Hedgehog信號通路中下游轉(zhuǎn)錄因子GLI1在鼻咽癌中的表達(dá)*

姚利 聶國輝 蔡智 陸興

·實驗研究·

Hedgehog信號通路中下游轉(zhuǎn)錄因子GLI1在鼻咽癌中的表達(dá)*

姚利1聶國輝1蔡智1陸興1

目的 檢測hedgehog信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子GLI1在鼻咽癌組織中的表達(dá)活性及其臨床病理意義。方法 50例鼻咽癌組織標(biāo)本，免疫組織化學(xué)染色法檢測GLI1的表達(dá)活性水平，并與26例鼻咽慢性炎癥組織標(biāo)本檢測結(jié)果進(jìn)行比較，分析其表達(dá)差異的臨床病理意義。結(jié)果 鼻咽癌組織GLI1表達(dá)水平較鼻咽慢性炎癥組織顯著升高（P<0.05），其活性水平與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.05），并顯示隨瘤細(xì)胞浸潤程度加劇而活性升高趨勢，但無顯著性意義（P>0.05）。結(jié)論 鼻咽癌細(xì)胞Hedgehog信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子GLI1顯示異?；罨?，可能在鼻咽癌的進(jìn)展過程中起重要作用，有希望成為鼻咽癌診斷及治療的分子靶點。

鼻咽癌；GLI1蛋白；表達(dá)活性；臨床病理意義

鼻咽癌占全身惡性腫瘤的30.97%，占頭頸部癌的78.08%，鼻咽癌淋巴道轉(zhuǎn)移率高達(dá)60%～86%。廣東省是高發(fā)區(qū)。浸潤和轉(zhuǎn)移是NPC致死的主要原因。它的發(fā)生是一個多因素協(xié)同、多階段發(fā)生的復(fù)雜過程，同時也是細(xì)胞增殖分化與細(xì)胞凋亡平衡失調(diào)的過程。近年來通過對腫瘤的研究[1]，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞生長有相似之處，一些在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化過程中起重要調(diào)控作用的信號傳導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用。研究表明[2,3]，在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)SHH通路的異常激活。因此本實驗通過檢測鼻咽癌組織中該SHH信號通路中下游轉(zhuǎn)錄因子GLI1在鼻咽癌組織的表達(dá)，探討其在鼻咽癌組織中的作用及臨床意義。

材料與方法

1 一般資料

以2009年3月～2014年1月北京大學(xué)深圳醫(yī)院50例鼻咽癌患者的石蠟包埋標(biāo)本為研究材料(NPC組)。其中,男38例,女12例；年齡20～71歲,平均40歲。均為鼻咽非角化性癌。病例經(jīng)HE切片再次復(fù)檢確診。其中根據(jù)中國“鼻咽癌2008分期”的方案[13]，將臨床T分期分為T1期10例,T2期21例，T3期14例,T4期5例。經(jīng)過B超檢查及活檢證實NPC組又分為頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(30例)和非轉(zhuǎn)移組(20例)?；颊呔催M(jìn)行過放射治療及化學(xué)藥物治療。對照組26例慢性鼻咽黏膜黏膜來自同時期的活檢鼻咽黏膜炎性組織標(biāo)本，男16例，女10例；年齡20～65歲，平均38歲。

2 方法

免疫組化方法：兔抗人多克隆抗體Glil均購自美國Santa Cruz公司，工作濃度分別為1∶150。Elivision Plus試劑盒、DAB顯色劑購自福州邁新公司。免疫組化步驟按試劑盒說明進(jìn)行，手術(shù)切除的組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋切片，連續(xù)切片每張厚約5μm。陽性對照采用肺癌組織,用PBS代替一抗和二抗作陰性對照。做HE染色和采用Elivision Plus二步法免疫組化染色。

3 免疫組化結(jié)果判定

在不知任何背景資料的情形下,采用雙盲法進(jìn)行判定，Glil蛋白主要定位在細(xì)胞核或胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕褐色顆粒為染色陽性。顯微鏡下觀察,腫瘤未著色或著色<10%為陰性(-),腫瘤細(xì)胞著色在11%～25%為陽性(+)，26%～50%(++)，>51%(+++)，結(jié)果用百分率表示。

4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)析計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗，多個樣本均數(shù)比較的方差檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 Glil在不同鼻咽組織中的表達(dá)（表1）

Glil蛋白陽性表達(dá)率為52%,陽性表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)。陽性細(xì)胞胞漿或胞膜呈棕黃色,陽性顆粒粗細(xì)不等。陰性細(xì)胞胞漿、胞膜不著色,胞核呈紫藍(lán)色。在癌組織和慢性炎性鼻咽黏膜中均有表達(dá)，炎性鼻咽黏膜組織可見少量著色。癌組織中陽性分布呈異質(zhì)性,且染色程度存在差異，在癌巢附近的腫瘤細(xì)胞染色更為明顯（圖1～5）。由于細(xì)胞的陽性強(qiáng)度分組統(tǒng)計無統(tǒng)計學(xué)意義，故在統(tǒng)計中合并一起作為陽性例數(shù)作為分析研究。

圖1 Gli1蛋白在鼻咽炎性黏膜組織中多為陰性表達(dá)，部分上皮弱陽性表達(dá).×200

圖2 Gli1蛋白表達(dá)于鼻咽癌細(xì)胞胞核或胞漿中，呈棕黃色著色.×400

圖3 Gli1蛋白在癌巢附近的上皮細(xì)胞部分也呈陽性表達(dá).×200

圖4 Gli1蛋白表達(dá)在不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞多為弱陽性表達(dá).×200

圖5 Gli1蛋白表達(dá)在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞多為強(qiáng)陽性表達(dá).×200

表1 Glil在不同鼻咽組織中的表達(dá)

2 Glil的表達(dá)與NPC的臨床特征關(guān)系（表2-4）

Gli1蛋白表達(dá)均與年齡性別無關(guān)。統(tǒng)計上由于不同T分期各自例數(shù)較少，根據(jù)統(tǒng)計要求需要故將早期（T1期+T2期）和中晚期（T3期+T4期)病例分別合并統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)Gli1表達(dá)隨臨床浸潤程度升高其表達(dá)上調(diào),但無顯著性差異(P>0.05，見表3)。Gli1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。

表2 Glil的表達(dá)與NPC的臨床特征關(guān)系

表3 Glil的表達(dá)與鼻咽癌臨床T分期的關(guān)系

討論

N tisslein—Volhard等[4]于20世紀(jì)80年代首次在果蠅中發(fā)現(xiàn)了hed gehog(HH)基因，認(rèn)為在人體胚胎發(fā)育中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化的作用。而在人類基因組中，HH基因具有三個同源基因：Sonic hedgehog(Shh)，Desert hed gehog(Dhh)和 Indian hedgehog(Ihh)，分別編碼Shh，Dhh，Ihh蛋白。其中Shh研究最為廣泛，位于7號染色體長臂的3區(qū)6帶(7q36)編碼一種與早期胚胎發(fā)育密切相關(guān)的分泌蛋白，在人體多種細(xì)胞組織中都有分布。新近的研究表明[5]，Shh蛋白參與到了基因的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞因子以及某些功能蛋白的表達(dá)，器官的正常構(gòu)建，腫瘤的發(fā)生等一系列事件。Shh的信號傳導(dǎo)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)包括以下相關(guān)分子的參與[6]：兩個細(xì)胞膜跨膜蛋白Patched(Ptch)和Smoothened(Smo)蛋白，鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族Gubitus interruptus(Gi)。在脊椎動物體內(nèi)，Ptch具有Ptchl和Ptch2兩者亞型，而Smo為七次跨膜的單一肽鏈，在脊椎動物中Gi又稱Gli家族，具有Glil，Gli2，Gli3三種亞型。靜止?fàn)顟B(tài)下Ptch與Smo結(jié)合形成復(fù)合體，使得Smo的活性被抑制，當(dāng)Shh出現(xiàn)時，Shh可競爭性的與靶細(xì)胞膜上的Ptch結(jié)合，從而解除Ptch對Smo的抑制，Smo發(fā)生活化。在脊椎動物體內(nèi)，Gli可與Costal2蛋白，Sup—pressor of Fused(SuFu)蛋白，F(xiàn)used激酶形成蛋白復(fù)合物，活化的Smo可磷酸化該復(fù)合物，使得Gli被釋放出來活化的Gli即可進(jìn)入細(xì)胞核，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。而這些靶基因包括了諸如Wnt，Nmyc，Gas1等與人體正常胚胎發(fā)育，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，血管的形成等密切相關(guān)的基因，從而調(diào)控著細(xì)胞的生長，分化與增殖等過程。

表4 Glil的表達(dá)與鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

GLI1基因[8]定位于人類12號染色體q13.2-13.3,為編碼鋅指蛋白家族成員之一。它包括Gli1, Gli2,Gli3。其中Gli1,Gli2主要激活Shh通路下游基因轉(zhuǎn)錄功能，而Gli3則起抑制作用。其中，Gli1是Shh通路下游中起最主要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Gli1通過與CyclinD2、VEGF、Bcl-2等目的基因特定序列結(jié)合，直接上調(diào)這些目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用[9]。目前證實[10]，Glil可能通過以下機(jī)制直接誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生：①誘導(dǎo)G／S期細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖；②直接誘導(dǎo)抗凋亡因子B c l-2的表達(dá)以抑制凋亡；③直接促進(jìn)上皮組織向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化，使腫瘤的侵襲性增強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中的G1i1表達(dá)率52%，而鼻咽炎性組織僅陽性率為（19.2%）說明在鼻咽癌組織中G1i1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。在有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者G1i1表達(dá)率63.3%明顯高于無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者（35%），說明G1i1表達(dá)促進(jìn)了鼻咽的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，據(jù)報道[11]Shh信號通路的轉(zhuǎn)錄因子G1i1蛋白在胰腺癌細(xì)胞中存在旁分泌形式，是腫瘤微環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因素，可以促進(jìn)腫瘤的血管和淋巴管新生。這些研究結(jié)果說明，Shh信號通路的異常激活通過G1i1蛋白可能促進(jìn)腫瘤淋巴管新生。進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴管侵襲和轉(zhuǎn) 移。同時，本研究中NPC組織G1i1表達(dá)隨浸潤程度進(jìn)展有所增高但無顯著性差異，可能與病變階段不同，例數(shù)過少等有關(guān)。劉剛等[12]也在對鼻咽癌干細(xì)胞的MiRNA的研究發(fā)現(xiàn)多種標(biāo)志物與鼻咽癌臨床分期無相關(guān)性，但與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，對它們的深入研究了解鼻咽癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制才有可能提高有效的治愈率。

因此，G1i1蛋白在鼻咽中的表達(dá)可以作為 判斷鼻咽癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要指標(biāo),鼻咽癌組織中異常激活的Shh信號通路中其下游轉(zhuǎn)錄因子Glil蛋白可能直接參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，有可能成為鼻咽癌轉(zhuǎn)移標(biāo)記物和生物學(xué)治療新的靶點。

1 Barakat MT，Humke EW，Scott MP.Learning from Jekyll tocontrol hyde：Hedgehog signaling in develop ment and cancer[J]．Trends MolMed，2010，16(8)：337-348.

2 Kawabata A，Kawao N．Physiology and pathophysiology of proteinase—activated receptors(PARs)：PARs in the respiratory system：cellularsignaling and physiological／pathological roles[J]．J Pharmacol Sci．2005 Jan；97(1)：20-24.

3 陳筠，張雙衛(wèi)，王銀全．苦參堿對人膽管癌細(xì)胞QBC939增殖和凋亡的影響[J]．中華實驗外科雜志，2005，22(5)：627-627．

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6 Ruiz i Ahaba A，Sanchez P，D ahmane N．Gliad hedgehog in cancer：tumours，embr yos and stem cens[J]．Nature Rev Cancer，2002，2：361-372．

7 Yang L，Xie G，F(xiàn)an Q，et a1．Activation ofthe hedgehog—signaling pathway in human cancer and the clinical implications[J]．Once—gene，2010，29：469-481．

8 Yao S，Lum L，Beachy P．The ihog cell-surface proteins bind Hedge—hog and mediate pathway activation[J]．Cell，2006，125(3580)：343-357．

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10 馮福彬，莊靜，劉瑞娟.Hedgehog信號通路相關(guān)蛋白Gli1在乳腺癌組織中的表達(dá)及其意義，臨床腫瘤學(xué)雜志,2015，20（2):112-115.

11 夏含笑,劉陶文.Hedgehog信號通路對腫瘤脈管新生調(diào)控的研究進(jìn)展,實用醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(3)：496-498.

12 劉剛，田道法，張莉，等.鼻咽癌干細(xì)胞miRNA表達(dá)研究.中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志，2014,22(5):327-332.

13 中國鼻咽癌臨床分期工作委員會.鼻咽癌92分期修訂工作報告[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志，2009,18(1):2-6.

（收稿:2016-06-07 修回：2016-07-01）

Expressive level assaying of transcript factor GLI1 in the downstream of Hedgehog signaling pathway in nasopharyngeal carcinoma tissues

YAO Li,NIE Guohui,CAI Zhi,LU Xing
Department of Otolaryngology,Beijing University Shenzhen Hospital,Guangdong,518036,China

Objective To detect the expressive level of GLI1 in the tissue samples of nasopharyngeal carcinoma (NPC)to evaluate its implications in clinical pathology of NPC cases.MethodsThe expressive level of GLI1 was determined by immunohistochemistry in the tissue specimens from 50 NPC cases,with the tissue samples from 26 cases of chronic nasopharyngitis as controls.Then,analyzed were its implications of changing in expressive level in clinical pathology in a comparative way.Results The expressive activity of Gli1 was significantly elevated in NPC tissue samples than that in controlling ones of chronic nasopharyngitis tissue(P<0.05),with an obvious correlation between the expressive level of GLI1 and the status of cervical lymph node metastasis(P< 0.05).Furthermore,it was shown that there was an increased tendency in the expressive level of Gli1 with infiltrating degree of tumor cell in the focus tissue while no significantly statistical significance found(P>0.05).The expressive activity of Gli1 was significantly elevated in NPC tissue samples than that in controlling ones of chronic nasopharyngitis tissue(P<0.05),with an obvious correlation between the expressive level of GLI1 and the status of cervical lymph node metastasis(P<0.05).Furthermore,it was shown that there was an increased tendency in the expressive level of Gli1 with infiltrating degree of tumor cell in the focus tissue while no significantly statistical significance found (P>0.05).Conclusions As a transcript factor in the downstream of Hedgehog signaling pathway in NPC cells,abnormal activation of GLI1 may play an important role in the initiation and development of NPC.Therefore,it can be taken as an ideal molecular target for diagnosis and therapy of NPC in future.

Nasopharyngeal carcinoma;GLI1 protein;Expressive activity;Clinical pathological implications

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.05.001

廣東省深圳市科技計劃項目（編號：201302072）

1廣東省深圳市北京大學(xué)深圳醫(yī)院耳鼻咽喉科（518036）

陸興，主任醫(yī)師.Email:yllp20@tom.com