石榴復(fù)合保健果醋發(fā)酵過程中還原糖測(cè)定方法建立及比較研究

李佳川，馬萬禮，許世林，陶夢(mèng)敏

(西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610075)

石榴復(fù)合保健果醋發(fā)酵過程中還原糖測(cè)定方法建立及比較研究

李佳川，馬萬禮，許世林，陶夢(mèng)敏

(西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610075)

目的:石榴復(fù)合果醋發(fā)酵過程中，還原糖的含量是衡量發(fā)酵過程正常與否的重要標(biāo)志.建立既符合保健果醋特點(diǎn)，又能簡(jiǎn)便、快速的還原糖測(cè)定方法，具有重要的科學(xué)意義.方法：建立3，5-二硝基水楊酸比色定糖法(DNS法)、直接滴定法、薩氏法三種還原糖測(cè)定方法，比較三種方法的精密度和準(zhǔn)確度，優(yōu)選最佳測(cè)定方法；同時(shí)，對(duì)最優(yōu)方法的精密度、檢測(cè)限、定量限和加標(biāo)回收率進(jìn)行分析，考察脫色與否對(duì)石榴復(fù)合果醋還原糖測(cè)定的影響，確定最優(yōu)測(cè)定條件檢測(cè)石榴復(fù)合果醋中還原糖的含量.結(jié)果：①3，5-二硝基水楊酸比色定糖法、直接滴定法、薩氏法的RSD分別為：0.0049%、0.0060%、0.0330%；加標(biāo)回收率分別為：100.41%、105.56%、97.35%，確定DNS法的精密度和準(zhǔn)確度均優(yōu)于其他兩種方法，更適用于還原糖的測(cè)定，既簡(jiǎn)便又快速；②通過對(duì)精密度、檢測(cè)限、定量限和加標(biāo)回收率的比較分析，色素對(duì)還原糖的測(cè)定結(jié)果影響較大，將樣品利用活性炭脫色處理，可提高DNS法測(cè)定的精確性；③石榴復(fù)合果醋中還原糖的最終含量為50.92g/L.結(jié)論：DNS法重現(xiàn)性好，方法簡(jiǎn)便、快捷，適用于石榴復(fù)合果醋發(fā)酵過程中還原糖的測(cè)定.

石榴復(fù)合果醋；還原糖；測(cè)定方法；色素

石榴是藏藥、中藥中常用“藥食同源”藥物，四川涼山會(huì)理縣是全國(guó)最大石榴生產(chǎn)基地，會(huì)理石榴名優(yōu)質(zhì)佳，藥食資源道地，產(chǎn)業(yè)開發(fā)潛力巨大[1-3].研究中，課題組前期通過液態(tài)發(fā)酵等方式制備石榴復(fù)合保健果醋.在發(fā)酵過程中，還原糖的消耗與酒精度的轉(zhuǎn)化關(guān)系不僅是衡量發(fā)酵過程正常與否的重要標(biāo)志，而且還原糖的相對(duì)含量對(duì)果酒、果醋的色、香、味都有較大影響，是果酒、果醋釀造過程中的一項(xiàng)重要指標(biāo).因此，準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、微量、快速的測(cè)定果醋中還原糖的含量，對(duì)石榴復(fù)合果醋的制備工藝考察具有重要意義.

目前，酒精類飲料中還原糖測(cè)定常用方法有直接滴定法、高錳酸鉀滴定法等化學(xué)分析法，但滴定類分析方法易受干擾，特別是果汁中有色物質(zhì)會(huì)干擾終點(diǎn)的判別，且操作費(fèi)時(shí)，誤差范圍大，重現(xiàn)性較差.水楊酸比色定糖法利用DNS試劑與還原糖作用生成顯色物質(zhì)，且顯色與含糖量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，操作方法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好.因此，本文擬建立上述三種還原糖測(cè)定方法，比較三種方法的精密度和準(zhǔn)確度，優(yōu)選最佳測(cè)定方法；同時(shí)，對(duì)最優(yōu)方法的精密度、檢測(cè)限、定量限和加標(biāo)回收率進(jìn)行分析，考察脫色與否對(duì)石榴復(fù)合果醋還原糖測(cè)定的影響，確定最優(yōu)還原糖測(cè)定條件，并檢測(cè)石榴復(fù)合果醋中還原糖的含量.以期建立既符合保健果醋特點(diǎn)，又能簡(jiǎn)便、快速的還原糖測(cè)定方法，以促進(jìn)攀西地區(qū)特色生物食藥資源開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化，為民族特色食藥資源的開發(fā)提供示范性.

1 材料與方法

1.1 受試藥物

石榴復(fù)合果醋(液態(tài)發(fā)酵)，西南民族大學(xué)藥學(xué)院民族醫(yī)藥研究院制備，批號(hào):20160305.

1.2 試劑

(1)主要試劑:3，5-二硝基水楊酸(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào):2016030101)，苯酚(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào):2015091501)，酒石酸鉀鈉(成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)，批號(hào):2016022601)，碘酸鉀(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào):2015102501)，硫酸銅(廣東汕頭新寧化工廠，批號(hào):2013083101)，葡萄糖(廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào):20080427)

(2)相關(guān)溶液的配制:①DNS試劑:稱取1.0g 3，5-二硝基水楊酸，量取10mL 2mol/L氫氧化鈉加到酒石酸鉀納的熱溶液中，加1.0g苯酚和5.1g亞硫酸氫鈉溶于其中，攪拌溶解，冷卻，定容貯于到250mL棕色瓶中[4-5].②薩氏試劑:將7.2g磷酸氫二鈉、4.3g酒石酸鉀鈉溶于100mL水中，加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL.分別稱取0.88g硫酸銅和4.0g硫酸鈉溶于上述溶液中，再加入0.20mol/L碘酸鉀溶液25mL最終稀釋定容到500mL.放置數(shù)天后，微孔玻璃漏斗過濾，備用.③堿性酒石酸銅甲/乙液:稱取2.0g硫酸銅及0.05g次甲基藍(lán)溶解于水中并定容于100mL容量瓶中(甲液)；再稱取5.0g酒石酸鉀鈉、8.0g氫氧化鈉和0.5g亞鐵氰化鉀溶解于水中，定容于100mL容量瓶中(乙液).

1.3 儀器

722 N可見分光光度計(jì)(上海萊帕德科學(xué)儀器有限公司儀器).

1.4 方法

1.4.1 三種還原糖測(cè)定方法的建立

(1)3，5-二硝基水楊酸比色定糖法(DNS法):精密移取不同濃度梯度的葡萄糖溶液(0.2～2.0mg/ mL)到試管中，再分別加入蒸餾水使其體積相同再加入3mL的DNS試劑，在沸水中加熱5min，取出立即用冷水冷卻至室溫，再加 10mL的蒸餾水，混勻，在520nm處比色[6].

(2)薩氏法:吸取5mL樣液(含還原糖0.015～ 3.0mg)放人試管中，另一試管加入5mL.蒸餾水(作為對(duì)照液)，向試管中各加入5mL薩氏試劑，搖勻，試管口蓋以玻璃塞(防止生成的氧化亞銅由于空氣的對(duì)流再次被氧化)，把試管放入沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min，冷卻.徐徐加入2mL碘化鉀溶液，接著迅速加入1.5mL 1mol/L硫酸溶液，搖勻，使沉淀完全溶解.最后用0.05mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定.滴定接近終點(diǎn)時(shí)，溶液變?yōu)榈S色，加人lmL 0.5%淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為止，記錄硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量[7-8].

(3)直接滴定法:① 標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液:精密吸取5.0mL堿性酒石酸銅甲液及5.0mL乙液，置150mL錐形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加約10mL葡萄糖，控制在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸以每?jī)擅?滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至溶液藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積，同時(shí)平行操作三份，取其平均值，計(jì)算每10mL(甲、乙液各5mL)堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量或其他還原糖的質(zhì)量(mg).② 試樣處理:吸取5.0mL試樣，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，備用.使葡萄糖含量約在0.2g～0.4g.③ 試樣溶液預(yù)測(cè):與標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液相同，用試樣代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液.④試樣溶液測(cè)定:吸取5.0mL堿性酒石酸銅甲液及5.0mL乙液，置于150mL錐形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加比預(yù)測(cè)體積少1mL的試樣溶液至錐形瓶中，使在2min內(nèi)加熱至沸，趁沸繼續(xù)以每?jī)擅?滴的速度滴定，直至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積，同法平行操作三份，得出平均消耗體積[9-10].

式中:A—0mL(甲、乙液各5mL)堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量(mg)；C—葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mg/mL；V—標(biāo)定時(shí)消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL.

1.4.2 三種還原糖測(cè)定方法的比較分析

(1)精密度的測(cè)定:稱取2.0g(實(shí)際稱樣量為2.0047g)干燥的葡萄糖溶解、定容于100mL的容量瓶中得已知濃度為2mg/mL的葡萄糖溶液作為試樣.分別用三種方法平行測(cè)定六次，記錄數(shù)據(jù).

(2)準(zhǔn)確度的測(cè)定:以測(cè)定值的平均值為最后測(cè)定值，計(jì)算加標(biāo)回收率來評(píng)估三種方法的準(zhǔn)確度.

1.4.3 石榴復(fù)合果醋中還原糖的測(cè)定

(1)試樣脫色與否對(duì)石榴復(fù)合果醋還原糖測(cè)定的影響:吸取20mL樣品，置于蒸發(fā)皿中，用1mol/L的氫氧化鈉溶液中和至中性，在水浴上蒸發(fā)(注意保持溶液pH為中性)，混勻.邊搖邊慢慢加入5mL的乙酸鋅溶液及5mL的亞鐵氰化鉀溶液去除蛋白，加水至刻度，混勻，靜置30min，用布氏漏斗過濾，棄去初濾渣，濾液備用.量取上述一定體積去蛋白后的試樣，按照5g/L量加入活性炭，加熱至沸騰1min后，冷卻、攪拌、靜置、過濾得到無色試樣.分別取上述去蛋白和去色素試樣各2mL定容到50mL的容量瓶中25倍數(shù)稀釋，各吸取1mL分別為樣品1和樣品2，按照1.4.1 (1)項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，計(jì)算相應(yīng)還原糖的含量.以精密度、檢測(cè)限、定量限和加標(biāo)回收率為指標(biāo)進(jìn)行分析，考察脫色與否對(duì)石榴復(fù)合果醋還原糖測(cè)定的影響[11-12].

(2)石榴復(fù)合果醋中還原糖含量測(cè)定:確定最佳方法后測(cè)定石榴復(fù)合果醋中還原糖的含量，平行測(cè)定3次，以測(cè)定值的平均值為最后測(cè)定值.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 DNS法工作曲線的建立

將表1數(shù)據(jù)用Excel2010進(jìn)行處理，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線(圖1).

表1 DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Table 1 The establishment of the standard curve of DNS method

圖1 DNS法測(cè)定葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve for detecting glucose concentration by DNS method

由表1和圖1結(jié)果可知，還原糖濃度在0.2～ 2.0mg/mL之間較好的線性關(guān)系，還原糖濃度在2.0mg/mL之后吸光度趨于平穩(wěn).曲線方程為 y＝0.0538x-0.0035，R＝0.9990，表明具有良好的線性關(guān)系，所得數(shù)據(jù)較可靠.

2.2 三種還原糖測(cè)定方法的建立與比較分析

分析實(shí)驗(yàn)中精密度和準(zhǔn)確度是衡量分析方法的關(guān)鍵數(shù)據(jù)指標(biāo).由表2～3結(jié)果可知，DNS法的標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)和加標(biāo)回收率均比直接滴定法、薩氏法的低，反映出DNS法的精密度、準(zhǔn)確度較好.因此，本研究中還原糖含量的測(cè)定首選DNS法.

表2 三種方法精密度的比較分析(n＝8)Table 2 Comparison of the precisions of the three methods(n＝8)

表3 三種方法準(zhǔn)確度的比較分析(n＝8)Table 3 Comparason of the accuracy of the three methods(n＝8)

2.3 石榴復(fù)合果醋中還原糖的測(cè)定

2.3.1 脫色對(duì)石榴復(fù)合果醋中還原糖測(cè)定的影響

表4 色素對(duì)DNS法測(cè)定石榴復(fù)合果醋還原糖含量的影響Table 4 The influence of pigment on the content of the reducing sugar in pomegranate compound fruit vinegar by DNS method

由表4結(jié)果可知，樣品脫色后的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于樣品不脫色，回收率較樣品不脫色，也更接近100%，說明色素對(duì)測(cè)定石榴復(fù)合果醋中還原糖精密度和準(zhǔn)確度均有一定的影響；同時(shí)，樣品脫色后的檢測(cè)線和定量限均低于脫色前，說明色素對(duì)測(cè)定石榴復(fù)合果醋中靈敏度有一定的影響.由上述數(shù)據(jù)分析可知，色素對(duì)還原糖的測(cè)定結(jié)果影響較大，將樣品利用活性炭脫色處理，可提高DNS法測(cè)定的精確性.

2.3.2 石榴復(fù)合果醋中還原糖的測(cè)定

由表5得結(jié)果可知，經(jīng)過3次重復(fù)測(cè)定，石榴復(fù)合果醋中還原糖的含量為50.92g/L.

表5 石榴復(fù)合果醋中還原糖的含量測(cè)定(n＝3)Table 5 The determination of reducing sugar content in pomegranate compound fruit vinegar(n＝3)

3 討論

本研究通過建立DNS法、直接滴定法、薩氏法三種還原糖測(cè)定方法，比較分析了三種還原糖測(cè)定方法的精密度和準(zhǔn)確度，以期優(yōu)選出適用于果酒、果醋中還原糖測(cè)定的最佳方法.在三種還原糖測(cè)定方法學(xué)比較中，以100%還原糖(葡萄糖)為比較試劑，在已知濃度劑量下進(jìn)行相關(guān)方法學(xué)考察，有利于準(zhǔn)確的進(jìn)行方法學(xué)比較分析；同時(shí)，精密度和準(zhǔn)確度是分析實(shí)驗(yàn)中最基本的參數(shù)，因此，在三種方法的比較中以精密度和準(zhǔn)確度作為指標(biāo)進(jìn)行比較分析，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠.此外，在三種方法中，直接滴定法對(duì)測(cè)定菲林甲乙液的標(biāo)定，預(yù)實(shí)驗(yàn)，以及操作均比較繁瑣，尤其實(shí)驗(yàn)條件如時(shí)間、溫度、滴定速度、樣液的用量等均須嚴(yán)格控制，而且需要在沸騰的條件下才能進(jìn)行滴定，也比較容易燙傷操作人員，給操作帶來諸多不便.同樣，薩氏法在實(shí)驗(yàn)條件如時(shí)間、溫度、滴定速度、樣液的用量等方面要求較高，也不適宜于批量檢測(cè).DNS法具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、雜質(zhì)干擾較小等優(yōu)點(diǎn)，滿足實(shí)驗(yàn)研究批量檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)要求，且測(cè)定結(jié)果可靠，尤其對(duì)含色素的果酒、果醋進(jìn)行脫色處理后會(huì)使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果更加精確.

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(責(zé)任編輯：李建忠，付強(qiáng)，張陽(yáng)，羅敏；英文編輯：周序林，鄭玉才)

Establishment and comparison of determination method of reducing sugar in fermentation process of pomegranate compound health fruit vinegar

LI Jia-chuan，MA Wan-li，XU Shi-lin，TAO Meng-min

(School of Pharmaceutical Sciences，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610075，P.R.C.)

Objective:In the fermentation process of pomegranate compound health fruit vinegar，the content of reducing sugar is an important indicator concerning whether the fermentation process is normal or not.It is of significance to establish a simple and fast method to analyze the reducing sugar in the health fruit vinegar.Methods:Three experimental methods including the the 3，5-Dinitrosalicylic acid(DNS)method，direct titration，and somgyis method for determination of reducing sugar were compared in terms of the precision and accuracy in order to select the optimal determination method.To optimize the protocol，the analysis of the precision，limit of detection，limit of quantitation，recovery rate was carried out to identify the influence of decoloration on the determination of reducing sugar of the pomegranate compound fruit vinegar.Results:①RSD of the DNS method，direct titration and somgyis method were 0.0049%，0.0060%and 0.0330%，respectively，with the standard addition recovery of 100.41%，105.56%and 97.35%，indicating that the precision and accuracy of DNS method were better than those of the other two methods and thus more suitable for simple and fast determination of the reducing sugar；②The analysis on the precision，limit of detection，limit of quantitation and recovery rate showed that the pigment exhibited great impact on the detection result of reducing sugar.Decoloration of samples with the activated carbon could greatly improve the precision of the DNS test；③The content of the reducing sugar in the pomegranate compound vinegar was 50.92g/l.Conclusion:DNS method is simple，fast and has good reproducibility，suitable for the determination of reducing sugar during the fermentation process of the pomegranatecompound fruit vinegar.

pomegranate compound fruit vinegar；reducing sugar；determination method；pigment

R284；R29

A

2095-4271(2016)04-0420-05

10.11920/xnmdzk.2016.04.009

2016-05-30

李佳川(1984-)，男，漢族，副教授，博士后，碩士生導(dǎo)師.研究方向:中藥及民族藥物藥效與毒理.E-mail:ligat＠163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(81302912)；四川省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目(2016Q068)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2015－2561)