小分子雙鏈RNAs聯(lián)合應(yīng)用抑制膀胱癌細(xì)胞增殖的實驗研究

張慶松 李傳昌 陳忠 李凡 袁慧星 楊為民

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·實驗研究·

小分子雙鏈RNAs聯(lián)合應(yīng)用抑制膀胱癌細(xì)胞增殖的實驗研究

張慶松 李傳昌 陳忠 李凡 袁慧星 楊為民

目的 在膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染兩種不同的人工合成小分子雙鏈RNA(dsRNA)，觀察聯(lián)合應(yīng)用與分別單獨應(yīng)用兩種dsRNA對膀胱癌細(xì)胞生長的影響。 方法 根據(jù)對膀胱癌細(xì)胞的處理不同分為：①陰性對照組(dsControl)、dsP21-322組、dsP21-555組和dsP21-322+ dsP21-555組；②dsControl組、dsP21-322組、dsP53-285組和dsP21-322+dsP53-285組。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測各組細(xì)胞p21 mRNA及細(xì)胞周期依賴性激酶CDK4、CDK6 mRNA的表達(dá)；蛋白印跡法(Western blot)檢測P21蛋白和CDK4、CDK6蛋白的表達(dá)；細(xì)胞增殖實驗檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力；集落形成實驗檢測單個細(xì)胞克隆增殖能力。 結(jié)果 qPCR結(jié)果顯示，與dsControl組相比，dsP21-322組、dsP2l-555組和dsP53-285組均分別上調(diào)T24和EJ細(xì)胞中p21 mRNA的表達(dá)(P<0.01)；而與單獨轉(zhuǎn)染dsP21-322、dsP2l-555相比，同時轉(zhuǎn)染dsP21-322+dsP21-555，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與dsControl組相比，dsP53-285能夠上調(diào)p53基因的表達(dá)(P<0.05)；與單獨轉(zhuǎn)染dsP53-285相比，p53 mRNA表達(dá)在同時轉(zhuǎn)染dsP21-322和dsP53-285組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與單獨轉(zhuǎn)染dsP21-322、dsP53-285相比，dsP21-322+dsP53-285能夠顯著增加p21 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。與dsControl相比，轉(zhuǎn)染dsP21-322、dsP53-285分別使T24和EJ細(xì)胞中CDK4、CDK6 mRNA的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與單獨轉(zhuǎn)染dsP21-322、dsP53-285相比，CDK4/6 mRNA的表達(dá)在dsP21-322+dsP53-285組中明顯被抑制(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果驗證了組間p21和CDK4/6基因表達(dá)的差異。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，同時轉(zhuǎn)染dsP21-322和dsP53-285比單獨轉(zhuǎn)染抑制膀胱癌細(xì)胞增殖能力更明顯。細(xì)胞集落形成實驗中，dsP21-322+dsP53-285組中形成的集落數(shù)量顯著少于單獨轉(zhuǎn)染組。 結(jié)論 同時轉(zhuǎn)染dsP21-322和dsP53-285能夠顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。

膀胱腫瘤； dsRNAs； P21； RNA激活

前期研究發(fā)現(xiàn)微小非編碼雙鏈RNA(dsRNA)分子dsP21-322、dsP53-285能分別與膀胱腫瘤細(xì)胞中的抑癌基因p21和p53基因的啟動子靶部位結(jié)合，從而激活p21和/或p21上游基因p53的表達(dá)[1-2]。Place等[3]研究發(fā)現(xiàn)dsRNA分子dsEcad-640和微小RNA(miRNA)分子miR-373分別與E-cadherin啟動子的靶序列完全及不完全互補配對，在前列腺癌細(xì)胞中都能明顯激活E-cadherin基因的表達(dá)，而將二者同時轉(zhuǎn)入細(xì)胞后并沒有使得E-cadherin的表達(dá)比單獨轉(zhuǎn)染時增高。為了研究兩個不同作用點的dsRNA同時轉(zhuǎn)入細(xì)胞后是否能夠使得目的基因p21的表達(dá)更高并且顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的生長，本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)初步檢測轉(zhuǎn)染處理的膀胱癌細(xì)胞中p21 mRNA表達(dá)變化，利用之前篩選出的可激活P21蛋白表達(dá)的dsP21-555進(jìn)一步確定dsP21-555與dsP21-322及dsP21-322與dsP53-285同時轉(zhuǎn)入后是否能明顯激活p21基因的表達(dá)并觀察其對膀胱癌細(xì)胞生長作用的影響。

材料與方法

一、材料

dsP21-322、dsP21-555、dsP53-285模擬物和隨機序列(dsControl)(廣州市銳博生物科技有限公司)；人膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞(中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心)；胎牛血清(美國GIBCO公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；Opti-MEM?無血清培養(yǎng)液、Lipofeetamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(美國 Invitrogen公司)；PCR引物合成(上海Invitrogen公司)；SYBR?Premix Ex TaqⅡ試劑盒、PrimeScriptTMRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生生物工程大連有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；一抗鼠抗P21(美國CST公司)；一抗兔抗細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)4、CDK6(美國Affinity公司)；一抗鼠抗β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG(武漢博士德公司)；超敏ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)；CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒(美國Promega公司)。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：人膀胱癌細(xì)胞系T24、EJ細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。在細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后用胰酶消化細(xì)胞重新接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約接種10×104～20×104個細(xì)胞，12 h后使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?RNAiMAX對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，并保證dsRNA的終濃度為50 nmol/L。24 h后觀察細(xì)胞形態(tài)并更換培養(yǎng)液。根據(jù)對細(xì)胞的不同處理分為：①陰性對照組(dsControl)、dsP21-322組、dsP21-555組和dsP21-322+dsP21-555組；②dsControl組、dsP21-322組、dsP53-285組和dsP21-322+dsP53-285組(第一組的dsP21-322和dsP21-555都是作用于p21啟動子的dsRNA，首先確定作用于同一個基因的兩個dsRNA同時轉(zhuǎn)染后激活作用是否能夠疊加;第二組是一個作用于p21基因的dsRNA，一個作用于p53啟動子的dsRNA，p53是p21的上游基因，同時轉(zhuǎn)染后檢查p21的表達(dá)是否會更高及細(xì)胞增殖的變化)。

2.總RNA的提取和qPCR檢測：轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞用于p21、p53、CDK4和CDK6 mRNA表達(dá)水平的分析。使用TRIzol Reagent裂解細(xì)胞后提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT MasterMix逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。合成的cDNA使用特異性引物及SYBR?Premix ExTaqⅡ通過qPCR進(jìn)行擴增并檢測分析，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-△△Ct方法分析。相關(guān)引物序列見表1。

表1 qPCR相關(guān)引物序列

3.總蛋白提取和蛋白印跡法(Western blot)分析：轉(zhuǎn)染后72 h用胰酶消化并收集細(xì)胞。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液NP-40，4 ℃裂解30 min，高速離心15 min后取上清。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度。每個樣本加30 μg蛋白至SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清白蛋白的TBST溶液在室溫封閉1 h，然后分別用一抗：P21(1∶1 000稀釋)、CDK4(1∶1 000稀釋)、CDK6(1∶1 000稀釋)和β-actin(1∶500稀釋)抗體在4 ℃冰箱孵育過夜。第2天用TBST洗膜，洗3次，每次10 min。采用羊抗鼠的二抗(1∶1 000 稀釋)、羊抗兔的二抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，同樣用TBST溶液洗膜，洗4次，每次10 min。最后使用ECL曝光顯影。

4.細(xì)胞增殖實驗檢測：膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)dsRNA mimics后的第1、2、3、4、5天分別采用CellTiter 96?Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay 試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力。每隔24 h取出轉(zhuǎn)染后待檢測的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液；避光條件下，加入110 μl的MTS稀釋液(10 μl MTS試劑和100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；取出96孔板，避免產(chǎn)生氣泡，用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在490 nm波長的吸光率，保存數(shù)據(jù)；檢測完成后將96孔板放回培養(yǎng)箱待下一時間點檢測。

5.集落形成實驗檢測：轉(zhuǎn)染24 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，重新接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 000個細(xì)胞；3 d更換一次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)10 d；棄掉培養(yǎng)液后用PBS洗2遍；每孔加入1 ml甲醇固定15 min，棄去甲醇再用0.1%結(jié)晶紫溶液固定30 min；用流動水緩慢洗去染液，室溫晾干后拍照、計數(shù)分析。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)。所有實驗結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析檢驗各組間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、qPCR結(jié)果

與dsControl組相比，在膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)入dsP21-555或dsP21-322，p21 mRNA表達(dá)均增高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，而同時轉(zhuǎn)入dsP21-555和dsP21-322，p21 mRNA的表達(dá)與單獨轉(zhuǎn)入兩個dsRNAs相比并沒有明顯改變。在膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞中轉(zhuǎn)入dsP53-285后，p53 mRNA表達(dá)明顯高于dsControl組(P<0.05)，轉(zhuǎn)入dsP21-322后p53 mRNA表達(dá)沒有顯著變化。同時轉(zhuǎn)入dsP21-322和dsP53-285，p53 mRNA表達(dá)與單獨轉(zhuǎn)入dsP53-285差異無統(tǒng)計學(xué)意義。同時轉(zhuǎn)入dsP21-322和dsP53-285，P21的表達(dá)明顯比單獨轉(zhuǎn)入二者增高，CDK4和CDK6的表達(dá)明顯比單獨轉(zhuǎn)入二者減低(P<0.05，P<0.01)。圖1。

A：dsP21-322和dsP21-555都能使p21 mRNA表達(dá)增高(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，而同時轉(zhuǎn)入二者后p21 mRNA無明顯變化，dsP53-285能激活p53基因，而dsP21-322對p53表達(dá)無影響，同時轉(zhuǎn)入二者后p53 mRNA表達(dá)無明顯變化；B：dsP21-322和dsP53-285都可以使得p21 mRNA表達(dá)增高，抑制CDK4和CDK6的表達(dá)(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，同時轉(zhuǎn)染dsP21-322和dsP53-285后，p21 mRNA明顯增高，CDK4和CDK6顯著被抑制(&P<0.05，#P<0.01)

圖1 qPCR分析檢測p21、p53和CDK4/6 mRNA相對表達(dá)量

二、Western blot檢測P21和CDK4/6蛋白的表達(dá)

與單獨轉(zhuǎn)染dsP21-322 及dsP53-285相比，同時轉(zhuǎn)染dsP21-322和dsP53-285組P21蛋白呈高表達(dá)，CDK4和 CDK6蛋白均呈現(xiàn)低表達(dá)。圖2。

圖2 Western blot檢測P21、CDK4/6蛋白相對表達(dá)量，同時轉(zhuǎn)入dsP21-322和dsP53-285后膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞中P21蛋白表達(dá)明顯增高，CDK4和CDK6表達(dá)受抑制

三、細(xì)胞增殖實驗

同時轉(zhuǎn)染dsP21-322和dsP53-285的細(xì)胞增殖能力明顯弱于單獨轉(zhuǎn)染dsP21-322或dsP53-285的細(xì)胞(P<0.05)。圖3。

四、集落形成實驗

dsP21-322+dsP53-285組形成的集落數(shù)要顯著少于單獨轉(zhuǎn)染dsP21-322或dsP53-285形成的集落數(shù)。圖4。

圖3 細(xì)胞增殖實驗檢測細(xì)胞增殖能力，在dsP21-322+dsP53-285組中T24和EJ細(xì)胞生長能力明顯弱于dsP21-322組和dsP53-285組(P<0.05)

圖4 細(xì)胞集落形成實驗檢測細(xì)胞集落形成率，EJ和T24細(xì)胞在dsP21-322+dsP53-285組中的集落明顯比dsP21-322組和dsP53-285組少

討 論

RNA激活(RNAa)是近年來發(fā)現(xiàn)的由微小非編碼RNA與目的基因的啟動子區(qū)域結(jié)合而激活靶基因的一種基因表達(dá)調(diào)節(jié)機制[4-5]。人體內(nèi)存在一些內(nèi)源性微小RNA分子(miRNAs)具有RNAa效應(yīng)[6]。RNAa的發(fā)現(xiàn)在醫(yī)學(xué)生物范圍內(nèi)具有重要的理論和實際意義[6-7]。與之前發(fā)現(xiàn)的RNA干擾(RNAi)在轉(zhuǎn)錄后水平沉默特定靶基因的表達(dá)不同，RNAa是由小分子非編碼RNA的反義鏈在轉(zhuǎn)錄水平激活靶基因的表達(dá)[8]。RNAa作用一般在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48 h起作用，72 h達(dá)到高峰，作用時間可持續(xù)2周左右[1]，所以本實驗在轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，提取總RNA和蛋白進(jìn)行檢測。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)dsP21-322能夠與p21啟動子結(jié)合并激活p21基因的表達(dá)[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)dsP21-555也可以通過與p21啟動子結(jié)合而激活p21基因及其下游的表達(dá)[9]。本實驗將dsP21-322和dsP21-555同時轉(zhuǎn)入膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)這兩個dsRNAs共存并沒有使p21基因表達(dá)高于單一的dsRNA的作用。Place等[3]研究發(fā)現(xiàn)，將能夠激活E-cadherin基因表達(dá)的miR-373與dsEcad-640一起轉(zhuǎn)入前列腺癌細(xì)胞中也不能顯著上調(diào)E-cadherin的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，我們選擇可以激活p53基因的dsP53-285，其能夠間接的上調(diào)p21基因的表達(dá)；然后我們挑選激活p21基因作用明顯的P21-322，并將二者同時轉(zhuǎn)入膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ細(xì)胞中。從實驗結(jié)果可見，在T24和EJ細(xì)胞中同時轉(zhuǎn)入P21-322和dsP53-285時，p21表達(dá)明顯高于單獨轉(zhuǎn)入P21-322或dsP53-285。由此推論，作用于同一目的基因啟動子的不同dsRNAs或者miRNAs并不能使其激活作用更強。而作用于不同靶基因的dsRNAs可能同時激活各自的靶基因從而發(fā)揮各自的生物學(xué)作用。這一發(fā)現(xiàn)為dsRNA在腫瘤中的應(yīng)用提供了更廣闊的理論基礎(chǔ)。

目前RNAa已得到國際上越來越多學(xué)者的認(rèn)可，而且RNAa在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中也起到了非常重要的作用，但是其確切的作用機制還不清楚，還需要進(jìn)行更為廣泛而深入的研究。

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(本文編輯：徐漢玲)

Combination of small double-stranded RNAs suppress the proliferation of bladder cancer cells

ZHANGQing-song,LIChuan-chang,CHENZhong,LIFan,YUANHui-xing,YANGWei-min.

DepartmentofUrology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

CHENZhong,E-mail:chenzhongtj@126.com

Objective To investigate the different effects between combined application of two different synthetic small double-stranded RNAs (dsRNAs) dsP21-322+dsP21-555, dsP21-322+dsP53-285 and one dsRNA on proliferation of bladder cancer cell lines T24 and EJ. Methods Bladder cancer cells were divided into: ①negative control group (dsControl), dsP21-322 group, dsP21-555 group and dsP21-322+dsP21-555 group.②dsControl group, dsP21-322 group, dsP53-285 group and dsP21-322+dsP53-285 group.Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was conducted to detect the expressions of p21 mRNA and cyclin-dependent kinases 4/6 (CDK4/6) mRNA.Western blot was operated to verify the expression of p21 and CDK4/6 proteins.Cell proliferation assay was performed to evaluate the proliferation capacity of transfected cells.Colony formation assay was carried out to analyze the proliferative ability of single cancer cell. Results qPCR results showed that, compared with the negative dsControl group, dsP21-322 group, dsP21-555group and dsP53-285 group up-regulated the expressions of P21 mRNA (P<0.01) in T24 and EJ cells.Compared with transfection of dsP21-322, or dsP21-555 alone, the expression of p21 mRNA showed no significantly difference in combined transfection of dsP21-322 and dsP21-555 group (P>0.05).Compared with dsControl group, dsP53-285 activated p53 mRNA expression.And the expression of p53 mRNA in dsP21-322 + dsP53-285 group and dsP53-285 group showed no difference.Compared with dsControl group, dsP21-322 and dsP53-285 dramatically reduced CDK4/6 mRNAs expression (P<0.05).Besides, compared with transfection of dsP21-322, dsP53-285 alone, the expression of p21, CDK4/6 mRNAs were suppressed in combined transfection of dsP21-322 and dsP53-285 group (P<0.05).Western blot assay verified the different expression of p21 and CDK4/6 genes among groups.Cell proliferation assay showed that, compared with dsP21-322 group and dsP53-285 group, the proliferative capacities of cells transfected with dsP21-322 and dsP53-285 together decreased significantly (P<0.05).Colony formation assay showed that the numbers of colonies formed in the dsP21-322 +dsP53-285 group were fewer than that in the dsP21-322 group and the dsP53-285 group. Conclusions The proliferation of bladder cancer cells could significantly suppressed when transfected with dsP21-322 and dsP53-285 together.

Urinary bladder neoplasms; dsRNAs; P21; RNAa

國家自然科學(xué)基金(81372759)

430030 武漢, 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院泌尿外科

陳忠,E-mail:chenzhongtj@126.com

10.3870/j.issn.1674-4624.2016.04.009

2016-07-12)