HPLC-ELSD法檢測(cè)蜂蜜飲料中4種可溶性糖含量

陳金斌

（溫嶺市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江溫嶺317500）

HPLC-ELSD法檢測(cè)蜂蜜飲料中4種可溶性糖含量

陳金斌

（溫嶺市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，浙江溫嶺317500）

建立一種用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)法測(cè)定蜂蜜飲料中葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈-水提取，過濾膜后上機(jī)檢測(cè)。采用ZORBAX糖分析色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）分離，以乙腈︰水（30︰70，體積比）作為流動(dòng)相，用蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，4種糖組分在0.05 g/100mL～1.00 g/100mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.993～0.997，檢出限在0.005 g/100mL～0.010 g/100mL，定量限為0.015 g/100mL～0.030 g/ 100mL，加標(biāo)回收率達(dá)到89.4%～97.5%。該方法具有前處理簡單、靈敏度高和檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)，適用于蜂蜜飲料中葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖的定量檢測(cè)。

高效液相色譜；ELSD；蜂蜜飲料；糖

蜂蜜是藥食同源的天然保健食品，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，一直深受消費(fèi)者的青睞。蜂蜜中固體物質(zhì)有95.0%～99.9%是糖類，占總成分的70%～80%，這些糖分以單糖為主（即葡萄糖和果糖），通常占蜂蜜總成分的60%以上[1]；其次是雙糖，雙糖中以蔗糖占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其含量從0到5%；其余是麥芽糖、海藻糖、松二糖和昆布二糖等[2]。蜂蜜飲料，是指以蜂蜜為主要原料的系列飲料，不僅具有很好的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)也為蜂蜜的深加工提供了一條新途徑。常見的蜂蜜飲料有蜂蜜柚子茶、刺梨果蜂蜜汁、蜂蜜速溶茶、蜂蜜胡蘿卜汁等，深受消費(fèi)者喜愛。

然而，消費(fèi)者在飲用這一系列的飲料時(shí)，往往忽視其高糖分飲料容易帶來身體危害的事實(shí)。本試驗(yàn)就針對(duì)此，測(cè)定其中主要的4種糖分即葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖的含量。目前，食品中糖含量的測(cè)定有滴定分析法[3]、氣相色譜法[4]、液相色譜法[5-7]和離子色譜法[8-9]等，但結(jié)合糖類物質(zhì)自身易溶于水、低揮發(fā)性、不易電離等特點(diǎn)，液相色譜法是目前較理想、實(shí)用的檢測(cè)方法。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18932.22-2003《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測(cè)定方法液相色譜示差折光檢測(cè)》[10]中采用液相色譜配示差折光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。但示差折光檢測(cè)器依據(jù)折射率的變化對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，極易受溫度、流動(dòng)相梯度等條件的影響，導(dǎo)致譜圖基線漂移，靈敏度偏低，實(shí)際應(yīng)用并不理想。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）基于樣品顆粒對(duì)光的散射與質(zhì)量呈指數(shù)關(guān)系進(jìn)行測(cè)定，與被測(cè)物質(zhì)的官能團(tuán)和光學(xué)性質(zhì)無關(guān)[11-12]，且受溫度、梯度洗脫等試驗(yàn)條件影響小，適合于無紫外吸收或只有紫外末端吸收、低揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695型高效液相色譜系統(tǒng)（配2424型ELSD檢測(cè)器）：Waters。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、果糖標(biāo)準(zhǔn)品、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品：購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇、乙腈為色譜純。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機(jī)購買市場(chǎng)上銷售的蜂蜜飲料。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX糖分析色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.2mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃。

1.4 方法

1.4.1 流動(dòng)相體系對(duì)糖分色譜行為的影響

固定流動(dòng)相流速1.2mL/min，配制不同比例的流動(dòng)相Ⅰ（乙腈∶水=40∶60，體積比）、流動(dòng)相Ⅱ（乙腈∶水=30∶70，體積比）、流動(dòng)相Ⅲ（乙腈∶水=20∶80，體積比）、流動(dòng)相Ⅳ（乙腈∶水=10∶90，體積比），考察不同流動(dòng)相體系對(duì)4種糖分色譜行為的影響。

1.4.2 ELSD條件的優(yōu)化

ELSD的兩個(gè)較重要的參數(shù)分別是漂移管溫度和載氣流速（或者載氣壓力），兩者對(duì)組分的保留時(shí)間影響較小，但對(duì)信噪比（S/N）的影響較大，一般建立適當(dāng)?shù)腍PLC-ELSD分析方法時(shí)，需對(duì)這兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 g/ 100mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

蜂蜜飲料中除了固有的一些食品基質(zhì)外，還含有很多的人為添加的營養(yǎng)元素，成分復(fù)雜，對(duì)前處理要求高，所以本試驗(yàn)樣品前處理對(duì)3種不同的提取液Ⅰ：甲醇-水（體積比1∶1）、提取液Ⅱ：乙醇-水（體積比1∶1）、提取液Ⅲ：乙腈-水（體積比1∶1）進(jìn)行比較，以樣品加標(biāo)平均回收率為比較依據(jù)，制定較優(yōu)的前處理?xiàng)l件。

1.4.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

以市售蜂蜜飲料為基質(zhì)，加入4種糖分的混標(biāo)溶液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相體系對(duì)糖分色譜行為的影響

由于ELSD在霧化過程中需將流動(dòng)相及樣品溶劑揮發(fā)，形成被測(cè)樣品微顆粒進(jìn)行散射光檢測(cè)，因此，試驗(yàn)中不使用不易揮發(fā)的緩沖鹽（如乙酸銨等）進(jìn)行色譜行為的調(diào)節(jié)。試驗(yàn)考察不同比例的流動(dòng)相Ⅰ（乙腈∶水=40∶60，體積比）、流動(dòng)相Ⅱ（乙腈∶水=30∶70，體積比）、流動(dòng)相Ⅲ（乙腈∶水=20∶80，體積比）、流動(dòng)相Ⅳ（乙腈∶水=10∶90，體積比）對(duì)4種糖分分離效果的影響。結(jié)果表明：流動(dòng)相中水的比例對(duì)容量因子影響顯著，隨水含量的增加，各組分保留時(shí)間明顯提前，容量因子逐步減小。當(dāng)水含量高于40%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，果糖、葡萄糖峰形重疊。其中流動(dòng)相Ⅱ（乙腈∶水=30∶70，體積比）的分離度最好，果糖、葡萄糖能分開，并且可得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時(shí)間合適，如圖1所示。

圖1 葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖的色譜圖Fig.1 The chrom atogram of glucose，fructose，sucrose，maltose

2.2 ELSD條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了不同載氣流速（載氣壓力）1.5（20 psi）、2.0（30 psi）、2.5（40 psi）、3.0 L/min（50 psi）和不同漂移管溫度40、50、60、70、80℃對(duì)檢測(cè)響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明：載氣流速對(duì)響應(yīng)值的影響比漂移管溫度對(duì)響應(yīng)值的影響明顯。結(jié)合試驗(yàn)中液相色譜的流量，合理的載氣流速可以保證被測(cè)樣品微霧滴的有效形成。漂移管溫度的調(diào)節(jié)更多地體現(xiàn)在對(duì)基線噪聲的影響上。當(dāng)被測(cè)樣品以微霧滴形式進(jìn)入漂移管時(shí)，比表面積的大幅增加使溶劑的揮發(fā)溫度遠(yuǎn)低于通常的沸點(diǎn)，隨著溫度的升高，目標(biāo)物峰面積的變化趨緩，噪聲增加，信噪比反而下降。

保持漂移管溫度60℃，以0.05 g/100mL 4種糖分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的信噪比（S/N）考察最佳載氣流速。結(jié)果表明：載氣流速過小，霧化不充分，過大則可能導(dǎo)致目標(biāo)物的損失，信號(hào)值降低。載氣流速由1.5 L/min升至3.0 L/min時(shí)，各組分的信噪比隨載氣流速呈拋物線變化；當(dāng)載氣流速為2.0 L/min時(shí)，信噪比達(dá)到最高，試驗(yàn)選擇載氣流速為2.0L/min。保持載氣流速為2.0L/min，調(diào)節(jié)不同漂移管溫度，試驗(yàn)考察了0.05 g/100mL 4種糖分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積變化情況。結(jié)果表明：漂移管溫度在40℃～90℃之間時(shí)，峰面積呈下降趨勢(shì)，但幅度不明顯，尤其高于60℃后變化更趨平緩，考慮到溫度太低溶劑揮發(fā)不完全，基線不穩(wěn)，試驗(yàn)選擇漂移管溫度為60℃。

在載氣流速為2.0 L/min、漂移管溫度60℃條件下，一款蜂蜜飲料中檢測(cè)出葡萄糖、果糖和蔗糖的色譜圖如圖2所示。

圖2 蜂蜜飲料中葡萄糖、果糖和蔗糖的色譜圖Fig.2 The chrom atogram sof glucose，fructose，sucrose in honey drink

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗(yàn)證4種糖分在乙腈∶水=30∶70（體積比）流動(dòng)相體系中的線性關(guān)系，配制了葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 g/100mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗(yàn)結(jié)果表明，4種糖分在0.05 g/100mL～1.00 g/100mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的性噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到4種目標(biāo)組分的LOD和LOQ分別為0.005 g/100mL～0.010 g/100mL和0.015 g/100mL～0.030 g/100mL，結(jié)果見表1。

表1 4種糖分的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection lim itand quantitative lim itof four kindssugar

2.4 提取液的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn) [10，13]，針對(duì)于樣品提取液的選擇，分別選用提取液Ⅰ、提取液Ⅱ、提取液Ⅲ來進(jìn)行比較，分別稱取2.0 g試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入提取液定容至刻度，旋渦振蕩2min，用0.45μm濾膜將樣液過濾入樣品瓶中供液相色譜測(cè)定。

試驗(yàn)結(jié)果以4種糖分的平均回收率為比較依據(jù)，如圖3所示，乙腈-水（體積比1∶1）作為提取液效果最好，4種糖分的回收率較好。

圖3 提取液選擇對(duì)4種糖分平均回收率的影響Fig.3 Theeffectof extract solution on theaverage recovery rate for the four kindsof sugar

2.5 樣品的測(cè)定及加標(biāo)回收

在我們隨機(jī)抽取的20個(gè)批次的蜂蜜飲料樣品中，根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果選擇優(yōu)化后儀器條件，選擇乙腈-水（體積比1∶1）溶液提取，過濾后上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果表明：在所檢測(cè)的運(yùn)動(dòng)飲料樣品中，果糖值在13.5mg/g～24.6 mg/g之間，葡萄糖值在12.3 mg/g～20.5 mg/g之間，蔗糖值在9.4mg/g～56.5 mg/g之間，麥芽糖值在0.2mg/g～2.4mg/g之間。加標(biāo)回收試驗(yàn)中，在加標(biāo)濃度為0.50 g/100mL的飲料樣品中，4種糖分的加標(biāo)回收率在89.4%～97.5%之間，符合檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

本文建立了一種高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)蜂蜜飲料中葡萄糖、果糖、蔗糖以及麥芽糖的分析方法。結(jié)果表明，在乙腈∶水=30∶70（體積比）流動(dòng)相體系中，在載氣流速為2.0 L/min、漂移管溫度60℃的條件下葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖4種組分能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時(shí)間合適。樣品在經(jīng)提取液：乙腈-水（體積比1∶1）的提取下，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的凈化，準(zhǔn)確有效地檢測(cè)蜂蜜飲料中的葡萄糖、果糖、蔗糖以及麥芽糖。

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Determ ination of 4 Kinds Soluble Sugar in Honey Drink by HPLC-ELSD

CHEN Jin-bin
（Wenling Food and Drug Inspection Center，Wenling317500，Zhejiang，China）

A rapid and effectivemethod was established for the determination of glucose，fructose，sucrose，maltose in honey drink by high performance liquid chromatography-ELSD detectionmethod.The sampleswere extracted by acetonitrile-water，and detected on themachineafter filteringmembrane.The separation of targeted compoundwasperformed on a ZORBAX sugaranalysischromatography column（4.6mm×250mm，5μm）using acetonitrile：water（30∶70，volume ratio）asmobile phase，with ELSD detectorand external standardmethod peak area quantification.The linear range of four kindssugarwas in the rangeof0.05 g/100mL-1.00 g/100mL with a correlation coefficientof 0.993-0.997.The detection limitwas 0.005 g/100mL-0.010 g/100mL and the quantitative limitwas0.015 g/100mL-0.030 g/100mL.The recovery ratewas89.4%-97.5%.Themethod has theadvantagesofsimplepretreatment，good purifying effect，high sensitivity and fastdetection rate，and issuitable for the quantitative detection ofglucose，fructose，sucroseandmaltose in honey drink.

high performance liquid chromatography（HPLC）；ELSD；honey drink；sugar

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.033

2016-08-01

陳金斌（1983—），男（漢），工程師，本科，研究方向：食品中農(nóng)藥獸藥殘留、食品中添加劑、食品中微量元素等檢測(cè)。