YDL080c基因缺失的低異戊醇釀酒酵母菌構建

楊 青，李 洲，周世水*

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006；2.汕尾市青梅產(chǎn)業(yè)研究院，廣東陸豐 516500)

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YDL080c基因缺失的低異戊醇釀酒酵母菌構建

楊 青1，李 洲2，周世水1*

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006；2.汕尾市青梅產(chǎn)業(yè)研究院，廣東陸豐 516500)

[目的]構建YDL080c基因缺失的低異戊醇生成的釀酒酵母菌。[方法]利用Cre-loxP重組系統(tǒng)與酵母電轉化法敲除釀酒酵母中編碼類丙酮酸脫羧酶的基因YDL080c，切斷釀酒酵母代謝中的異戊醇生成，從而構建一株低異戊醇生成的釀酒酵母菌株。[結果]成功構建出YDL080c基因缺失的工程酵母菌Y1，Y1釀造酒中相對異戊醇含量為0.81 g/L，比初始菌降低28.3%。[結論]利用基因敲除YDL080c的工程酵母菌能夠有效減少釀造酒中異戊醇的生成量。

基因敲除；異戊醇；釀酒酵母

蒸餾酒中除含乙醇、酯類和有機酸外，還含有異戊醇、異丁醇、正丙醇等高級醇。一般蒸餾酒中高級醇的含量偏高，在1.5 g/L[1]左右，酒中適當高級醇含量有利于酒的口感，但高級醇含量過高會使飲用者產(chǎn)生頭暈目眩的感覺，嚴重影響酒的品質。

蒸餾酒高級醇中異戊醇的含量約占50%，異戊醇在酵母釀造酒中主要通過Ehrlich代謝機制和Harris代謝機制[2-4]2種途徑產(chǎn)生。丙酮酸脫羧酶系是整個代謝過程中至關重要的酶系，敲除編碼丙酮酸脫羧酶系的基因會有效地降低酵母代謝過程中產(chǎn)生的異戊醇含量，從而降低酒中高級醇含量。筆者利用Gre-loxP重組系統(tǒng)[5]與酵母電轉化法敲除釀酒酵母中編碼類丙酮酸脫羧酶的基因YDL080c,構建低生成異戊醇的釀酒酵母用于釀造低高級醇酒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與質粒。釀酒酵母S2(華南理工大學發(fā)酵工程實驗室保存)，質粒pUG6(含抗G418 的Kanr篩選標記)購于杭州寶賽生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑。TaqHS酶購于TaKaRa公司，G418購于紐普諾博生物制品有限公司，小量酵母基因提取試劑盒、質粒制備試劑盒購于艾比根生物技術有限公司，凝膠DNA微量回收試劑盒購于基(欣研)生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器。411BR8273 電轉儀、電泳儀、Gel Doc2000凝膠成像分析系統(tǒng)、安捷倫7890A氣相色譜儀、DB-WAX毛細管柱( 30.00 m × 0.25 m× 2.50 μm)。

1.1.4 PCR引物。根據(jù)NCBI獲得基因YDL080c與GenBank獲得pUG6的基因序列(AF298793.1)設計引物，由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。基因YDL080c的驗證引物A1、A2，敲除引物B1、B2，轉化敲除組件后的驗證引物C1、C2。A1：GAGTTAAATGCTGCCTACG，A2：GTTGGCGGCATACCCACTATG；B1：CGGCTCAACCAGCTGAACATACATACCATATTT-GGACTCTCCGGACAGCTGAAGCTTCGTAC，B2：CTGGTTGGA-ACCAATGGGATATTTCATTCCAGACCCATTCTTGTCGCATAG-GCCACTAGTGGATC；C1：CCAGAATACCCTCCTTGA，C2：TGTTTATGTTCGGATGTGAT。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因YDL080c的驗證。以0.4 μL 提取菌株S2的DNA 為模板，A1、A2 為引物進行PCR。反應體系為10 μL，反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，49.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物。

1.2.2 菌株S2對抗生素G418 耐受試驗?？股谿418 濃度分別為0、20、40和60 μg /mL。將菌株S2分別涂布于不同抗生素濃度的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)。

1.2.3 基因YDL080c敲除組件的PCR擴增。以pUG6 為模板，B1、B2 為引物( 5′端有45 bp與YDL080c 同源[6])，按“1.2.1”的PCR條件進行擴增和瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.4 轉化和篩選陽性酵母菌。將YDL080c基因敲除組件用電轉化法[7]轉化酵母(OD600 nm= 2)，然后涂布在含抗生素G418 濃度60 μg /mL 的YPD 平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d。

取幾株平板上的陽性菌株與初始菌株S2進行搖床培養(yǎng)12 h,分別提取其基因組，以C1、C2為引物進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.5 菌株的發(fā)酵。用13°P 麥芽汁，接種1 × 107CFU/mL，30 ℃發(fā)酵6 d，蒸餾出50%體積的酒，測定乙醇和異戊醇含量。

1.2.6 異戊醇的氣相色譜法測定。色譜分離條件：N2流速2.0 mL/min，干燥空氣流速350 mL/min，H2流速30 mL/min，N2尾吹30 mL/min；壓力18.939 psi，分流比30∶1，檢測器進樣口溫度均為250 ℃，進樣量1 μl。

升溫程序：50 ℃保溫2 min，再以15 ℃ /min 升溫至200 ℃，并保溫3 min。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母S2中基因YDL080c的PCR驗證結果 按照“1.2.1”方法進行PCR擴增，再進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。由圖1可知，泳道1與泳道2 PCR產(chǎn)物的DNA片段與設計的驗證引物A1、A2擴增的DNA片段(161 bp)大小一致，因此可判斷菌株S2中含有基因YDL080c。

2.2 釀酒酵母S2對抗生素G418 的耐受性 按照“1.2.2”方法進行釀酒酵母S2對抗生素G418 的耐受性試驗，結果見圖2。由圖2可知，隨著培養(yǎng)基中抗生素G418 濃度的升高，平板中的菌落逐漸減少，當G418 的濃度達到60 μg/mL，不含Kanr抗性基因的酵母菌株將無法生長。因此，G418濃度60 μg/mL為篩選轉化菌株的濃度。

注：M.DL 2000 Marker，1和2.基因YDL080c的PCR產(chǎn)物。Note：M was DL 2000 Marker，1 and 2 was PCR products of genetic YDL080c.圖1 基因YDL080c的PCR擴增結果Fig.1 The results of electrophoresis of gene YDL080c by PCR amplification

注：A、B、C、D中G418濃度分別為0、20、40、60 μg/mL。Note:G418 concentration was 0, 20, 40, 60 μg/mL respectively in A, B, C and D.圖2 釀酒酵母S2對抗生素G418 的耐受性Fig.2 Resistance experiment of Saccharomyces cerevisiae S2 to the antibiotic G418

2.3YDL080c基因敲除組件的PCR擴增 根據(jù)“1.2.3”方法PCR擴增YDL080c基因敲除組件，結果見圖3。由圖3可知，泳道6的PCR產(chǎn)物片段與設計的敲除引物B1、B2擴增的DNA片段(1 703 bp)大小一致，因此，確定泳道6的PCR成功構建出YDL080c基因的敲除組件。

注：M.DL 2000 Marker，6.基因YDL080c的PCR電泳結果。Note：M was DL 2000 Marker，6 was PCR electrophoresis results of gene YDL080c.圖3 YDL080c基因敲除組件構建的電泳結果Fig.3 Electrophoresis results of YDL080c gene knockout assembly

2.4 轉化菌株的PCR篩選 根據(jù)“1.2.4”方法，用PCR方法剔除假陽性菌落，以篩選陽性工程菌，結果見圖4。由圖4可知，初始酵母菌株S2、工程菌株Y2、Y3、Y4、Y5、Y6的PCR產(chǎn)物在電泳中均無DNA條帶，僅工程菌株Y1驗證得到了與設計的驗證引物C1、C2大小一致的DNA片段(330 bp)，因此可判定菌株Y1已成功敲除YDL080c基因。

注：M.DL 2000 Marker，S2.初始菌株PCR驗證產(chǎn)物，Y1、Y2、Y3、Y4、Y5.為陽性菌株的PCR驗證產(chǎn)物。Note：M was DL 2000 Marker，S2 was PCR validation product of the initial strain，Y1、Y2、Y3、Y4、Y5 was PCR validation product of positive strains.圖4 工程菌株PCR驗證結果Fig.4 The PCR validation experiment of engineering strain

2.5 工程菌株的發(fā)酵試驗 按照“1.2.5”方法對工程菌株Y1進行發(fā)酵試驗。根據(jù)氣相色譜測定結果繪制出異戊醇測定的標準曲線，并得到線性方程：y=1.865 3x+0.002 9，其中，x為異戊醇濃度，y為異戊醇測定峰面積RF，結果見圖5。

圖5 異戊醇測定的標準曲線Fig.5 The standard curve of isopentanol measurement

將工程菌株Y1發(fā)酵蒸餾酒的異戊醇氣相測定RF值帶入方程y= 1.865 3x+0.002 9，得到Y1的相對異戊醇含量為0.81 g/L，其氣相測定圖譜見圖6。

圖6 菌株Y1釀造酒的氣相色譜Fig.6 Gas chromatogram of brewing wine of strain Y1

初始菌株S2的相對異戊醇含量為1.13 g/L，Y1釀造酒中的相對異戊醇含量比S2降低了28.3%，降低異戊醇的效果顯著。且釀造酒的酒精含量也略有升高，從原來的10.0%提高到10.5%。這表明用基因敲除YDL080c的工程酵母菌能夠有效降低釀造酒中的異戊醇含量，且不影響菌株的酒精發(fā)酵性能。

2.6 菌株Y1的傳代穩(wěn)定性 對菌株Y1進行連續(xù)5代以上的傳代，按照“1.2.5”方法進行發(fā)酵試驗，并測定異戊醇含量，結果見表1。由表1可知，基因敲除的工程菌Y1經(jīng)過5代的傳代，其相對異戊醇含量基本保持在0.81 g/L，說明經(jīng)過Cre-loxp重組系統(tǒng)改造的工程菌具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表1 菌株Y1傳遞5代后蒸餾酒中的物質含量

Table 1 Substance content of distilled liquor is fermented by strain Y1was passed in 5 generations

傳代代數(shù)Passagegeneration相對異戊醇含量Relativeisopentanolcontent∥g/L酒精濃度(V/V)Alcoholconcentration%F10．7910．0F20．8010．3F30．8110．5F40．8010．3F50．8110．5

3 結論

該研究成功構建了一株基因YDL080c缺失的釀酒酵母工程菌Y1，能夠顯著降低釀造酒中的異戊醇含量，Y1釀造酒中的相對異戊醇含量降低至0.81 g/L，比初始菌S2降低了28.3%。對于乙醇的發(fā)酵性能，Y1不僅未降低，反而略有升高，其遺傳性狀經(jīng)5代傳遞表現(xiàn)穩(wěn)定。參考文獻

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Construction ofSaccharomycescerevisiaewith Low Isopentanol Production by Deleting GeneYDL080c

YANG Qing1, LI Zhou2, ZHOU Shi-shui1*

(1.College of Biological Science and Engineering, South China University of Technology,Guangzhou,Guangdong 510006；2.Shanwei City Plum Industry Research Institutey,Lufeng, Guangdong 516500)

[Objective]TheSaccharomycescerevisiaewith producing low isopentanol was constructed by knocking out geneYDL080c.[Method]TheSaccharomycescerevisiaewith producing low isopentanol was constructed byusing Cre-loxP recombination system and yeast electrical transformation method to knock out the geneYDL080cencoding pyruvate decarboxylase,in order to cut off the produce of isopentanol in metabolism ofSaccharomycescerevisiae.[Result]The engineering strain Y1withoutYDL080cwas successfully constructed. The relative isopentanol content was 0.81 g/L in wine brewed by Y1, which was 28.3% lower than that of the original strain. [Conclusion]EngineeringSaccharomycescerevisiaewithout geneYDL080ccan effectively reduce the production of isopentanol in brewed wine.

Gene knock-out；Isopentanol；Saccharomycescerevisiae

楊青(1991- )，女，甘肅蘭州人，碩士研究生，研究方向：基因敲除。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事發(fā)酵工程與釀酒方面的研究。

2016-11-02

S 188+.4

A

0517-6611(2016)33-0140-03