免疫球蛋白M和糖蛋白96表達與鼻咽癌放療敏感性的關(guān)系*

趙飛鵬 費櫻平 馮華君 徐偉 許勝恩 趙沖 覃綱

免疫球蛋白M和糖蛋白96表達與鼻咽癌放療敏感性的關(guān)系*

趙飛鵬1費櫻平1馮華君1徐偉1許勝恩1趙沖1覃綱1

目的 研究免疫球蛋白M（immunoglobulinM,IgM）和糖蛋白96（glycoprotein 96,gp96）在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）中表達與放療敏感性的關(guān)系。方法 按照世界衛(wèi)生組織關(guān)于實體腫瘤放射治療敏感性評估標(biāo)準(zhǔn)選取60例NPC放療前組織標(biāo)本，其中30例為放療敏感組，30例為放療耐受組；并取30例同期鼻咽部慢性炎癥作為對照；另選取同期放射治療3-6個月后頸部殘留淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶并行頸部淋巴結(jié)清掃者9例；采用免疫組化SP法檢測IgM和gp96的表達，比較分析IgM和gp96表達與NPC放療敏感性的關(guān)系。結(jié)果 IgM和gp96在NPC組織中均顯著高表達。IgM在NPC放療耐受組的表達率（80.0%）顯著高于放療敏感組（36.7%）（P<0.05）；gp96在NPC放療耐受組的表達率（83.3%）也顯著高于放療敏感組（46.7%）（P< 0.05）；IgM和gp96在NPC組織中的表達呈正相關(guān)性（r=0.443，P<0.05）。IgM與gp96在NPC放療后頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移殘留組織中高表達率分別為88.9%和77.8%。結(jié)論 IgM和gp96在NPC中高表達，且其表達水平與NPC放療敏感性呈負相關(guān)，提示它們可能作為預(yù)測NPC放療敏感性的指標(biāo)；IgM和gp96在NPC中表達呈正相關(guān)，同時檢測兩個指標(biāo)可能會提高預(yù)測NPC放療敏感性的準(zhǔn)確度，以便制定更為有效的治療方案。

鼻咽癌；免疫球蛋白M；糖蛋白96；放療敏感性

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一種原發(fā)于鼻咽黏膜的頭頸惡性腫瘤，其發(fā)病與遺傳、EB病毒感染及環(huán)境等因素密切相關(guān)。NPC目前采用以放療為主的綜合治療，文獻報道NPCⅠ期和Ⅱ期患者的5年總體生存率分別能夠達到90%和84%，但Ⅲ期和Ⅳ期患者采用同期放化療后5年總體生存率僅維持在70%左右；部分患者存在放療抵抗以致腫瘤殘留及復(fù)發(fā)，是NPC治療失敗的主要原因[1]。解析NPC放療抵抗的機制和尋找提高放療敏感性的抗腫瘤靶標(biāo)，對提高NPC放療效果及患者生存率顯得尤為迫切和重要。課題組前期研究結(jié)果顯示IgM蛋白在NPC細胞及組織中存在高表達，且抗人IgM抗體對NPC細胞及移植瘤有抑制作用，但是目前對于NPC中IgM表達與其放療敏感性的關(guān)系尚不明確。本研究采用免疫組化SP法檢測IgM和gp96在NPC放療敏感組及耐受組中的表達，分析IgM和gp96在NPC中的表達與放療敏感性的關(guān)系，探討IgM在NPC組織中表達對NPC放射治療的作用和臨床意義，以期尋找預(yù)測NPC放療敏感性的指標(biāo)。

材料與方法

1 臨床標(biāo)本

選取2013年7月～2015年3月就診于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科且臨床資料完整的60例NPC組織標(biāo)本，其中男28例，女32例，年齡23～78歲，中位年齡49歲。對照組：同期就診于我院經(jīng)病理確診為鼻咽部慢性炎癥的組織標(biāo)本30例，其中男15例，女15例，年齡25～73歲，中位年齡49歲。另選取同期放療結(jié)束3～6個月后頸部殘留轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)患者9例。

2 放療效果評定

療效評價按照WHO實體腫瘤的反應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)，在NPC患者放射治療結(jié)束3個月后復(fù)查鼻咽部MRI掃描，根據(jù)腫瘤的消退情況，對腫瘤放射治療敏感性進行近期評估。評估標(biāo)準(zhǔn)如下：①MRI檢查顯示鼻咽部沒有顯著的軟組織增厚、隆起或鼻內(nèi)鏡檢查見鼻咽部黏膜光滑，無黏膜糜爛或新生物隆起，并且活檢沒有發(fā)現(xiàn)癌細胞，判定為放療敏感；②MRI檢查顯示鼻咽部軟組織顯著增厚，或鼻內(nèi)鏡下見鼻咽黏膜局部粗糙隆起且鼻咽部新生物活檢病理檢查發(fā)現(xiàn)癌細胞者，這類患者診斷為局部腫瘤殘余，表明對放療耐受[2]。

3 主要實驗試劑

兔抗人IgM單克隆抗體（SANTA CRUZ公司，美國），兔抗人GP96單克隆抗體（Bioworld公司，美國），兔抗人CD20抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；免疫組化超敏SP試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），DAB顯色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺、免疫組化專用PBS及0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

4 主要實驗步驟

采用免疫組化SP法：取組織石蠟塊，切片、脫蠟，高壓抗原修復(fù)，山羊血清封閉；依次分別滴加以PBS稀釋為1:50的兔抗人IgM一抗或1:500的兔抗人GP96一抗；PBS沖洗，滴加二抗；滴加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶；DAB 顯色，蘇木素復(fù)染；操作嚴(yán)格按照試劑說明書進行。

5 免疫組化染色結(jié)果判斷

由兩位實驗人員在高倍鏡（×400）下，每張切片隨機選取10個染色良好視野，結(jié)合陽性細胞百分?jǐn)?shù)和染色強度進行結(jié)果判定。根據(jù)染色陽性細胞的百分率不同分別計為0～3分：0=＜5%；1=5～25%；2= 25～50%；3=＞50%。染色強度0、1、2、3分別代表染色陰性、輕度、中度及重度。最終結(jié)果由這兩個結(jié)果得分相加，0～1分記為-，2～3分記為+，4～5分記為++，6分記為+++。0～3分的切片記為低表達，4～6分為高表達。如果兩位實驗人員評定意見不一致，可經(jīng)討論后達成一致，必要時可申請第三者參與判定。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0 for Windows統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗、計算Fisher確切概率，建立IgM表達水平與gp96表達水平的配對四格表，計算Cramer氏系數(shù)V值，相關(guān)系數(shù)r值及P值，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 IgM、gp96在NPC及鼻咽部慢性炎性黏膜組織中的表達情況

IgM表達主要位于NPC細胞漿中，細胞核表達少見（圖1-A）。利用CD20標(biāo)志B淋巴細胞排除腫瘤組織中B細胞浸潤污染（圖1-E）。NPC中IgM高表達率為58.3%，對照組鼻咽部慢性炎性黏膜組中IgM高表達率為30.0%（圖1-B），兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=6.425，P＜0.05）。gp96在NPC細胞膜及細胞漿中都存在表達（圖1-C），NPC中g(shù)p96高表達率為65.0%，對照組中g(shù)p96高表達率為20.0%（圖1-D），兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=16.200，P＜0.05）。IgM、gp96在NPC中存在高表達（表1）。

圖1 IgM、gp96在NPC及鼻咽炎性黏膜組織中的表達（SP×400）

表1 IgM、gp96在NPC及鼻咽部炎性黏膜組織中的表達

2 IgM、gp96在NPC放療敏感組及放療耐受組患者中的表達情況

60例NPC病例標(biāo)本中，35例IgM高表達（圖2-A），25例IgM低表達（圖2-B），NPC放療敏感組及放療耐受組中IgM蛋白的高表達率分別為36.7%和80.0%，兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=11.589，P＜0.05）；39例gp96高表達（圖2-C），21例gp96低表達（圖2-D），NPC放療敏感組及放療耐受組中g(shù)p96蛋白的高表達率分別為46.7%和83.3%，兩者有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=8.864，P＜0.05）。IgM、gp96均在放療耐受組中表達較高，表明IgM、gp96表達水平與NPC的放療敏感性呈負相關(guān)（表2）。

圖2 IgM、gp96在NPC放療患者中的表達差異（SP×400）

表2 IgM、gp96在NPC放療患者中的表達

3 IgM、gp96在NPC患者中表達的相關(guān)性分析

60例NPC組織IgM與gp96的表達情況見表3；IgM低表達者25例，高表達者35例；gp96低表達21例，高表達39例；IgM、gp96兩者共同低表達15例，共同高表達29例。統(tǒng)計分析得出，NPC樣本組織中IgM與gp96的表達正相關(guān)（χ2=11.774，V= 0.758；r=0.443，P=0.001)，表3。

表3 IgM蛋白和gp96蛋白在NPC患者中表達的關(guān)系

4 IgM、gp96在NPC放療后頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移殘留組織中的表達情況

NPC放療3～6個月后頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移殘留組織中存在IgM、gp96的表達（圖3）；在9例中，IgM低表達者1例，IgM高表達者8例，高表達率為88.9%；在9例中，gp96低表達者2例，gp96高表達者7例，高表達率為77.8%。

圖3 IgM、gp96在NPC放療后頸部殘留淋巴結(jié)中的表達（SP×400）

討論

NPC是我國南方及東南亞常見的惡性腫瘤，放射治療是其主要的治療手段，但放療抵抗仍是治療失敗的主要原因，主要表現(xiàn)為局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移[1]。腫瘤分化程度及TNM分期仍是制定NPC放療計劃主要依據(jù)，但NPC對放療的敏感性還受到復(fù)雜的分子機制調(diào)控。目前無法有效的區(qū)分NPC放療抵抗亞群及NPC放療抵抗的機制有待進一步研究，尋找放療敏感性的分子標(biāo)志物對NPC臨床個體化治療具有重要意義。

早在1991年，Cao等[3]在NPC的CNE2細胞系中分離出Tx基因并發(fā)現(xiàn)IgK輕鏈的JC片段。Hu等[4]發(fā)現(xiàn)IgM在許多上皮來源的腫瘤中表達，并可能參與腫瘤的免疫及生物學(xué)改變。在肝癌[5]，前列腺癌[6]，卵巢癌[7]中的IgM復(fù)合物也顯著增高。本課題組前期證實NPC細胞系CNE-1和HNE-1中存在

IgM蛋白表達；IgM蛋白在NPC組織中高表達，并與NPC患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)[8]。本實驗通過免疫組化SP法檢測IgM在60例NPC和30例鼻咽部黏膜組織中表達，發(fā)現(xiàn)IgM在NPC組織中表達顯著高于正常鼻咽黏膜組織，這與之前的研究結(jié)果相符合。

Ig在NPC中表達的具體作用機制還不清楚，但目前的研究多表明Ig具有促進腫瘤生長、增殖及轉(zhuǎn)移的作用。Qiu等[9]發(fā)現(xiàn)阻斷腫瘤內(nèi)源性IgG可抑制腫瘤細胞的生長，提示IgG在腫瘤細胞的生長及存活中有重要作用。鄧郁青等[10]通過轉(zhuǎn)染Ig重鏈互補決定區(qū)3促使HT-29細胞Ig基因表達降低，從而影響腫瘤細胞的生長、凋亡等。Zheng等[11]通過用鼠抗人Igα抗體阻斷腫瘤源性Igα的產(chǎn)生，HeLa和CNE1細胞增殖被顯著抑制，表明腫瘤源性Ig有促進腫瘤生長的作用。Hu等[4]研究認(rèn)為，IgM與CD79在癌細胞膜表面形成B細胞抗原受體樣復(fù)合物，在細胞外信號的刺激下誘導(dǎo)快速鈣通道激活，進一步促使PI3和PLC-γ2通路的激活，促進腫瘤細胞的增殖。我們前期研究表明，抗人IgM抗體可以顯著抑制HNE-1細胞增殖，抗人IgM抗體可以誘導(dǎo)HNE-1細胞凋亡和抑制HNE-1裸鼠移植瘤的生長，提示IgM可能與NPC的發(fā)病機制有關(guān)。

現(xiàn)關(guān)于IgM表達與NPC放療敏感性的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)IgM在放療耐受組的高表達率（80.0%）顯著高于敏感組（36.7%），NPC放療3～6個月后頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移殘留組織中IgM高表達，提示IgM在NPC中的高表達可能與NPC放療耐受相關(guān)。處于不同細胞周期的腫瘤細胞對放射的敏感性也不一樣。課題組前期研究表明抗人IgM抗體可以影響HNE-1細胞周期，導(dǎo)致G1期細胞減少，細胞周期阻滯于S期；而S期細胞增加，可降低腫瘤細胞抗射線的促凋亡作用而產(chǎn)生射線抵抗。此外，研究發(fā)現(xiàn)：IgM可通過p53非依賴方式促進p21的激活而調(diào)控細胞周期，使腫瘤細胞處于休眠期（G0期），抗IgM抗體可增加細胞凋亡[12]。因此，IgM的高表達可能通過調(diào)控腫瘤的細胞周期使其處于射線不敏感的G0/G1/S期，從而導(dǎo)致NPC放療抵抗。

有研究表明gp96的表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Hodorov等[13]發(fā)現(xiàn)gp96在乳腺癌組織表達顯著高于癌旁組織。乳腺癌淋巴結(jié)陽性患者gp96的表達水平顯著高于淋巴結(jié)陰性者，gp96表達與腫瘤的擴散轉(zhuǎn)移相關(guān)并可作為腫瘤預(yù)后不良的指標(biāo)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)gp96在NPC中的表達顯著高于正常鼻咽部黏膜組織。高表達gp96的口腔癌患者的無瘤生存期和總存活期較短，并對放療有一定的抵抗性[15]。Chang等[16]在NPC及頭頸腫瘤放療抵抗的亞克隆細胞系中，使用cDNA微陣列、蛋白質(zhì)組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)gp96是一種調(diào)節(jié)放療抵抗亞群的基因或蛋白，敲除gp96可以增加腫瘤的放療敏感性；進一步研究發(fā)現(xiàn)gp96高表達與腫瘤分期及放療敏感密切相關(guān)，高表達gp96的NPC患者預(yù)后較差。同樣，Lin等[17]發(fā)現(xiàn)敲除gp96后無論在細胞還是裸鼠體內(nèi)均可提高放療敏感性。本實驗中放療抵抗組gp96的表達水平顯著高于放療敏感組，且gp96在NPC放療后頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移殘留組織中高表達，這與已有的研究相符合。

本研究中IgM和gp96表達成正相關(guān)（r=0.443，P＜0.05），表明兩者在NPC的發(fā)生發(fā)展、抗凋亡、細胞修復(fù)等過程中可能有著協(xié)同作用。Tramentozzi[18]等在研究gp96對人血液中單核細胞產(chǎn)生Ig的影響中發(fā)現(xiàn)，gp96可以通過細胞因子樣作用激活體液免疫，促進B細胞的成熟與分化。王慧賢等[19]發(fā)現(xiàn)gp96與IgG在肺癌中共表達，推測它們在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有協(xié)同作用，可能參與了腫瘤的免疫及免疫逃逸機制。但IgM和gp96在NPC中共表達及與放療的關(guān)系，需進一步研究。

本研究通過免疫組化SP法檢測IgM和gp96在NPC放療敏感組及耐受組中表達水平，發(fā)現(xiàn)IgM和gp96在NPC中高表達，且其表達水平與NPC放療敏感性呈負相關(guān)，提示它們可以作為預(yù)測NPC放療敏感性的指標(biāo)；IgM和gp96在NPC中表達呈正相關(guān)，同時檢測兩個指標(biāo)可能會提高預(yù)測NPC放療敏感性的準(zhǔn)確度，以便制定更為有效的治療方案。但IgM和gp96是如何參與NPC的放療抵抗機制仍不明確，需進一步研究。

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（收稿:2016-10-09）

The relationship between expression of Immunoglobulin M and glycoprotein 96 and radiosensitivity in human nasopharyngeal carcinoma

ZHAO Feipeng,FEI Yingping,FENG Huajun,XU Wei,XU Sheng-en,ZHAO Chong,QIN Gang
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou,Sichuan 646000,China

Objective To study the relationship between the expression of ImmunoglobulinM(IgM)and glycoprotein 96(gp96)in nasopharyngeal carcinoma (NPC)and sensitivity to radiotherapy.Methods According to the WHO on solid tumor radiosensitivity evaluation criteria,60 cases of NPC tissue specimens before radiotherapy,including 30 cases of radiation sensitive group,30 cases of radiation resistance group,were chosen,and 30 cases of chronic nasopharngitits as control group;9 cases of residual cervical lymph node were also selected in cervical lymph node dissection after radiotherapy 3-6 months.The expression of IgM and gp96 were detected by immunohistochemistry SP method,and the relationship between the expression of IgM and gp96 and the radiosensitivity of NPC was analyzed.Results IgM and gp96 were both over-expressed in NPC tissues.The expression of IgM in radio-resistant group (80.0%)was significantly higher than radio-sensitive group(36.7%)(P<0.05).Also,the expression of gp96 in radio-resistant group (83.3%)was significantly higher than radio-sensitive group(46.7%)(P<0.05).The expression of IgM and gp96 had positive correlation in NPC(r=0.443,P<0.05).The high expression of IgM and gp96 in residual metastatic neck lymph node after radiotherapy were 88.9% and 77.8%separately.Conclusions IgM and gp96 were both over-expressed in NPC.Both of them had negative correlation with radiosensitivity of NPC,which could be a useful predictor of radiosensitivity in NPC.The expression of IgM and gp96 had positive correlation in NPC.Detecting the expression of IgM and gp96 can more accurately predict the radiosensitivity of NPC.

Nasopharyngeal Carcinoma;Immunoglobulin M;Glycoprotein 96;Radiosensitivity

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.05.002

國家自然科學(xué)基金項目（81602570），瀘州市人民政府-四川醫(yī)科大學(xué)科技戰(zhàn)略合作項目[2015LZCYD-S02(4/11)]

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（646000）

覃綱,主任醫(yī)師.Email:qin-lzm@163.com