspase-3是Caspase 級聯(lián)“瀑布下游”最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用〔4〕。 Bcl-2是目前首個被確認(rèn)有抑制細(xì)胞凋亡作用的因子，可通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔5〕。Caspase-3 作為Bcl-2 的生理性半胱氨酸蛋白酶，對Bcl-2蛋白具有重要的酶解修飾作用，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，通過酶切Bcl-2 蛋白來抑制Bcl-2的抗凋亡作用；另一方面，Bcl-2 作為Caspase-3 的上游調(diào)控因子，其過度表達(dá)可以有效抑制各種因素誘導(dǎo)的Caspase-3 激活和由此產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡〔6〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)均可以見到少量的凋亡細(xì)胞，這說明神經(jīng)細(xì)胞凋亡在生理情況下也存在。它是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機(jī)制之一。珍龍醒腦能使神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，證實了珍龍醒腦對腦缺血損傷的保護(hù)作用。腦缺血再灌注損傷可以激活抗凋亡基因Bcl-2的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)作用。珍龍醒腦膠囊具有上調(diào)Bcl-2表達(dá)、減少腦缺血病灶周圍Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)的能力，提示珍龍醒腦能抑制皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元凋亡，對腦神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

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〔2015-06-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

江西科技學(xué)院校級自然科學(xué)基金(ZR13YB07)

1 南昌大學(xué)藥學(xué)院 2 南昌市第二醫(yī)院檢驗科

項穎卿(1976-)，女，碩士，講師，主要從事心腦血管藥理、老年護(hù)理研究。

R4

A

1005-9202(2016)23-5835-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.027