茶樹(shù)CsSMT基因的克隆、原核表達(dá)及植物超表達(dá)載體構(gòu)建

劉聲傳，鄢東海，周 雪，曹 雨，莫 雪，胡伊然，周玉鋒

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

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茶樹(shù)CsSMT基因的克隆、原核表達(dá)及植物超表達(dá)載體構(gòu)建

劉聲傳，鄢東海，周 雪，曹 雨，莫 雪，胡伊然，周玉鋒*

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

為了發(fā)掘利用茶樹(shù)(Camelliasinensis)富硒關(guān)鍵酶硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Selenocysteine methyltransferase, SMT)基因CsSMT，基于寧州2號(hào)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，通過(guò)RACE克隆該基因的cDNA全長(zhǎng)，并通過(guò)原核表達(dá)和蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)驗(yàn)證該基因，然后構(gòu)建超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌。結(jié)果表明：該基因cDNA全長(zhǎng)為1277 bp，開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)為1 050 bp，與NCBI公布的茶樹(shù)該基因ORF序列有8個(gè)點(diǎn)突變，且缺少GTCGTC序列。CsSMT基因編碼349個(gè)氨基酸，其氨基酸序列與毛果楊、野生大豆、黃芪的SMT以及川桑的同型半胱氨酸-S-甲基轉(zhuǎn)移酶2(Homocysteine-S-methyltransferase 2, HMT2)的氨基酸序列有較高的相似性。目標(biāo)蛋白分子量約38 kDa，為水溶性蛋白，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。成功構(gòu)建CsSMT基因的超表達(dá)載體，并獲得攜帶CsSMT的農(nóng)桿菌菌株。

茶樹(shù)；硒；CsSMT；原核表達(dá)；超表達(dá)

硒是人體必需的微量元素，對(duì)人體具有抗氧化、抗克山病、抗節(jié)骨病、抗心臟病、抗甲狀腺機(jī)能減退及抗癌等保健功能[1]。雖未證明硒是植物的必須營(yíng)養(yǎng)元素，但有研究報(bào)道[2-3]植物適量吸收累積硒可促進(jìn)其生長(zhǎng)、抗氧化脅迫和抗病蟲(chóng)害等。據(jù)地質(zhì)學(xué)家考證[4]：我國(guó)72 %的地區(qū)屬于缺硒地區(qū)，2/3的人口存在不同程度的硒攝入量不足。一些植物可吸收有毒的無(wú)機(jī)硒，轉(zhuǎn)換成對(duì)人體安全保健的天然有機(jī)硒。茶為當(dāng)今世界上最受歡迎的一種天然健康飲料，茶樹(shù)(Camelliasinensis)葉片具有富集硒的功能，可為人體提供硒源[5]。但高濃度的硒對(duì)動(dòng)植物有毒害作用，故很有必要研究茶樹(shù)等農(nóng)作物的硒代謝，挖掘關(guān)鍵酶基因，培育或改良富硒作物。

甲基硒代半胱氨酸(Methylselenocysteine，MeSeCys)是一種氨基酸衍生物，具抗癌功能。花菜(Brassicaoleracea)、蔥屬(Allium)、黃芪(Astragalusbisulcatus)和茶樹(shù)等一些植物可合成這種非蛋白質(zhì)硒氨基酸，減少硒對(duì)蛋白質(zhì)的摻入，解除硒對(duì)這些植物的毒害[6-8]。硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Selenocysteine methyltransferase, SMT)是植物硒代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，催化硒代半胱氨酸進(jìn)行甲基化反應(yīng)生成MeSeCys。最先從黃芪中克隆到AbSMT基因[9]，此后在花菜[10]、茶樹(shù)[11]等作物中相繼克隆了該基因。AbSMT轉(zhuǎn)擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6]和煙草(Nicotianatabacum)[12]使宿主MeSeCy含量顯著增加，表明利用該基因，通過(guò)遺傳工程可在相關(guān)作物中合成MeSeCys，以及減少硒的毒害。2008年已從茶樹(shù)中克隆了CsSMT，但序列的準(zhǔn)確性及品種間的差異性有待驗(yàn)證，該基因體外表達(dá)研究尚少。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，為高效發(fā)掘克隆重要基因帶來(lái)新途徑。為此，本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)合RT-PCR與RACE克隆技術(shù)，從茶樹(shù)葉片中克隆到該基因的cDNA全長(zhǎng)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，原核表達(dá)及蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)驗(yàn)證，構(gòu)建植物超表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究其酶學(xué)特性和調(diào)控茶樹(shù)硒代謝的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種：寧州2號(hào)(NZ2)，采自國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹(shù)圃。

菌株、載體及試劑：Qiagen RNeasy Plant Mini Kitaccording試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。TaKaRaTaqTM酶、TaKaRa LATaq酶、rTaq酶、PrimeSTAR@HS (Premix)、dATP、E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞、E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109、感受態(tài)細(xì)胞BL21T1R、PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、T-Vector pMD20、DNA Ligation Kit、SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒、原核表達(dá)載體pCold TF、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) LBA4404 Electro-Cells、植物超表達(dá)載體pRI101-AN、NdeI酶和BamH I酶均購(gòu)自TaKaRa公司。AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。

1.2 目的基因cDNA的全長(zhǎng)克隆

基于筆者前期茶樹(shù)耐旱機(jī)理研究的NZ2的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/297732)。經(jīng)BLASTx比對(duì)，將獲得缺5'端的CsSMT基因EST片段。設(shè)計(jì)5′ 擴(kuò)增引物，進(jìn)行5′ RACE PCR擴(kuò)增，獲得缺失片段，利用DNAstar軟件，拼接獲得全長(zhǎng)序列。引物設(shè)計(jì)均使用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)反向嵌套引物CsSMT5′端第1輪擴(kuò)增引物 TGCAGCAACCTCCGACAAGGGAC和CsSMT5′端第2輪擴(kuò)增引物GCAATGGCAGCGCATTCAAGCAA。引物合成、測(cè)序均由上海華津生物有限公司完成。

采用Qiagen試劑盒(Qiagen，德國(guó))提取茶葉總RNA，采用RACE試劑盒擴(kuò)增5′，AxyPrep DNA試劑盒回收目的片段，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化，菌落PCR鑒定，測(cè)序[13]。采用NCBI的ORF Finder尋找目的基因ORF序列，以此設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ORF，CsSMT全長(zhǎng)擴(kuò)增引物：正向引物GGGTGTTATGTTCTTGGTG和反向引物TGTCAGTTAATCAGTGGGAT，利用PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第1鏈，連接至T-Vector pMD20，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定、測(cè)序方法同RACE 5′擴(kuò)增。

1.3 目的基因生物信息學(xué)分析

BLASTx比較分析目的基因大小、序列方向、同源性，采用NCBI的ORF Finder程序分析目的基因的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORF)，用DNAstar查閱ORF并翻譯成氨基酸序列，編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)采用Protparam分析，ProtScale程序預(yù)測(cè)疏水性/親水性，采用TMHMM2.0程序預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域、SignalP4.1程序分析信號(hào)肽及TargetP1.1程序分析亞細(xì)胞定位，蛋白磷酸化位點(diǎn)采用NetPhos2.0程序分析，用ClustalX軟件對(duì)目的基因編碼的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源比對(duì)，利用Mega5.05軟件對(duì)目的基因的氨基酸與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。序列分析所用各種工具網(wǎng)址見(jiàn)表1。

表1 對(duì)目的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析所用的主要工具

1.4 CsSMT基因原核表達(dá)

將帶有目的基因的重組質(zhì)粒T-Vector pMD20經(jīng)NdeI和BamH I雙酶切，同時(shí)，pCold TF經(jīng)NdeI和BamH I雙酶切。然后，利用DNA Ligation Kit將CsSMT基因和pCold TF片段在16 ℃下過(guò)夜連接，熱轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109中，涂布平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，菌落PCR鑒定，測(cè)序。

選擇經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的重組pCold TF表達(dá)載體1.0 μl轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21T1R中。取35 μl轉(zhuǎn)化液涂布于LB (Amp100 μg/mL)平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。分別挑取單菌落至2 mL LB (Amp 100 μg/mL)液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。取培養(yǎng)菌液100 μl，添加至含5 mL LB (Amp 100 μg/mL)培養(yǎng)基的玻璃管中，37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm值約為0.6，15 ℃靜置15 min，添加100 mmol/L IPTG 50 μl進(jìn)行誘導(dǎo)，15 ℃繼續(xù)培養(yǎng)22 h。取集菌后2 OD相當(dāng)?shù)木w加入320 μl PBS懸濁后進(jìn)行超聲波破碎，對(duì)菌體破碎液進(jìn)行離心分離(12 000 r/min，5min)。取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8 μl(濃度相當(dāng)于0.05 OD)，加入2 μl 5×SDS Loading Buffer，95 ℃加熱10 min，以12.5 % polyacrylamide gel進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳結(jié)束后，CBB-R250染色，使用脫色液脫色。

1.5 CsSMT基因原核表達(dá)Western blotting驗(yàn)證

Western blotting樣品電泳對(duì)照：取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8 μl(濃度相當(dāng)于0.05 OD)，加入2 μl 5×SDS Loading Buffer，95 ℃加熱10 min，使用彩色Marker及組氨酸標(biāo)簽Marker，12.5 %聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

Western Blotting：將PVDF膜、濾紙分別剪切成與凝膠相同大小，使用轉(zhuǎn)膜緩沖液處理后，按濾紙、PVDF膜、凝膠和濾紙的順序依次放在轉(zhuǎn)膜儀電極板之間，開(kāi)始轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后，將PVDF膜置于含1.5 % BSA的10 mL Blocking buffer中，4 ℃平放過(guò)夜封閉。使用稀釋后的Penta-His Antibody溶液5 mL，進(jìn)行1 h抗體反應(yīng)1 次。TBST 緩沖液(20 mL)洗滌2

次，TBS緩沖液沖洗3次。使用稀釋后的HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG 抗體溶液5 mL，進(jìn)行1 h抗體反應(yīng)2次。TBST 緩沖液(20 mL)洗滌2次，TBS 緩沖液沖洗3次。1 mL TrueBlue Peroxidase Substrate顯色1 min。

1.6 植物超表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

將帶有目的基因的重組質(zhì)粒T-Vector pMD20經(jīng)NdeI和BamH I雙酶切，同時(shí)，pRI101-AN經(jīng)NdeI和BamH I雙酶切。然后，利用DNA Ligation Kit將CsSMT基因和pRI101-AN片段在16 ℃下過(guò)夜連接，得到重組質(zhì)粒pRI101-AN。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，菌落PCR鑒定，測(cè)序。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化：篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒pRI101-AN，根癌農(nóng)桿菌LBA4404 Electro-Cells，涂布LB平板(含Kan和Str)，30 ℃培養(yǎng)48 h。挑單克隆菌落轉(zhuǎn)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌液PCR驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因cDNA全長(zhǎng)克隆

經(jīng)BLASTx比對(duì)，獲得了缺5′端的、長(zhǎng)度為720 bp的CsSMT基因EST片段。以EST序列為模板進(jìn)行5′ RACE擴(kuò)增，獲得缺失片段約500 bp(圖1 A)。將克隆得到的5′端序列與原有EST序列拼接，初步獲得目的基因全長(zhǎng)1277 bp。通過(guò)對(duì)ORF的cDNA克隆測(cè)序，獲得ORF擴(kuò)增后全長(zhǎng)1114 bp(圖1 B)。進(jìn)一步BLASTx比對(duì)，最終得到目的基因ORF全長(zhǎng)1 050 bp，其編碼349個(gè)氨基酸，且與拼接結(jié)果相同。

NZ2的CsSMT的cDNA序列與NCBI上公布的祁門(mén)種的CsSMT序列(DQ480337.1)比對(duì)結(jié)果顯示，2個(gè)品種CsSMT的相似性為98.4 %，在起始密碼子32 bp后，NZ2的CsSMT缺少GTCGTC。此外，在ORF內(nèi)有8個(gè)單堿基變異，在ORF外也存在點(diǎn)突變(圖2)。

A.CsSMT的5′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物；B.CsSMT的開(kāi)放閱讀框擴(kuò)增產(chǎn)物A.amplification products of 5′RACE for CsSMT; B.amplification products of ORF of CsSMT 圖1 CsSMT目的基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RACE-amplification of target gene of CsSMT

圖2 2個(gè)茶樹(shù)品種的CsSMT 的cDNA序列比對(duì)Fig.2 The cDNA sequence alignment of CsSMT in two tea cultivars

2.2 目的基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)

CsSMT基因編碼產(chǎn)物分子量為37 937.8 Da，理論等電點(diǎn)為5.00，分子式為C1661H2637N457O528S15。不穩(wěn)定指數(shù)為37.54(不穩(wěn)定指數(shù)>40時(shí)不穩(wěn)定)，表明此蛋白穩(wěn)定。脂肪指數(shù)為91.46，總平均親水性為-0.139，表明該蛋白為親水性蛋白。此外，經(jīng)ProtScale程序分析，氨基酸序列多數(shù)位于親水區(qū)域，該蛋白為親水蛋白(圖3A)。經(jīng)TMHMM2.0分析，編碼產(chǎn)物均位于細(xì)胞膜表面，屬非跨膜蛋白(圖3B)。TargetP1.1分析表明，該蛋白沒(méi)有定位于葉綠體和線粒體。通過(guò)軟件SignalP4.1信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白的信號(hào)肽分值(S值)均值<0.5(S信號(hào)肽平均值>0.5表示存在信號(hào)肽，為分泌蛋白)，表明該蛋白無(wú)信號(hào)肽(圖3C)。利用NetPhos 2.0分析表明，該蛋白存在絲氨酸磷酸化(pSer)、蘇氨酸磷酸化(pThr)和酪氨酸磷酸化(pTyr)3種主要的氨基酸磷酸化位點(diǎn)，酸化位點(diǎn)共24個(gè)(pSer: 15，pThr: 4，pTyr: 5)，以絲氨酸磷酸化為主(圖3D)。

2.3 氨基酸多序列的相似性和同源性

利用BLASTp將目的基因編碼產(chǎn)物氨基酸序列與其他植物比對(duì)，結(jié)果顯示CsSMT氨基酸序列與以下植物同源性較高：毛果楊(Populustrichocarpa)SMT(84.8 %)、野生大豆SMT (Glycinesoja)(78.7 %)、黃芪SMT(76.3 %)、花菜SMT(72.4 %)、川桑(Morusnotabilis)(Homocysteine S-methyltransferase 2, HMT2)(80.3 %)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)HMT2(74.0 %)、毛果楊HMT3(69.0 %)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)HMT(67.2 %)和樹(shù)棉花(Gossypiumarboreum)HMT3(64.8 %)。經(jīng)氨基酸序列對(duì)比可知，不同物種SMT和HMT的兩末端以及約在114 aa至129 aa之間多態(tài)性較高，其他位置存在多個(gè)保守域(圖4)。

A.親水性/疏水性；B.跨膜結(jié)構(gòu)域；C.跨信號(hào)肽；D.磷酸化位點(diǎn)A. hydrophilicity or hydrophobicity; B. transmembrane region; C. signal peptide; D. phosphorylation圖3 目的基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Potential physicochemical characteristics of the target gene encoding protein

圖4 茶樹(shù)CsSMT及其直系同源基因編碼氨基酸序列的比對(duì)Fig.4 Protein sequence alignment of CsSMT and orthologous genes

圖5 茶樹(shù)CsSMT與其他植物同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化Fig.5 Phylogenetic relationship of CsSMT in tea plant with the homologous proteins from other plants

經(jīng)氨基酸序列的同源性比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，茶樹(shù)SMT與毛果楊、野生大豆、黃芪的SMT以及川桑的HMT2親緣關(guān)系較近，但與花菜SMT及其他植物的HMTs親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。

2.4 目的蛋白表達(dá)及Western blotting驗(yàn)證

SDS-PAGE顯示pCold TF質(zhì)粒載體約在52 kDa有1條明顯的外源蛋白條帶，重組質(zhì)粒pCold TF在90 kDa左右有1條明顯的外源蛋白條帶(圖6 AB)。除去52 kDa的融合表達(dá)標(biāo)簽，可得出實(shí)際誘導(dǎo)的茶樹(shù)SMT蛋白約為38 kDa，與理論值基本一致，且只有少量融合蛋白以包涵體的形式存在。Western blotting驗(yàn)證表明，帶有目的基因的重組質(zhì)粒pCold TF在低溫表達(dá)系統(tǒng)中有表達(dá)，目的蛋白約38 kDa，基本為可溶性表達(dá)(圖6 C)。

2.5 超表達(dá)載體的構(gòu)建及其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

利用NdeI和BamH I雙酶切T-Vector pMD20和pRI101-AN質(zhì)粒，將CsSMT基因連接于含有CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子的pRI101-AN超表達(dá)載體上(圖7A)。篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒pRI101-AN，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，PCR檢測(cè)超表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果(圖7B)顯示，約在2200 bp有1條明顯的條帶，除去約1100 bp的融合表達(dá)標(biāo)簽序列，可得出實(shí)際表達(dá)的目的基因約為1100 bp，與克隆結(jié)果一致。說(shuō)明，超表達(dá)載體的構(gòu)建及其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功，可用于下一步的轉(zhuǎn)基因研究。

A為SDS-PAGE分析，B為Western blotting 樣品電泳對(duì)照，C為PVDF膜圖。1為pCold TF全細(xì)胞，2為pCold TF上清，3為pCold TF沉淀，4為CsSMT融合蛋白全細(xì)胞，5為CsSMT融合蛋白上清，6為CsSMT融合蛋白沉淀，M為markerA.SDS-PAGE analysis; B.Electrophoresis of Western blotting samples for control; C. PVDF film; 1.Whole cell with pCold TF; 2. pCold TF supernatant; 3.pCold TF precipitate; 4.Whole cell with CsSMT fusion proteins; 5.Supernatant of CsSMT fusion proteins; 6.Precipitate of CsSMT fusion proteins; M. Marker圖6 CsSMT融合蛋白的SDS-PAGE及Western blotting分析Fig.6 Analysis of expressed CsSMT fusion proteins through SDS-PAGE and Western blotting

A.構(gòu)建的超表達(dá)載體；B.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的PCR檢測(cè)結(jié)果;M：markerA.Construction of overexpress vector; B. PCR examination result of its Agrobacterium transformation; M.Marker圖7 CsSMT基因超表達(dá)載體構(gòu)建示意圖與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Sketch map of overexpressed CsSMT plasmids and PCR examination result of its Agrobacterium transformation

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，為茶樹(shù)基因克隆及功能分析等提供了有利條件。本研究從茶樹(shù)中克隆了CsSMT基因的cDNA全長(zhǎng)序列，分析該基因的生物信息學(xué)，并通過(guò)原核表達(dá)驗(yàn)證該基因，為后續(xù)酶學(xué)研究和遺傳性狀改良奠定了基礎(chǔ)；成功構(gòu)建CsSMT基因的超表達(dá)載體及其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌株，可用于后續(xù)茶樹(shù)等其他作物轉(zhuǎn)基因研究。Brummell[14]通過(guò)轉(zhuǎn)SMT基因已獲得可富集MeSMT的西紅柿 (Solanumlycopersicum)。

本研究克隆的CsSMT的ORF全長(zhǎng)與NCBI公布的該基因有8個(gè)單堿基變異，在起始密碼子32 bp后，NZ2的ScSMT缺少GTCGTC。這些突變位點(diǎn)可能可用于富硒茶樹(shù)品種選育的分子標(biāo)記。如魏艷麗[15]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)咖啡堿合成酶(Tea caffeine synthase,TCS)基因TCS1的1個(gè)點(diǎn)突變與咖啡堿含量顯著相關(guān)。CsSMT基因中是否存在硒含量相關(guān)的功能突變位點(diǎn)，以及如何調(diào)控CsSMT的表達(dá)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

經(jīng)生物信息學(xué)分析，CsSMT編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，為親水蛋白，不具跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，不定位在葉綠體和線粒體，分子量約為38 kDa。原核表達(dá)及Western blotting驗(yàn)證表明，該蛋白為親水蛋白，分子量約為38 kDa。Sors[16]等認(rèn)為，SMT在擬南芥的胞液中發(fā)揮催化功能、定位于胞液中、不具跨膜結(jié)構(gòu)，本研究結(jié)果與其一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)SMT其他植物HMT的氨基酸序列同源性顯著，SMT可能與HMT具有相似的結(jié)構(gòu)和功能，其編碼基因可能起源于同一基因。Zhao等[17]通過(guò)比較擬南芥、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)等7種單子葉植物這2個(gè)基因的序列發(fā)現(xiàn)，SMT與HMT2具有很高的同源性，認(rèn)為SMT和HMT起源于同一基因。已有研究表明，SMT和HMT催化甲基轉(zhuǎn)移時(shí)以硫甲基蛋氨酸(S-methylmethionine)為甲基轉(zhuǎn)移供體，但體外試驗(yàn)證明，SMT和HMT分別選擇含硒(Se)域和含硫(S)域的底物為甲基受體[18]。一定程度證明SMT富集硒的專(zhuān)一性。茶樹(shù)等木本植物中有關(guān)SMT是否具有富集硫的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。植物硒代謝過(guò)程復(fù)雜，涉及一系列基因[19]。本研究只對(duì)茶樹(shù)富硒關(guān)鍵酶基因SMT進(jìn)行了初步分析與超表達(dá)載體構(gòu)建，而一些研究已證明ATP硫化酶(ATP sulfurylase，APS)和 胱硫醚-g-合成酶 (Cystathionine-g-synthase，CgS)也是一些植物硒富集的關(guān)鍵酶。如APS×SMT雙轉(zhuǎn)基因植物富集的MeSMT含量是對(duì)照的8倍，是SMT轉(zhuǎn)基因植物的2倍[20]。超表達(dá)CgS的芥菜(Brassicajuncea)富集的硒約為對(duì)照的40 %[21]。因此，還需挖掘植物硒富集的候選功能基因，理解植物硒的代謝調(diào)控機(jī)理，培育超富集硒植物用于硒污染修復(fù)，培育硒的累積量對(duì)作物、人體安全的優(yōu)良富硒農(nóng)作物。

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(責(zé)任編輯 劉忠麗)

Cloning and Prokaryotic Expression of Selenocysteine Methyltransferase Gene from Tea Plant and Its Plant Overexpression Vector Construction

LIU Sheng-chuan, YAN Dong-hai, ZHOU Xue, CAO Yu, MO Xue, HU Yi-ran, ZHOU Yu-feng*

(Guizhou Tea Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guizhou Guiyang 550006, China)

To explore the selenocysteine methyltransferase (SMT) geneCsSMT, which plays an essential role inCamelliasinensisleaves enriching selenium, based on transcriptome sequencing results ofCamelliasinensiscv. ‘Ningzhou 2’, the whole cDNA was obtained by RACE cloning. The target gene was identified by prokaryotic expression and western blotting, integrated into overexpression vector, and then transformed toAgrobacteriumtumefaciens. The results showed that the whole cDNA contained an open reading frame (ORF) of 1050 bp. In comparison toCsSMTORF published in NCBI, it had eight point mutations and missed GTCGTC. In the present study,CsSMTencoded 349 amino acids, and shared high similarity with SMT fromPopulustrichocarpa,Glycinesoja, andAstragalusbisulcatusas well as homocysteine-S-methyltransferase 2 (HMT2) inMorusnotabilis. CsSMT was a water-soluble protein and its molecular weight was approximately 38 kDa, which was consistent with the putative results. The authors successfully constructed the overexpression vector ofCsSMTand gained a strain ofA.tumefacienswith the target gene.

Tea plant; Selenium;CsSMT; Prokaryotic expression; Overexpression

1001-4829(2016)07-1540-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.07.008

2015-12-07

貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生科研創(chuàng)新基金項(xiàng)目“茶樹(shù)富硒作用關(guān)鍵酶基因CsSMT的克隆與超表達(dá)研究”[黔農(nóng)科合(創(chuàng)新基金)2011006]；貴州省體改項(xiàng)目“現(xiàn)代高效農(nóng)業(yè)園區(qū)茶葉栽培與加工技術(shù)集成示范”[黔科合Z字[2013]4008]；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目“貴定鳥(niǎo)王茶種質(zhì)資源的保護(hù)及開(kāi)發(fā)利用”[黔科合NY字[2011]3046]；貴州省農(nóng)業(yè)動(dòng)植物育種專(zhuān)項(xiàng)“黔茶1號(hào)區(qū)域適應(yīng)性高效栽培研究與示范”[黔農(nóng)育專(zhuān)字(2012)022號(hào)]，“貴定鳥(niǎo)王種擴(kuò)繁和栽培技術(shù)集成與示范”[黔農(nóng)育專(zhuān)字(2015)003]

劉聲傳(1981-)，男，副研究員，博士，從事茶樹(shù)資源與育種研究，E-mail: gtscliu@sohu.com， *為通訊作者。

S571.1

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