不同批次復(fù)方木雞顆粒中無機(jī)元素的差異分析

王 巖 包永睿，2，3 孟憲生，2，3* 王 帥，2，3

李天驕1，2，3 宋玉榮4 張秀君4

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不同批次復(fù)方木雞顆粒中無機(jī)元素的差異分析

王 巖1包永睿1，2，3孟憲生1，2，3*王 帥1，2，3

李天驕1，2，3宋玉榮4張秀君4

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 116600；

2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600；

3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600；

4.丹東藥業(yè)集團(tuán)有限公司，遼寧 丹東 118002)

目的 通過測(cè)定8批復(fù)方木雞顆粒中無機(jī)元素的含量，擬從無機(jī)成分的角度探討復(fù)方木雞顆粒的特征元素。方法 采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)，以半定量分析的方式測(cè)定8批次復(fù)方木雞顆粒無機(jī)元素的含量，建立復(fù)方木雞顆粒無機(jī)輪廓譜，并對(duì)其差異元素中的重金屬元素和人體有益元素進(jìn)行全定量測(cè)定，同時(shí)，采用聚類分析和主成分分析，對(duì)其特征元素進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 構(gòu)建了復(fù)方木雞顆粒無機(jī)元素的輪廓譜，通過聚類分析和主成分分析共找到6個(gè)特征元素，包括Ca、Mg、Mn、K、Cr、Ni。結(jié)論 從無機(jī)成分的角度明確了復(fù)方木顆粒的特征元素，為進(jìn)一步探究復(fù)方木雞顆粒的藥效研究提供理論依據(jù)。

復(fù)方木雞顆粒；ICP-MS；聚類分析；主成分分析

復(fù)方木雞顆粒來源于民間驗(yàn)方“木雞湯”的滿族藥，收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十六冊(cè)；由云芝提取物、菟絲子、山豆根和核桃楸皮等四味中藥組成，在臨床上主要用于肝炎、肝硬化、肝癌等疾病的治療[1-2]。由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)可能為有機(jī)成分和無機(jī)成分的協(xié)同作用[3-4]，前期文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，主要從有機(jī)成分的角度闡述了復(fù)方木雞顆粒治療系列肝病的物質(zhì)基礎(chǔ)，而從無機(jī)元素角度的研究方法甚少報(bào)道。雖然，微量元素在人體中所占比重極小，但其對(duì)人體的健康卻起著至關(guān)重要的作用[5-6]，因此，有必要進(jìn)一步全面地明確其無機(jī)元素與藥效之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)以復(fù)方木雞顆粒為研究對(duì)象，收集8種不同批次的復(fù)方木雞顆粒成方制劑，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)，對(duì)其無機(jī)元素進(jìn)行全定量和半定量檢測(cè)，從無機(jī)成分的角度對(duì)其微量元素的分布特征及含量的差異進(jìn)行分析，建立復(fù)方木雞顆粒無機(jī)元素的輪廓譜，并通過聚類分析和主成分分析，得到影響復(fù)方木雞顆粒質(zhì)量的特征元素，從而為開展復(fù)方木雞顆粒中無機(jī)元素與藥效的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)，并為以藥效為導(dǎo)向的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

新儀 MDS-6型穩(wěn)壓雙控微波消解/萃取儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)；Aglient7500a型ICP-MS(美國安捷倫公司)； BP210S型電子分析天平(西化儀(北京)科技有限公司)；微量移液器 (法國吉爾森公司)；101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；去離子水Mil-Q純水系統(tǒng)(Millipore)。

1.2 試 劑

硝酸(優(yōu)級(jí)純GR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，K、Ca、Na、Mg質(zhì)量濃度均為1 μg/mL，As、Cd、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Zn質(zhì)量濃度均為0.01 μg/mL)；Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg·mL-1，美國Accustandard Inc.公司)；內(nèi)標(biāo)液(Li、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1，美國安捷倫科技有限公司)；調(diào)諧液(Li、Y、Ce、Ti、Co質(zhì)量濃度為10 μg·L-1，美國安捷倫科技有限公司)；氬氣(高純氬氣φ(Ar)>99.99%)；水為超純水。

1.3 藥 材

不同批次的復(fù)方木雞顆粒均來自丹東藥業(yè)集團(tuán)有限公司。各樣品編號(hào)對(duì)應(yīng)的各生產(chǎn)批號(hào)如表1。

表1 復(fù)方木雞顆粒生產(chǎn)批號(hào)信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器工作條件

RF功率1.3 kW，等離子體流量15 L·min-1，載氣流量1.16 L·min-1，采樣深度8.9 mm，霧室溫度2 ℃，分析時(shí)間3 s，測(cè)量次數(shù)3次。

2.2 供試品溶液制備

取8批次復(fù)方木雞顆粒，每份樣品精確稱取約0.10 g，一式3份，精密加入5 mL濃硝酸，置于耐壓耐高溫消解罐中，按表2條件進(jìn)行消解，待冷卻后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，同時(shí)，空白對(duì)照樣品采用同樣的方式進(jìn)行消解。

表2 微波消解條件

2.3 全定量分析方法的建立

2.3.1 復(fù)方木雞顆粒中無機(jī)元素的半定量測(cè)定及篩選 取8批復(fù)方木雞顆粒，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下儀器工作條件進(jìn)行無機(jī)元素的半定量檢測(cè)得到Na、Mg、K、Ca、Zn等54種無機(jī)元素，并應(yīng)用MPP軟件對(duì)半定量檢測(cè)到的54個(gè)無機(jī)元素進(jìn)行分析，得到36個(gè)差異元素，并對(duì)其中的4種宏量元素(Na、Mg、K、Ca)以及依據(jù)復(fù)方木雞顆粒樣品中半定量檢測(cè)的無機(jī)元素含量高低以及依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)微量元素生物活性的研究結(jié)果，優(yōu)選了 Cr、Mn、Ni、Zn元素，另外增加對(duì)人體有害的重金屬元素Cu、As、Cd、Hg、Pb共 13 種無機(jī)元素作為全定量分析的無機(jī)元素種類。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取混標(biāo)溶液各0、100、200、300、500 μL于100 mL容量瓶中，同時(shí)依次向5個(gè)容量瓶中分別添加0、10、20、30、50 μL Hg元素單標(biāo)溶液，用三級(jí)水定容至刻度，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，采集標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各元素相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0。

2.3.3 檢出限 根據(jù)檢出限測(cè)定方法，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，平行測(cè)定7次空白溶液，得到方法的檢出限Na為34.859 ng·L-1、Mg為7.603 ng·L-1、K為6.130 ng·L-1、Ca為22.961 ng·L-1、Cr為0.110 ng·L-1、Mn為0.086 ng·L-1、Ni為0.076 ng·L-1、Zn為2.105 ng·L-1、Cu為0.233 ng·L-1、As為0.478 ng·L-1、Cd為0.020 ng·L-1、Hg為0.106 ng·L-1、Pb為0.036 ng·L-1。

2.3.4 精密度 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下儀器工作條件，重復(fù)測(cè)量同一樣品6 次，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的規(guī)定范圍內(nèi)，計(jì)算各金屬元素含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果各元素RSD 均為0.28%～4.40%，符合有關(guān)規(guī)定，說明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性 按“2.2”項(xiàng)下方法制備同一批復(fù)方木雞顆粒6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下儀器工作條件測(cè)定各元素含量，經(jīng)計(jì)算各元素的RSD 均為0.16%～4.46%，符合有關(guān)規(guī)定，說明本法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、30、60、90、120、240 min 測(cè)定各元素含量，經(jīng)計(jì)算各元素的RSD 均為1.28%～4.73%，符合有關(guān)規(guī)定，說明各元素在240 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 復(fù)方木雞顆粒中無機(jī)元素的全定量檢測(cè) 同法取8批樣品制成供試品溶液，對(duì)13種無機(jī)元素進(jìn)行全定量檢測(cè)，扣除空白樣本本底的干擾后，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即得樣品中各待測(cè)元素的含量。結(jié)果見表3。

表3 復(fù)方木雞顆粒中13種無機(jī)元素全定量測(cè)定結(jié)果(n=3) 單位：ng·g-1

注：“—”代表低于檢出限。

由表3可知，其中重金屬元素As含量低于檢出限，Cu≤0.414 ng/g、Cd≤0.049 ng/g、Hg≤1.166 ng/g、Pb≤0.090 ng/g；根據(jù)《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定(Pb≤5.0 mg/kg、Cd≤0.3 mg/kg、Hg≤0.2 mg/kg、As≤2.0 mg/kg)發(fā)現(xiàn) As、Cu、Cd、Hg、Pb等5種重金屬元素地含量限度均符合相關(guān)規(guī)定[7]。

2.3.8 差異元素的聚類分析 聚類分析是一種探索性分析方法，并根據(jù)一組數(shù)據(jù)的內(nèi)在規(guī)律較合理地將其分類[8]，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MPP軟件對(duì)13種無機(jī)元素進(jìn)行了聚類分析。其結(jié)果見圖1。

圖1 差異元素的聚類分析

由圖1可知，除As元素以外，其他12種元素為影響8個(gè)批次復(fù)方木雞顆粒分兩類的主要因素。其中3號(hào)樣品與4號(hào)樣品親緣關(guān)系相近，6號(hào)樣品與7號(hào)樣品親緣關(guān)系相近，并與其他樣品親緣關(guān)系較近。

2.3.9 差異元素的主成分分析 主成分分析是一種將多個(gè)指標(biāo)降為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)的一種統(tǒng)計(jì)方法。即用少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)來反映大量原始指標(biāo)的主要信息[9]，為進(jìn)一步明確差異元素在復(fù)方木雞顆粒中貢獻(xiàn)率的大小，對(duì)其差異元素進(jìn)行了主成分分析，結(jié)果見表4。

表4 主成分因子總體描述

由表4中可以看到總方差的 81.910%的貢獻(xiàn)來自前 2 個(gè)因子， 即一個(gè) 2 因子模型解釋了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的 81.910%。由因子載荷矩陣可知，第 1個(gè)主因子表明其與 Cr、Ni高度正相關(guān)；第 2 個(gè)主因子表現(xiàn)出其與Ca、Mg、Mn、K正相關(guān)；因?yàn)榭偡讲?81.910% 的貢獻(xiàn)來自第 1 和第 2 個(gè)主因子，所以可以認(rèn)為Ca、Mg、Mn、K、Cr、Ni是復(fù)方木雞顆粒的特征性無機(jī)元素；其貢獻(xiàn)由大到小的順序?yàn)镃a,Mg,Mn,K,Cr,Ni。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用了ICP-MS技術(shù)并結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析軟件，分析了復(fù)方木雞顆粒中54個(gè)元素的半定量結(jié)果，并從無機(jī)元素的角度建立了復(fù)方木雞顆粒的輪廓譜，通過本實(shí)驗(yàn)的聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3號(hào)(151107100)與4號(hào)(16010188)樣品相近；6號(hào)(151201100)與7號(hào)(151202101)樣品相近，并與其他號(hào)樣品較相近，其分類的原因可能與原藥材中某些成分存在一定差異有關(guān)，因此，通過檢測(cè)無機(jī)元素的差異以及結(jié)合有機(jī)成分的含量來判斷原藥材的品質(zhì)，進(jìn)而為穩(wěn)定木雞顆粒的生成工藝奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，經(jīng)主成分分析獲得了復(fù)方木雞顆粒的特征元素，即Ca、Mg、Mn、K、Cr、Ni元素，其貢獻(xiàn)由大到小的順序?yàn)镃a,Mg,Mn,K,Cr,Ni。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)不同批次復(fù)方木雞顆粒的無機(jī)元素，篩選出對(duì)人體有益的和重金屬元素并對(duì)其進(jìn)行了全定量分析，其中的重金屬元素含量限度均符合相關(guān)規(guī)定，與此同時(shí)，明確了影響復(fù)方木雞顆粒分類的差異元素，因此，可通過控制差異元素的含量來改善由原料藥導(dǎo)致不同批次復(fù)方木雞顆粒的質(zhì)量差異；可為復(fù)方木雞顆粒質(zhì)量的穩(wěn)定性及重金屬元素含量的可控性奠定基礎(chǔ)，也為從無機(jī)與有機(jī)兩方面綜合評(píng)價(jià)復(fù)方木雞顆粒的質(zhì)量提供了有力補(bǔ)充。經(jīng)主成分分析，得到了復(fù)方木雞顆粒的特征元素，通過對(duì)特征元素的分析發(fā)現(xiàn)，微量元素與藥效之間有著密切的聯(lián)系，本實(shí)驗(yàn)為全面開展復(fù)方木雞顆粒無機(jī)元素與藥效間的關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為復(fù)方木雞顆粒的綜合利用與開發(fā)提供了參考。

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Difference Analysis of the Trace Elements in Different Batches of Compound Muji Granules

WANG Yan1, BAO Yongrui1,2,3, MENG Xiansheng1,2,3*,WANG Shuai1,2,3, LI Tianjiao1,2,3, SONG Yurong4, ZHANG Xiujun4

(1.College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600，China;2. Liaoning Province Component of traditional Chinese medicine and Engineering Research Center，Dalian 116600, China; 3. Liaoning Province Modern Traditional Chinese Medicine Research and Engineering Laboratory，Dalian 116600, China; 4. Dandong Pharmaceutical Group Co., Ltd., Dandong 118002, China)

Objective The trace elements in compound Muji Granules were determined, which was to investigate the features regularity of the trace elements from the point of view of inorganic composition. Methods Using inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) and by semi quantitative analysis of the determination of the content of eight batches of compound Muji granules of inorganic elements, establish compound Muji granules inorganic contour spectrum, and the heavy metal elements and the beneficial elements of the human body were measured quantitatively, and the characteristics of the elements were evaluated by cluster analysis and principal component analysis. Results The outline spectrum of inorganic element of compound Muji granules was constructed, and 6 feature elements, including Ca, Mg, Mn, K, Cr, Ni, were found by cluster analysis and principal component analysis. Conclusion From the point of view of inorganic composition, the characteristic elements of compound Muji granules were defined, which provided the theoretical basis for further research on the efficacy of compound Muji granules.

compound muji granules; ICP-MS; cluster analysis; principal component analysis

1006-446X(2016)12-0016-06

2016 - 08 - 02

王巖(1990—)，女(漢族)，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：藥物分析；E-mail：wyrose33@163.com

孟憲生(1964—)，男(漢族)，E-mail：mxsvvv@126.com

O 657.31

A