呂志堂, 王 靜, 周燕霞, 張維維
(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071002;2.藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(河北大學(xué)),河北 保定 071002)
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α-變形菌綱新的保守特征性插入缺失
呂志堂1,2, 王 靜1, 周燕霞1, 張維維1
(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071002;2.藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(河北大學(xué)),河北 保定 071002)
在基于16S rRNA基因的分類系統(tǒng)中α-變形菌被定為變形菌門的一個(gè)綱。本文根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)分析,首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了α-變形菌綱普遍存在的5個(gè)保守特征性插入缺失(CSIs)。23S rRNA基因具有1個(gè)98~105 nt的特征性缺失和1個(gè)5~7 nt的特征性插入,DNA復(fù)制解旋酶(DnaB)具有1個(gè)17~29 aa的特征性插入,精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)具有1個(gè)15 aa的特征性插入,DNA促旋酶A亞基(GyrA)具有1個(gè)27~63 aa的特征性插入。α-變形菌綱的這些CSIs使得該綱與包括變形菌門其他綱在內(nèi)的其他細(xì)菌顯著區(qū)分開來,為該群細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育及系統(tǒng)分類研究提供了可靠手段。
α-變形菌綱;保守特征性插入缺失;系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)
α-變形菌綱(α-Proteobacteria)是變形菌門(Proteobacteria)7個(gè)綱之一,占據(jù)了包括多種陸地和海洋環(huán)境的廣泛的生態(tài)位,構(gòu)成了細(xì)菌域一個(gè)非常大且多樣性豐富的類群[1-3]。在《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(第2版)中,該綱被分為7個(gè)目,即紅螺菌目(Rhodospirillales)、立克次氏體菌(Rickettsiales)、紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)、鞘氨醇單胞菌目(Sphingomonadales)、柄桿菌目(Caulobacterales)、根瘤菌目(Rhizobiales)和短小盒菌目(Parvularculales)[4]。該綱細(xì)菌在形態(tài)、生理、代謝和細(xì)胞分裂機(jī)制方面呈現(xiàn)出極其豐富的多樣性特征,與真核生物密切相關(guān),在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都極為重要[1,5-7]。目前觀點(diǎn)認(rèn)為,α-變形菌綱起源于ε和δ-變形菌綱之后,β和γ-變形菌綱之前[1,8-9]。盡管這個(gè)類群在16S rRNA和其他基因系統(tǒng)發(fā)育上與其他主要細(xì)菌類群顯著分開,但是沒有一套確切的分子標(biāo)準(zhǔn)可以給予該群明確的界定[1,5,8-11]。因此,如何從分子特征將α-變形菌綱與其他細(xì)菌類群予以區(qū)別成為亟待解決的問題。加拿大學(xué)者Gupta及其同事建立了一種基于保守特征性插入缺失(conserved signature indels, CSIs)研究細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和系統(tǒng)分類的有效方法,可以在分子水平區(qū)分細(xì)菌域的不同類群,并已經(jīng)鑒定了放線細(xì)菌門(Actinobacteria)、衣原體門(Chlamydiae)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、奇異球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、產(chǎn)液菌門(Aquificae)等許多細(xì)菌類群特有的CSIs[8,12-16]。目前,該方法已經(jīng)廣泛用于從種到門各個(gè)分類等級(jí)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育和系統(tǒng)分類研究,他們發(fā)現(xiàn)的放線菌23S rRNA基因特有的CSI甚至成為放線細(xì)菌門建立的主要依據(jù)之一[12-20]。Gupta研究組已經(jīng)描述了α-變形菌綱一些普遍存在的蛋白和幾個(gè)推測(cè)的蛋白中特有的CSIs,可以作為該類群的獨(dú)有分子特征,認(rèn)為α-變形菌綱與細(xì)菌域其他類群顯著不同,建議給予其細(xì)菌域門的地位[9,21-22]。隨著越來越多的微生物基因組被測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,在更大范圍內(nèi)通過比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)不同微生物類群的分子特征,尤其是CSIs已經(jīng)成為可能。本文報(bào)道α-變形菌綱5個(gè)新發(fā)現(xiàn)的CSIs。
1.1 材料
用于CSIs篩選的代表菌株涵蓋細(xì)菌域的25個(gè)門的所有主要類群,包括變形菌門α-變形菌綱60屬、β-變形菌綱8屬、γ-變形菌綱28屬、δ-變形菌綱18屬、ε-變形菌綱4屬、ξ-變形菌綱1屬和酸硫桿菌綱(Acidithiobacillia) 1屬,以及其他類群228屬。所有菌株的基因信息取自NCBI Reference Sequence數(shù)據(jù)庫(kù)[23](表1,由于篇幅所限,未列出各基因組序列號(hào))。
表1 本文所用基因組數(shù)據(jù)在細(xì)菌域各門分布情況
Table 1 The distribution of genome sequences used in this study within the domain Bacteria
門基因組數(shù)門基因組數(shù)門基因組數(shù)Proteobacteria120Fibrobacteres1Aquificae3Cyanobacteria4Spirochaetes5Nitrospirae1Thermotogae5Chloroflexi7Fusobacteria5Firmicutes49Tenericutes2Deinococcus?Thermus5Bacteroidetes3Chlamydiae3Planctomycetes6Chlorobi5Verrucomicrobia4Dictyoglomi1Actinobacteria65Lentisphaerae2Elusimicrobia1Deferribacteres3Synergistetes6Gemmatimonadetes1Chrysiogenetes1
1.2 方法
首先確定篩選CSIs的基本原則為該基因普遍存在于細(xì)菌域各類群中,功能保守且多為單拷貝基因(直系同源基因),即CSIs應(yīng)從核心基因中篩選。為避免基因組錯(cuò)誤注釋或假基因的影響,核心蛋白及rRNA基因序列信息分別用MUSCLE軟件[24]和Infernal軟件[25]進(jìn)行多重序列比對(duì)。某些代表菌株部分核心蛋白序列無(wú)法找到,可利用TBLASTN在未進(jìn)行注釋的基因組中檢索,得到由基因組錯(cuò)誤注釋或漏注釋導(dǎo)致的核心蛋白序列信息的缺失。比對(duì)后尋找潛在的α-變形菌綱的CSIs。CSIs的位置根據(jù)大腸埃希菌(Escherichiacoli)相關(guān)序列確定。為確保CSIs的可靠性,所有潛在的CSIs兩側(cè)均有保守區(qū)存在[8,12,16,26]。分別選擇含有及不含有CSIs的同源蛋白,截取包括兩側(cè)保守區(qū)在內(nèi)的插入缺失所在區(qū)域,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析,根據(jù)分析結(jié)果最終確定特征序列。
2.1 α-變形菌綱23S rRNA基因的CSIs
結(jié)果表明,α-變形菌綱菌株23S rRNA基因中存在98~105 nt缺失,該缺失未在其他細(xì)菌類群中發(fā)現(xiàn)(部分比對(duì)結(jié)果見圖1)。α-變形菌綱23S rRNA基因中的特異缺失可將其與變形桿菌門其他綱明顯區(qū)別。值得注意的是,α-變形菌綱23S rRNA中這段特異缺失與之前介紹的放線菌綱100 nt特異插入序列毗鄰。因此,含有該缺失的片段可利用放線菌綱23S rRNA基因特異引物擴(kuò)增得到,通過瓊脂糖凝膠電泳即可將α-變形桿菌綱菌株與其他細(xì)菌類群分開[15]。
圖1 α-變形菌綱23S rRNA基因中特有的98~105 nt插入缺失序列Fig.1 The 98~105 nt characteristicindels of α-Proteobacteria within 23S rRNA gene sequence
此外,除柄桿菌目(Caulobacterales)和生絲單胞菌科(Hyphomonadaceae)外,其他α-變形菌23S rRNA基因序列中還存在5~7 nt 的插入(篇幅所限,本文僅給出部分比對(duì)結(jié)果,見圖2)。這段特征插入的缺失,顯示柄桿菌目和生絲單胞菌科之間在進(jìn)化上存在共性。
圖2 α-變形菌綱23S rRNA基因中特有的5~7 nt插入缺失序列Fig.2 The 5~7 nt characteristicindels of α-Proteobacteria within 23S rRNA gene sequences
2.2 α-變形菌綱DnaB中的CSIs
2005年,Gupta[9]發(fā)現(xiàn)在α-變形菌綱DNA復(fù)制解旋酶蛋白(DnaB)保守區(qū)存在8~14 aa插入,這段插入為α-變形菌綱所特有。本研究發(fā)現(xiàn),在DnaB碳末端,α-變形菌綱存在另一段17~29 aa保守特征性插入,部分比對(duì)序列見圖3。除鞘氨醇單胞菌目(Sphingomonadales)和紅螺菌目(Rhodospirillales)該段特征插入為25~29 aa外,其余α-變形菌綱成員特異插入長(zhǎng)度為17/18 aa。另外,在α-變形菌綱特異插入序列相同位置,ε-變形菌綱存在一段不同長(zhǎng)度的插入序列,除幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)該段插入為34 aa,包括該屬其他菌株在內(nèi)的ε-變形菌均含有21 aa插入。由于α-變形菌綱和ε-變形菌綱中存在的插入序列長(zhǎng)度不同且序列相似性低,因此基本可以判斷這兩段序列是獨(dú)立起源的。
2.3 α-變形菌綱ArgRS中的CSIs
根據(jù)HIGH-loop賴氨酸的有無(wú),Sekine等[27]將精氨酰-tRNA合酶(ArgRS)分為兩個(gè)主要類群:KMSK群和HIGH群,且這兩類同源蛋白序列相似性極低。除丙桿菌目(Caulobacterales)、細(xì)小棒菌目(Parvularculales)和生絲單胞菌科(Hyphomonadaceae)外,α-變形菌綱代表菌株所含ArgRS均屬于HIGH群,并且在該同源蛋白中均存在15 aa的插入。值得指出的是,這段15 aa的插入序列同樣存在于ζ-變形菌綱唯一已知種氧化亞鐵深海菌(Mariprofundusferrooxydans)中,而細(xì)菌域其他類群菌株內(nèi)同源蛋白中未發(fā)現(xiàn)存在這段CSIs序列(部分代表菌株比對(duì)序列信息見圖4)。同時(shí),在該插入序列中存在保守肽段Pro-Lys-Gly (PKG),因此,進(jìn)一步探究α-變形菌綱同源蛋白中存在的大片段的氨基酸插入及保守肽段的功能可能對(duì)了解該蛋白的作用機(jī)理具有重要作用。
圖4 α-變形菌綱精氨酰-tRNA合酶中保守特征性插入缺失序列Fig.4 The CSIs of α-Proteobacteria within amino acids sequencesof ArgRS
2.4 α-變形菌綱GryA中的CSIs
Gupta[8]曾報(bào)道在α、β、γ-變形菌綱DNA促旋酶A亞基(GyrA)同源蛋白中存在大片段的氨基酸插入,其中在α-變形桿菌綱中存在30 aa插入,而在β、γ-變形菌綱中存在34 aa插入。本研究結(jié)果顯示,除γ-變形菌綱中存在插入序列與報(bào)道一致外,α、β-變形菌綱中存在的插入序列長(zhǎng)度與報(bào)道不符。其中在α-變形桿菌綱同源蛋白相同位置處,僅存在26 aa的插入。絕大多數(shù)β-變形菌綱代表菌株插入片段長(zhǎng)度為34或36 aa,而伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)代表菌株同源蛋白相同位置處存在41或42 aa插入。另外,在酸桿菌門(Acidobacteria)和浮霉?fàn)罹T(Planctomycetes)代表菌株同源蛋白相同位置處分別存在34個(gè)和28 aa插入(部分序列比對(duì)信息見圖5)。
圖5 變形菌門各綱DNA促旋酶A亞基中保守特征性插入缺失序列Fig.5 The CSIs of each class of the phylum Proteobacteria within amino acids sequencesof GyrA
1992年Roller等[28]首次報(bào)道,與大腸埃希菌相比莢膜紅細(xì)菌(Rhodobactercapsulatus)23S rRNA基因存在103 nt序列缺失。之后,Ludwig等[29]提出23S rRNA中80 nt的缺失未在其他類群中發(fā)現(xiàn),因此,可能是α-變形菌綱代表菌株的特征序列。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,23S rRNA序列信息驟增,可以利用更多數(shù)據(jù)信息確定該缺失是否為α-變形菌綱菌株獨(dú)有特征。本研究通過對(duì)迄今為止數(shù)量最多、覆蓋最全的細(xì)菌基因組比對(duì),證實(shí)α-變形菌綱23S rRNA中存在98~105 nt缺失這一典型的CSIs,不僅可以區(qū)別于變形菌門其他綱,也與細(xì)菌域其他門顯著區(qū)別。這一發(fā)現(xiàn)支持將α-變形菌綱提升至細(xì)菌域一門水平的建議[9,21-22],同時(shí)也為這一類群菌株系統(tǒng)發(fā)育及系統(tǒng)分類提供了典型的分子特征。
本研究還首次發(fā)現(xiàn)了α-變形菌綱DnaB、ArgRS和GyrA各含有1個(gè)CSIs。根據(jù)聚類結(jié)果,α-變形菌綱柄桿菌目(Caulobacterales)、細(xì)小棒菌目(Parvularculales)和生絲單胞菌科(Hyphomonadaceae)ArgRS屬于KMSK群,其余屬于HIGH群;加之生絲單胞菌科和柄桿菌目成員23S rRNA基因均缺少5~7 nt的特征性插入,說明生絲單胞菌科與柄桿菌目比與紅桿菌目(Rhodobacterales)關(guān)系更近。
新發(fā)現(xiàn)的α-變形菌綱這些CSIs使得該綱與包括變形菌門其他綱在內(nèi)的其他細(xì)菌顯著區(qū)分開來,為該群細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育及系統(tǒng)分類研究提供了可靠手段。
同時(shí),研究表明,幽門螺桿菌的DNA復(fù)制解旋酶(HpDnaB)碳末端34個(gè)插入氨基酸對(duì)維持該蛋白結(jié)構(gòu)完整性和活性都是必須的[30]。然而,去除大腸埃希菌DNA復(fù)制解旋酶(EcDnaB)碳末端55個(gè)氨基酸并不會(huì)影響該蛋白體外ATP酶活和解旋酶活[31]。我們發(fā)現(xiàn)α-變形菌綱和ε-變形菌綱DnaB中存在獨(dú)立起源、長(zhǎng)度不等、總體較長(zhǎng)但序列相似性很低的CSIs,它們可能對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)及酶活也具有獨(dú)特作用。同樣,研究在α-變形菌綱ArgRS、GyrA中存在的大片段的氨基酸插入及保守肽段的功能,可能對(duì)了解這些蛋白的作用機(jī)理具有重要作用。
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Novel Conserved Signature Indels of the Class α-Proteobacteria
LYU Zhi-tang1,2, WANG Jing1, ZHOU Yan-xia1, ZHANG Wei-wei1
(1.CollegeofLifeSciences,HebeiUniversityandKeyLaboratoryofMicrobialDiversityResearchandApplicationofHebeiProvince,Baoding, 071002; 2.KeyLaboratoryofMedicinalChemistryandMolecularDiagnosisoftheMinistryofEducation(HebeiUniversity),Baoding071002)
α-Proteobacteriaare currently recognized as a class within the Proteobacteria phylum on the basis of 16S rRNA trees. In this work, five conserved signature indels (CSIs)widely distributed within the class α-Proteobacteria are found and described based on phylogenomics analysis, which are distinctive characteristics of the α-Proteobacterial species and are not found in any other groups of bacteria. The identified signatures include a 98 to 105 nt deletion and a 5-7 nt insertion in 23S rRNA, a 17-29 aa insert in replicative DNA helicase (DnaB), a 15 aa inserts in arginyl-tRNA synthase(ArgRS), and a 27-63 aa insert in DNA gyrase A subunit(GyrA).The presence of these characteristic sequences within α-Proteobacteria shows that this group can be distinguished from all other bacteria including other classes in the Proteobacteria thus provide an powerful approaches for better understand of phylogeny and systematics of this group.
α-Proteobacteria; conserved signature indels (CSIs); phylogenomics
呂志堂,博士,河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授、碩士生導(dǎo)師,生物技術(shù)系主任。兼任河北省微生物學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)、河北省生物工程學(xué)會(huì)常務(wù)理事、中國(guó)微生物學(xué)會(huì)永久會(huì)員、BISMiS創(chuàng)始會(huì)員、《微生物學(xué)雜志》編委和河北大學(xué)教指委委員等。長(zhǎng)期從事微生物資源與系統(tǒng)學(xué)研究及相關(guān)課程的教學(xué),省級(jí)精品課《微生物學(xué)》負(fù)責(zé)人;主持和參加完成國(guó)家自然科學(xué)基金、河北省自然科學(xué)基金和載人航天預(yù)研項(xiàng)目等14項(xiàng),目前承擔(dān)國(guó)家科技重大專項(xiàng)、河北省自然科學(xué)基金和企業(yè)合作項(xiàng)目等4項(xiàng);發(fā)表論文40余篇,其中SCI收錄論文10余篇;在國(guó)際上首先將包括核糖體蛋白在內(nèi)的核心蛋白序列用于微生物系統(tǒng)學(xué)研究,證明串聯(lián)核糖體蛋白序列和核心蛋白序列較之16S rRNA基因序列能更好的揭示微生物的進(jìn)化關(guān)系,相關(guān)研究論文被BioMedLib評(píng)為2012年以來Top 20 Articles第5。獲河北省科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)和河北省自然科學(xué)三等獎(jiǎng)各1項(xiàng),發(fā)明專利1項(xiàng),出版專著1部,教材2部。
河北省生物工程重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(1050-5030023);河北省生物學(xué)強(qiáng)勢(shì)特色學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(1050-5030004)
呂志堂 男,教授,碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與系統(tǒng)學(xué)。Tel:0312-5079364, E-mail:lzt325@126.com
2016-01-12
Q933
A
1005-7021(2016)02-0001-07
10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.001