惡性淋巴瘤診斷中Ig/TCR基因重排的分子病理檢測分析

武鑫瑞 亓崠東 沈小英 屈悅 張立英 張玉萍 許春偉 吳繼華*

(1.解放軍306醫(yī)院病理科，北京 100101；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116001；3.北京新基永康基因科技有限公司，北京 100085；4.北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科，北京 100700；5.濰坊市人民醫(yī)院病理科，山東 濰坊 261041；6.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，北京 100071)

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惡性淋巴瘤診斷中Ig/TCR基因重排的分子病理檢測分析

武鑫瑞1亓崠東2沈小英1屈悅3張立英4張玉萍5許春偉6△吳繼華1*

(1.解放軍306醫(yī)院病理科，北京 100101；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116001；3.北京新基永康基因科技有限公司，北京 100085；4.北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科，北京 100700；5.濰坊市人民醫(yī)院病理科，山東 濰坊 261041；6.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，北京 100071)

目的 探討B(tài)細(xì)胞性淋巴瘤中Ig基因重排和T細(xì)胞性淋巴瘤中TCR基因重排的特點(diǎn)。方法 回顧性分析213 例惡性淋巴瘤和24例淋巴反應(yīng)性增生組織樣本，利用3730毛細(xì)血管電泳對提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測B細(xì)胞性淋巴瘤中Ig基因重排和T細(xì)胞性淋巴瘤中TCR基因重排。結(jié)果 B細(xì)胞性淋巴瘤中IgHA的總陽性率為43.21%，IgHB的總陽性率為29.63%，IgHC的總陽性率為30.25%，IgHD的總陽性率為16.67%，IgHE的總陽性率為3.09%，IgLκA的總陽性率為42.59%，IgLκB的總陽性率為23.46%，IgLλA的總陽性率為25.93%，IgH(A+B+C+D+E)+IgLκ(A+B)+IgLλA的總陽性率為88.27%；T細(xì)胞性淋巴瘤中TCRB-A的總陽性率為31.37%，TCRB-B的總陽性率為58.82%，TCRB-C的總陽性率為23.53%，TCRG-A的總陽性率為60.78%，TCRG-B的總陽性率為21.57%，TCRD的總陽性率為29.41%，TCRβ+TCRγ+TCRδ的總陽性率為78.43%。結(jié)論 Ig基因重排和TCR基因重排分別對B細(xì)胞性和T 細(xì)胞性淋巴瘤的診斷具有重要價(jià)值。

淋巴瘤； B細(xì)胞性； T細(xì)胞性； 基因重排； Ig基因； TCR基因

惡性淋巴瘤是一組起源于淋巴造血系統(tǒng)并具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤。近年來為適應(yīng)臨床診治的需求，不斷調(diào)整其病理分類[1]。WHO(2008版)造血和淋巴組織腫瘤分類是運(yùn)用病理形態(tài)學(xué)、免疫組化、分子遺傳學(xué)和臨床特征四者結(jié)合的分類系統(tǒng)，為惡性淋巴瘤精準(zhǔn)治療奠定了基礎(chǔ)[2]。惡性淋巴瘤中非霍奇金惡性淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)占絕大多數(shù)，因其亞型繁多、不典型和混合型存在，給病理診斷帶來諸多困難。基因重排檢測作為一項(xiàng)分子遺傳學(xué)診斷，為惡性淋巴瘤診斷提供了具有較高診斷價(jià)值的手段。其原理是一般Ig或TCR基因的多克隆性重排多為反應(yīng)性淋巴組織增生，而惡性淋巴瘤卻是所有細(xì)胞都來源于同一克隆的單克隆性重排，從而可以通過基因重排檢測來診斷淋巴瘤[3]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用3730毛細(xì)血管電泳分析B細(xì)胞性淋巴瘤的Ig基因重排和T細(xì)胞性淋巴瘤中的TCR基因重排，旨在探討Ig在B細(xì)胞性淋巴瘤和TCR基因重排在T細(xì)胞性淋巴瘤分型分類和鑒別診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 收集2013年1月至2015年12月間解放軍306醫(yī)院、大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院、北京軍區(qū)總醫(yī)院和山東省濰坊市人民醫(yī)院送檢的惡性淋巴瘤標(biāo)本213 例，淋巴反應(yīng)性增生組織24例。

1.1.2 主要試劑 rTaqDNA聚合酶、10×PCR buffer 購于TaKaRa公司；50 bp marker、2.5 mmol/L dNTP mixture、6×loading buffer 購于天根生化科技有限公司；QIAampDNA FFPE tissue Kit購于QIAGEN公司；引物及內(nèi)對照參考基因由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 根據(jù)組織大小切5～10片4 μm厚的石蠟切片，脫蠟；并按照QIAampDNA FFPE tissue Kit試劑盒說明步驟進(jìn)行操作。并用紫外分光光度計(jì)測定其純度和濃度備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 選用3730毛細(xì)血管電泳檢測Ig基因克隆性重排的47條引物(表1)[4]，引物組合后應(yīng)用于檢測重鏈(IgH)和輕鏈(IgLκ和IgLλ)，其中IgH分成5組: IgH-A、B、C、D、E，用于檢測VH-JH；IgLκ分成兩組，用于檢測Vκ-Jκ和Vκ-κde，包括IgLκ-A、B；IgLλ用于檢測Vλ-Jλ。TCR基因克隆性重排分析的56 條引物[4]，引物組合后用于檢測TCRβ、TCRγ、TCRδ鏈，其中TCRβ分成TCRB-A、B、C 3組，用于檢測Vβ-Jβ和Dβ-Jβ；TCRγ檢測Vγ-Jγ，包括TCRG-A、B兩組；TCRδ檢測Vδ-Dδ-Jδ。同時(shí)還包含了內(nèi)對照S引物4條，其擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度分別為101，200，300和395 bp。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 采用25 μL 擴(kuò)增體系：0.1 μmol /L引物，10×PCR buffer，0.2 mmol /L dNTP Mixture，2U rTaq DNA 聚合酶。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性，10 min；94 ℃，45 s；60 ℃，45 s；72 ℃，90 s；循環(huán)40次，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.4 毛細(xì)管電泳及基因掃描分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于ABI 3730XL遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用GeneMapper-v4.1軟件對基因掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為各管擴(kuò)增產(chǎn)物大小需落在有效檢測范圍內(nèi)，且收集到擴(kuò)增產(chǎn)物的不連續(xù)信號單峰視為陽性條帶，若未收集到熒光信號或搜集到表現(xiàn)為高斯分布的鐘形曲線連續(xù)熒光信號，則視為陰性結(jié)果。樣本DNA質(zhì)量分析為4條內(nèi)對照引物分別擴(kuò)增101，200，300，395 bp目標(biāo)條帶，用于評估所提組織DNA的質(zhì)量和完整性。如果標(biāo)本未能檢測出內(nèi)標(biāo)引物擴(kuò)增的目的條帶，則視為DNA質(zhì)量不合格，不繼續(xù)進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 B細(xì)胞性淋巴瘤Ig基因重排分析 B細(xì)胞性淋巴瘤Ig基因重排分析，見表1。14例淋巴組織反應(yīng)性增生中未擴(kuò)增出Ig基因的單克隆重排條帶。

表1 Ig基因重排類型與B細(xì)胞性淋巴瘤組織類型的關(guān)系

2.2 T細(xì)胞性淋巴瘤TCR基因重排分析 T細(xì)胞性淋巴瘤TCR基因重排分析，見表2。10例淋巴組織反應(yīng)性增生中未擴(kuò)增出任何TCR基因的單克隆重排條帶。

表2 51例TCR基因重排類型與T細(xì)胞性淋巴瘤組織類型的關(guān)系

3 討 論

惡性淋巴瘤作為常見腫瘤，近年來發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)明顯增加，其中發(fā)病率占惡性腫瘤的4%～5%，居第6位，死亡率占惡性腫瘤的3%～4%，居第9位[5]。國內(nèi)惡性淋巴瘤發(fā)病率和病死率分別居所有惡性腫瘤的第11位和第7位[6]。

非霍奇金惡性淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma, NHL)占惡性淋巴瘤的絕大多數(shù)[2-3]，從起源角度可分為B淋巴細(xì)胞(90%～95%)、T淋巴細(xì)胞(5%～7%)或自然殺傷NK細(xì)胞(<2%)[4]。B淋巴細(xì)胞編碼Ig肽鏈的基因，通過有序的V-D-J基因重排組合、拼接而成[4,7-8]。T淋巴細(xì)胞編碼于α、γ和β、δ肽鏈的基因，通過有序的由V-J-C和V-D-J-C基因重排組合、拼接而成，而且所有的腫瘤細(xì)胞都起源于同一克隆的單克隆性重排，表現(xiàn)為Ig基因或TCR基因的單克隆性重排。恰恰相反正常淋巴組織和反應(yīng)性淋巴組織增生組織細(xì)胞起源不同，為是Ig基因或TCR基因的多克隆性重排。

B細(xì)胞性淋巴瘤Ig基因重排方面陳愉等[9-10]檢測113例 B細(xì)胞性淋巴瘤發(fā)現(xiàn)IgH克隆性重排的陽性率為82.30%；潘鑫艷等[11]檢測46例彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)現(xiàn)IgH克隆性重排的陽性率為91.30%，Igκ克隆性重排的陽性率為82.61%，Igλ克隆性重排的陽性率為36.96%；本研究162例B細(xì)胞性淋巴瘤中IgHA的總陽性率為43.21%，IgHB的總陽性率為29.63%，IgHC的總陽性率為30.25%，IgHD的總陽性率為16.67%，IgHE的總陽性率為3.09%，IgLκA的總陽性率為42.59%，IgLκB的總陽性率為23.46%，IgLλA的總陽性率為25.93%，IgH(A+B+C+D+E)+IgLκ(A+B)+IgLλA的總陽性率為88.27%。

T細(xì)胞性淋巴瘤TCR基因重排方面陳愉等[11]檢測45例 T細(xì)胞性淋巴瘤發(fā)現(xiàn)TCRD陽性率為91.11%；張靜等[12]檢測50例T細(xì)胞性淋巴瘤發(fā)現(xiàn)TCRG、TCRB和TCRD基因重排陽性率分別為的標(biāo)本分別為94.00%，84.00%和36.00%，三者聯(lián)合檢出率為96.00%。本研究51例T細(xì)胞性淋巴瘤中TCRB-A的總陽性率為31.37%，TCRB-B的總陽性率為58.82%，TCRB-C的總陽性率為23.53%，TCRG-A的總陽性率為60.78%，TCRG-B的總陽性率為21.57%，TCRD的總陽性率為29.41%，TCRβ+TCRγ+TCRγ的總陽性率為78.43%。

綜上所述，NHL因?yàn)榉N類繁多、分類龐大，形態(tài)學(xué)及免疫組化結(jié)合基因重排對惡性淋巴瘤的診斷具有重要價(jià)值。

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The molecular pathology detection analysis of Ig/TCR gene rearrangement in malignant lymphoma diagnosis

WuXinrui1,QiDongdong2,ShenXiaoying1,QuYue3,ZhangLiying4,ZhangYuping5,XuChunwei6,WuJihua1.

1.DepartmentofPathology,the306HospitalofPLA,Beijing100101,China. 2.DepartmentofOncology,AffiliatedofZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China. 3.BeijingXinjiYongkangGeneScienceandTechnologyCo.,Ltd.,Beijing100085,China. 4.DepartmentofPathology,theMilitaryGeneralHospitalofBeijingPLA,Beijing100700,China. 5.DepartmentofPathology,ThePeople'sHospitalofWeifang,Weifang261041，China. 6.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofAcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100071,China.

Objective To analyze the character of the Ig gene rearrangement in B cell lymphoma and TCR gene rearrangement in T cell lymphoma. Methods A retrospective analysis of 213 cases of samples with malignant lymphoma and 24 cases of samples with reactive lymphoid hyperplasia, which were used to extract DNA for PCR amplification by 3730 capillary electrophoresis and had detected Ig gene rearrangement in B cell lymphoma and TCR gene rearrangement in T cell lymphoma. Results Among B cell lymphoma, the total IgHA positive rate was 43.21%, the total IgHB positive rate was 29.63%, the total IgHC positive rate was 30.25%, the total IgHD positive rate was 16.67%, the total IgHE positive rate was 3.09%,the total IgLκA positive rate was 42.59%, the total IgLκB positive rate was 23.46%, the total IgLκB positive rate was 25.93% and , the total IgH (A+B+C+D+E)+IgLκ (A+B)+IgLλA positive rate was 88.27%. Among T cell lymphoma, the total TCRB-A positive rate was 31.37%, the total TCRB-B positive rate was 58.82%, the total TCRB-C positive rate was 23.53%, the total TCRG-A positive rate was 60.78%, the total TCRG-B positive rate was 21.57%, the total TCRD positive rate was 29.41% and the total TCRβ+TCRγ+TCRδ positive rate was 78.43%. Conclusion It has an important value for Ig gene rearrangement in B cell lymphoma and TCR gene rearrangement.

Lymphoma； B cells； T cells； Gene rearrangement； Ig gene； TCR gene

R733.1

A

1000-744X(2016)09-0908-03

2016-06-06)

△*通信作者，△E-mail：xuchunweibbb@163.com；*E-mail：jh_02821@126.com