高效液相色譜法測定Cu(ATSM)混懸劑的含量

仇麗穎，羅 瑤，潘紅艷

(1.西南民族大學藥學院，四川 成都 610041；2.四川大學華西醫(yī)院再生醫(yī)學研究中心，四川 成都 610041)

高效液相色譜法測定Cu(ATSM)混懸劑的含量

仇麗穎1，2，羅 瑤1，潘紅艷1

(1.西南民族大學藥學院，四川 成都 610041；2.四川大學華西醫(yī)院再生醫(yī)學研究中心，四川 成都 610041)

目的建立測定Cu(ATSM)混懸劑中Cu(ATSM)含量的高效液相色譜法.方法采用RP-HPLC法，用ODS柱，乙腈-水(含0.1%三氟乙酸)的梯度洗脫系統(tǒng)，檢測波長為305 nm.結(jié)果Cu(ATSM)在濃度為5～100 μg·mLˉ1范圍內(nèi)線性關系良好(r＝0.9967)，檢測限為2 ng(S/N＝3)，加樣回收率為103.0%，RSD為1.98%(n＝6).結(jié)論所建方法簡便，靈敏度高，準確度好，專屬性強，可為Cu(ATSM)制劑的質(zhì)量評價提供可行的方法參考.

高效液相色譜法；銅；銅-二乙酰-2(N4-甲基氨基硫脲)

少數(shù)民族醫(yī)藥擅長使用金屬元素，尤其以藏藥極具代表性[1-4].很多臨床觀察和動物試驗已經(jīng)證明金屬元素銅在心腦血管系統(tǒng)中具有重要作用[5-8].在飲食中補充適量的銅可以逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥大[9]，改善心臟收縮功能[10].然而無機態(tài)的銅體內(nèi)利用率不高，過量使用會引起銅中毒，而有機態(tài)銅在機體吸收利用及降低毒性方面都比無機態(tài)銅元素更具有優(yōu)勢.銅-二乙酰-2(N4-甲基氨基硫脲)[Cu(ATSM)，化學結(jié)構(gòu)見圖1，是一種含銅絡合物，因其具有在缺氧組織中特異性富集的特點，最早作為正電子發(fā)射斷層顯像劑，被用于心肌缺氧[11]、腫瘤[12]以及卒中樣腦病[13]的檢測.1994年，Wada等[14]發(fā)現(xiàn)該化合物對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷具有良好的保護作用.近年，Hung等[15]將Cu(ATSM)應用于4種帕金森動物模型，發(fā)現(xiàn)其具有保護神經(jīng)，提高運動和認知功能，減少黑質(zhì)細胞的丟失，增加多巴胺代謝等作用.鑒于其市場前景，本文建立了一種高效液相色譜法測定Cu (ATSM)混懸劑含量的方法，并對該方法進行了方法學考察.該法簡便，準確可靠，可為Cu(ATSM)制劑的質(zhì)量控制提供可行的參考.

圖1 分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structural formula of Cu(ATSM)

1 試藥與儀器

1.1 試藥

Cu(ATSM)混懸劑(批號:2015122902，2015122903，2015122904，規(guī)格:60 mg/10mL，四川大學華西醫(yī)院再生醫(yī)學研究中心制備)；Cu(ATSM)原料藥(批號:20151101，四川大學華西醫(yī)院再生醫(yī)學研究中心制備).Cu(ATSM)對照品(美國Sigma公司，含量≥98%)；水為超純水；乙腈為色譜純；三氟乙酸為色譜純；其它試劑均為分析純.

1.2 儀器

1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫)；色譜柱為C18柱(Thermo，250×4.6 mm，5 μm)，預備柱(phenomenex，分析型KJO-4282).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(0.1%三氟乙酸)(梯度洗脫，0～20 min，20:80～0:100)為流動相；檢測波長305 nm；流速1.0 mL/min，柱溫為27℃.理論塔板數(shù)按Cu(ATSM)峰計算應不低于20000.Cu(ATSM)峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應符合藥典要求.

2.2 溶液的配制

供試品品溶液:Cu(ATSM)混懸劑取樣前搖勻，精密量取0.2 mL，置50 mL量瓶中，以50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)為溶劑溶解并定容，搖勻，即得.

對照品溶液:另取Cu(ATSM)對照品適量，精密稱定，加50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)溶解并定量稀釋制成25 μg·mLˉ1的對照品溶液.

陰性對照溶液:除不加Cu(ATSM)外，其他輔料按制劑處方工藝制得空白制劑.取適量，加50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)溶解(與供試品溶液濃度相當)，即得.

2.3 線性關系及范圍

取Cu(ATSM)對照品適量，精密稱定，以50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)為溶劑，制成含Cu(ATSM)5、10、25、50、100 μg·mLˉ1的對照品溶液，進樣20 μL.以峰面積對Cu(ATSM)的濃度進行線性回歸，得回歸方程為:Y＝65.54X-358.23，(r＝0.9967)，即Cu (ATSM)濃度X與峰面積Y在5～100 μg·mLˉ1范圍內(nèi)線性關系良好.檢測限為2 ng(S/N＝3，n＝3)，定量限為5 μg·mLˉ1.

2.4 專屬性考察

分別取“2.2”項下的空白輔料溶液、Cu(ATSM)供試品溶液、對照品溶液各進樣20 μL，記錄色譜圖(圖2).結(jié)果空白輔料在Cu(ATSM)峰處無干擾，Cu (ATSM)與相鄰雜質(zhì)峰的分離度符合《中國藥典》要求.

圖2 Cu(ATSM)混懸劑的陰性對照(A)、對照品(B)及供試品(C)色譜圖Fig.2 Chromatograms of negtive control(A)，reference substance(B)and sample(C)

2.5 精密度試驗

25 μg·mLˉ1的Cu(ATSM)對照品溶液，進樣體積為20 μL，重復進樣5次，峰面積的RSD為0.083% (n＝5).

2.6 重復性試驗

取同一批樣品(批號:2015122902)，按“2.2”項下供試品溶液的制備方法平行制備6份，進樣20 μL，按外標法測定含量(標示量%)，結(jié)果測得平均含量為100.3%，RSD＝1.82%(n＝6).

2.7 回收試驗

于空白輔料中加入一定量的Cu(ATSM)對照品，加50%乙腈(含0.1%三氟乙酸)溶液制成25 μg· mLˉ1的溶液，平行制備6份，進樣20 μL，按外標法測定含量，計算平均回收率為103.0%，RSD＝1.98%.

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性考察

按“2.2”項下方法制備供試品溶液(批號: 2015122902)，置室溫下于不同時間(1、2、3、5、7、9 h)分別進樣20 μL，結(jié)果峰面積的RSD＝0.11%，表明供試品溶液在9 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.9 樣品含量測定

3批制劑按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液與對照品溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算混懸劑中Cu(ATSM)的標示百分含量，結(jié)果3批樣品含量分別為96.4%、96.2%和98.6%.

3 討論

本文在流動相條件篩選過程中發(fā)現(xiàn)，采用等度洗脫時，雜質(zhì)峰個數(shù)較少，可能雜質(zhì)峰被主峰掩蓋或保留在色譜柱上而未洗脫出來，故嘗試梯度洗脫系統(tǒng)，以20%乙腈開始洗脫，20 min內(nèi)線性上升到100%乙腈，能將主峰前后的主要雜質(zhì)峰全部洗脫出來，雜質(zhì)峰個數(shù)最多，并且Cu(ATSM)峰保留時間適宜，主峰的理論塔板數(shù)和拖尾因子，以及與相鄰雜質(zhì)峰分離度符合藥典規(guī)定，能滿足定量分析的要求.

本文在樣品溶劑選擇方面，首先選擇對Cu (ATSM)具有較好溶解性的乙腈作為溶劑制備供試品以及對照品溶液，結(jié)果進樣量較小(5 μL)時，Cu (ATSM)峰對稱因子能達到系統(tǒng)適用性試驗要求，而增加至20 μL后出現(xiàn)比較嚴重的前延峰.同時，實驗發(fā)現(xiàn)在本法線性范圍內(nèi)，當進樣體積相同(5 μL)時，Cu(ATSM)不同進樣量對其柱效影響不大，這表明柱效降低的現(xiàn)象不是因色譜柱超載問題產(chǎn)生的，可能是溶劑與流動相極性不匹配造成的，因此本文嘗試在溶劑中加入一定比例的水(含0.1%三氟乙酸)，通過比較保留時間，對稱因子，以及峰形，篩選出乙腈:水(0.1%三氟乙酸)＝50:50為最佳溶劑.與此同時，供試品溶液穩(wěn)定性試驗表明，9 h內(nèi)Cu(ATSM)的峰面積基本不變，不會因為溶劑中的三氟醋酸而發(fā)生降解.另一方面，三氟醋酸可與Cu(ATSM)形成離子對，能增加Cu(ATSM)的溶解度，改善其在ODS柱上的保留行為，改善峰形，克服峰展寬和拖尾問題.

[1]張勇倉，劉蘭，孫蕾.藏藥珊瑚七十味丸中重金屬含量的原子吸收分光光度法測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2016，27(1):58-59.

[2]旦增，盛德策，白瑪卓嘎.典型名貴藏藥重金屬含量分析及評價[J].中國醫(yī)藥科學，2013，3(18):42-44.

[3]旦增，許曄，胡忻，等.名貴藏藥“坐珠達西”重金屬含量分析及其毒性評價[J].西藏大學學報(自然科學版)，2013，28(1):32-36.

[4]杜玉枝，魏立新，呂坪，等.藏藥“帕朱膠囊”中微量元素及重金屬元素分析[J].廣東微量元素科學，2007，14(4):32-35.

[5]WESTER PO.Trace elements in human myocardial infarction determined by neutron activation analysis[J].Acta Medica Scandinavica，1965，178(6):765-788.

[6]ZAMA N，TOWNS RLR.Cardiac Copper，Magnesium，and Zinc in Recent and Old Myocardial-Infarction[J].Biological Trace Element Research，1986，10(3):201-208.

[7]MEDEIROS DM，WILDMAN RE.Newer findings on a unified perspective of copper restriction and cardiomyopathy[J].Proceedings of the Society for Experimental Biology＆Medicine Society for Experimental Biology＆Medicine，1997，215(4):299-313.

[8]MANN DL.Mechanisms and models in heart failure-A combinatorial approach[J].Circulation，1999，100(9):999-1008.

[9]DALLMAN PR.Cytochrome oxidase repair during treatment of copper deficiency-relation to mitochondrial turnover[J].Journal of Clinical Investigation，1967，46(11):1819-1827.

[10]JIANG Y，REYNOLDS C，XIAO C，et al.Dietary copper supplementation reverses hypertrophic cardiomyopathy induced by chronic pressure overload in mice[J].Journal of Experimental Medicine，2007，204(3): 657-666.

[11]LEWIS J，LAFOREST R，BUETTNER T，et al.Copper-64-diacetyl-bis (N4-methylthiosemicarbazone):An agent for radiotherapy[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98(3):1206-1211.

[12]LOPCI E，GRIZZI F，GRASSO I，et al.Early and late evaluation of solid tumours with 64Cu-ATSM PET/CT:a computer-aided fractal analysis [J].European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging，2015，42:S222-S223.

[13]YOSHII Y，YONEDA M，IKAWA M，et al.Radiolabeled Cu-ATSM as a novel indicator of overreduced intracellular state due to mitochondrial dysfunction:studies with mitochondrial DNA-less ρ0 cells and cybrids carrying MELAS mitochondrial DNA mutation[J].Nuclear Medicine＆Biology，2012，39(2):177-185.

[14]WADA K，F(xiàn)UJIBAYASHI Y，TAJIMA N，et al.Cu-ATSM，an intracellular-accessible superoxide dismutase(SOD)-like copper complex:evaluation in an ischemia-reperfusion injury model[J].Biological＆pharmaceutical bulletin.1994，17(5):701-704.

[15]HUNG LW，VILLEMAGNE VL，CHENG L，et al.The hypoxia imaging agent CuII(atsm)is neuroprotective and improves motor and cognitive functions in multiple animal models of Parkinson's disease[J].Journal of Experimental Medicine.2012，209(4):837-854.

(責任編輯:李建忠，付強，張陽，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

Determination of Cu(ATSM)in Cu(ATSM)suspension by HPLC

QIU Li-ying1，2，LUO Yao1，PAN Hong-yan1
(1.School of Pharmacy，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041 P.R.C.；2.Regenerative Medicine Research Center，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041 P.R.C.)

Objective To establish a HPLC mehod for the determination of Cu(ATSM)in Cu(ATSM)suspension.Methods This HPLC method was carried out by using ODS column and UV detection at 305 nm with gradient elution consisting of acetonitrile and water(0.1%trifluoroacetic acid).Result The calibration curve was linear(r＝0.9967)within the range of 5.0～100 μg· mLˉ1for Cu(ATSM)，and the limit of detection was 2 ng(S/N＝3).The average recovery was 103.0%with RSD of 1.98%(n＝6).Conclusion This method is simple，sensitive，accurate and specific.It is suitable for the quality control of Cu(ATSM) preparations.

HPLC；copper；Cu-diacetyl-bis(N4-methylsemithiocarbazone)

R284

A

2095-4271(2016)05-0507-04

10.11920/xnmdzk.2016.05.007

2016-07-26

仇麗穎(1980—)，女，漢族，遼寧沈陽人，副教授，博士，研究方向:藥物分析.E-mail:qiu7992＠sina.com

國家自然科學基金(81300107)；中國博士后科學基金(2013M542275)