高表達(dá)ALDH2基因改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的初步研究*

胡秀英, 方 琴, 王季石, 馬 丹, 蔣 麗

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 血液內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院 藥劑科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

?

·基礎(chǔ)研究·

高表達(dá)ALDH2基因改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的初步研究*

胡秀英1, 方 琴2**, 王季石1, 馬 丹2, 蔣 麗2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 血液內(nèi)科， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬白云醫(yī)院 藥劑科， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的： 探討乙醛脫氫酶2(ALDH2)基因?qū)肴四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)后對(duì)其增殖和抗氧化損傷的影響。方法:將培養(yǎng)的HUVECs分為轉(zhuǎn)染目的基因組(轉(zhuǎn)基因組)、轉(zhuǎn)染空載體組(空質(zhì)粒對(duì)照組)和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組(陰性對(duì)照組)，轉(zhuǎn)基因組采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將含人ALDH2基因的真核表達(dá)載體導(dǎo)入HUVECs中，采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)各組ALDH2基因和蛋白的表達(dá)；采用不同濃度過氧化氫(H2O2)(0、50、75、100和125 μmol/L)孵育HUVECs 48 h后，檢測(cè)各組細(xì)胞增殖水平及氧化損傷程度，檢測(cè)各組細(xì)胞中血紅素氧合酶(HO-1)、 ROS及一氧化氮(NO)含量的變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)基因組熒光強(qiáng)度和數(shù)量比陰性對(duì)照組顯著提高，提示導(dǎo)入的ALDH2基因在HUVECs細(xì)胞得到高表達(dá)；與空質(zhì)粒對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染72 h后，轉(zhuǎn)基因組細(xì)胞ALDH2 mRNA和蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；不同濃度H2O2孵育48 h后，轉(zhuǎn)基因組HUVECs存活率明顯升高(P<0.05)；轉(zhuǎn)基因組可抑制一定濃度H2O2誘導(dǎo)的ROS水平的升高、 降低HO-1表達(dá)及增加NO的產(chǎn)生，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：ALDH2基因高表達(dá)可降低低氧自由基引起的HUVECs細(xì)胞的損傷，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能。

乙醛脫氫酶2； 轉(zhuǎn)染； 氧化損傷； 一氧化氮； 內(nèi)皮細(xì)胞

骨髓造血微環(huán)境內(nèi)有大量由血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)構(gòu)成的血竇存在，它與造血干細(xì)胞密切接觸，影響造血細(xì)胞的增殖與自我更新、遷移及定位[1]。然而，ECs在移植后，在機(jī)體病理狀態(tài)下易受到氧化應(yīng)激、炎癥因子以及藥物等刺激因素引起的損傷，而氧化應(yīng)激引起的損傷是內(nèi)皮損傷發(fā)生發(fā)展過程中的共同機(jī)制之一[2]。研究ECs氧化損傷機(jī)制及其保護(hù)對(duì)策，對(duì)于維持ECs功能的完整性，保護(hù)血管微環(huán)境，促進(jìn)造血重建具有積極的意義。乙醛脫氫酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)是乙醛脫氫酶(ALDH)家族中醛類代謝活性最強(qiáng)的同工酶，參與了各種內(nèi)源性和外源性脂肪族及芳香族醛類物質(zhì)代謝或解毒的過程，具有脫氫酶和酯酶等多種酶功能[3]。由于ALDH2在保護(hù)細(xì)胞抗毒性、抗氧化損傷及抗凋亡等方面的作用明顯，被廣泛的應(yīng)用于消化系統(tǒng)和心腦血管疾病等防治的研究中，但是在造血微環(huán)境的細(xì)胞內(nèi)皮功能方面研究較少，其改善血管內(nèi)皮功能作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究和和闡明[4-5]。本課題將ALDH2基因?qū)肴四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)探討其對(duì)HUVECs增殖和抗氧化損傷的影響，研究ALDH2基因改善血管內(nèi)皮功能的作用，為下一步研究其改善造血微環(huán)境的功能提供體外的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)細(xì)胞株由貴州醫(yī)科大學(xué)免疫細(xì)胞室提供并鑒定。真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-HisA+-ALDH2構(gòu)建方法由本實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)PCR、EcoR I及BamHI酶切及送金思特科技(南京)有限公司測(cè)序序列比對(duì)正確率100%[6-7]。THIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、LipofectamineTM2000(脂質(zhì)體)均為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品，MTT、DMSO為南京賽蘭博科技有限公司產(chǎn)品，L-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，鼠抗人ALDH2一抗、羊抗鼠二抗購(gòu)置中國(guó)臺(tái)灣Abnova公司，ALDH2、血紅素氧合酶1(HO-1)、β-actin引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)置南京建成生物工程研究所，ECL發(fā)光試劑由美國(guó)Santa Cruz公司提供，活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)和ALDH2轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立 HUVECs細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素和0.03% L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基，以5×104/mL細(xì)胞密度接種至50 mL培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)、傳代。實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染目的基因組(轉(zhuǎn)基因組)、轉(zhuǎn)染空載體組(空質(zhì)粒對(duì)照組)以及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組(陰性對(duì)照組)。 轉(zhuǎn)染前將待轉(zhuǎn)染人HUVECs細(xì)胞消化成懸浮狀態(tài)，以1×105/mL細(xì)胞密度接種于6孔板上，每孔3 000 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中備用；待6孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)至1.5×106/mL左右時(shí)，將含目的基因質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒各2 μg與脂質(zhì)體8 μL加入500μL不含血清雙抗的培養(yǎng)基中，混勻后室溫放置15 min后分別對(duì)應(yīng)加入轉(zhuǎn)基因組和空質(zhì)粒對(duì)照組。陰性對(duì)照組只加500 μL不含血清雙抗的培養(yǎng)基。將3組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后，向3組細(xì)胞中各加入5 mL預(yù)熱至37 ℃ 的DMEM 培養(yǎng)基(含血清及雙抗)繼續(xù)孵育。轉(zhuǎn)染48 h后的HUVECs細(xì)胞換用含500 mg/L G418的培養(yǎng)基，每3～5 d換液1次，篩選2周至抗性克隆形成后，換用250 mg/L G418繼續(xù)篩選1周得到轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞。

1.2.2 HUVECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況 采用間接免疫熒光法觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。將轉(zhuǎn)染24、48、72、 96和120 h后使各孔細(xì)胞貼附于玻片上，采用多聚甲醛固定10 min制成細(xì)胞爬片。pH7.4的0.01 mol/L PBS洗滌兩次，滴加含5%小牛血清的封閉液，37 ℃封閉30 min。PBS洗滌1次，每次5 min，滴加特異性ALDH2小鼠抗人一抗(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜。含0.5% Triton X-100的PBS洗滌3次，每次5 min，滴加熒光素標(biāo)記二抗(羊抗小鼠FITC-IgG，1∶100)，37 ℃，避光孵育30 min。含0.5% Triton X-100 的PBS洗滌3次后，伊文斯蘭染色，滴加10%甘油磷酸緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，拍照，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.2.3ALDH2 mRNA和蛋白的表達(dá)檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT- PCR)法檢測(cè)ALDH2 mRNA。收集各孔細(xì)胞，用TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)ALDH2 基因mRNA的表達(dá)。β-actin1作為內(nèi)對(duì)照,PCR引物如下：β-actin1上游5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′， 下游5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′(564 bp);ALDH2上游5′-GACACGGATCCATGTTGCGCGCTGCCGCCCGCTTCGG-3′，下游5′-GACACGAATTCTTATGAGTTCTTCTGAGGCACTTTGAC-3′(1 576 bp)。PCR 條件是94 ℃預(yù)變性5 min，然后35循環(huán)包括94℃變性50 s,65 ℃ 退火45 s；72℃延伸60 s，最后72 ℃延伸min。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液10 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，照相記錄結(jié)果。使用Bandscan軟件分析條帶結(jié)果，計(jì)算得到目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。 采用Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，將各孔細(xì)胞消化后，PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液100 μL在冰上裂解30 min，裂解過程反復(fù)劇烈振蕩。12 000 r/min離心15 min，吸取上清備用。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白含量。上述方法得來的樣品處理液加入上樣Buffer，然后放在沸水(>95 ℃)浴中加熱5 min使蛋白變性，作為點(diǎn)樣用樣品。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過SDS-聚丙酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)封閉液(5%脫脂奶粉，1×PBS，pH 7.4)封閉后加鼠抗人ALDH2一抗(1∶2 500)孵育2 h后洗滌，加入羊抗鼠二抗(1∶500)室溫孵育1 h，洗膜后用ECL試劑滴加在膜上，曝光顯影，洗出條帶。

1.2.4 過氧化氫(H2O2)細(xì)胞毒性 采用MTT法檢測(cè)H2O2細(xì)胞毒性。取各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105/mL，各取100 μL加入96孔板中，再分別加入不同濃度H2O2(0、50、75、100和125 μmol/L)孵育各組細(xì)胞24 h，每孔設(shè)6個(gè)復(fù)孔，以未加藥組為對(duì)照。37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48 h后，取出96孔板，每孔加MTT(5 g/L)液20 μL，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。1 500 r/min、37 ℃、離心5 min，吸棄上清。每孔加入二甲基亞砜100 μL,置搖床上搖10 min，使結(jié)晶充分溶解。選擇測(cè)定波長(zhǎng)570 nm(490 nm為對(duì)照)，酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度，并記錄結(jié)果。按公式計(jì)算存活率：存活率(%)=A試驗(yàn)組/A對(duì)照組×100% 。

1.2.5HO-1 mRNA檢測(cè) 經(jīng)不同濃度H2O2的DMEM培養(yǎng)基孵育48 h之后，收集各孔細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)HO-1 mRNA的表達(dá)。以β-actin2作為內(nèi)參, 反應(yīng)條件如前面所述，HO-1上游 5′-CAGGCAGAGAATGCTGAGTTC -3′，下游5′-GATGTTGAGCAGGAACGCAGT- 3′(550 bp)；β-actin2上游5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3′，下游5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3′(353 bp)。如前所述計(jì)算得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 ROS檢測(cè) 采用免疫熒光法檢測(cè)ROS，按照試劑盒說明書操作。取各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105/ mL，各取2.5 mL加入六孔板中，再加入2.5 mL含不同濃度H2O2的DMEM培養(yǎng)基(終濃度分別為0、50、75、100和125 μmol/L)，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。加入稀釋好的DCFH-DA 500 μL，37 ℃孵育20 min。DCFH-DA本身沒有熒光，但進(jìn)入細(xì)胞后，可被細(xì)胞內(nèi)酶水解生成DCFH，ROS可以氧化無熒光的DCFH 生成有熒光DCF, 檢測(cè)DCF 的熒光可反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗3次后，加入無血清培養(yǎng)液3 mL吹打均勻，在30 min時(shí)通過熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm。

1.2.7 NO含量檢測(cè) 采用硝酸還原酶法檢測(cè)NO的含量。按照NO檢測(cè)試劑盒說明，加入試劑混勻，室溫靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，550 nm，0.5 cm光徑,采用可見分光光度法測(cè)各管吸光度值。NO含量計(jì)算公式：NO含量(μmol/L)=((測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度))×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(100 μmol/L) ×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1ALDH2基因轉(zhuǎn)染情況

轉(zhuǎn)基因組熒光強(qiáng)度和數(shù)量比陰性對(duì)照組顯著提高，提示導(dǎo)入的ALDH2基因在HUVECs細(xì)胞得到高表達(dá)。24 h時(shí)，與陰性對(duì)照組相比，空質(zhì)粒對(duì)照組的熒光強(qiáng)度沒有明顯差別，但是轉(zhuǎn)染ALDH2基因的細(xì)胞可見微弱熒光；72 h時(shí)，ALDH2蛋白在轉(zhuǎn)基因組中呈現(xiàn)較高的表達(dá)。以72 h轉(zhuǎn)基因組細(xì)胞熒光強(qiáng)度為對(duì)照，24 h呈現(xiàn)較弱表達(dá)，48 h表達(dá)的熒光與72 h的熒光強(qiáng)度均屬?gòu)?qiáng)表達(dá)，96 h之后逐漸減弱，并且轉(zhuǎn)基因組的熒光至少可以維持7 d以上。見圖1。

A:陰性對(duì)照組48 h B：空載體對(duì)照組48 h C:轉(zhuǎn)基因組48 h

2.2ALDH2 mRNA和ALDH2蛋白的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)3組細(xì)胞的在轉(zhuǎn)染72 h后 mRNA的表達(dá),同時(shí)設(shè)立內(nèi)參。RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因組ALDH2的表達(dá)明顯比空質(zhì)粒對(duì)照組和陰性對(duì)照組高(P<0.01)(圖2)。Western Blot 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組在相對(duì)分子質(zhì)量54×103處出現(xiàn)較亮的目的條帶，空質(zhì)粒對(duì)照組和陰性對(duì)照組很弱，說明轉(zhuǎn)染基因ALDH2在蛋白水平得到表達(dá)(P<0.01)(圖3)。

2.3 HUVECs存活率

不同濃度H2O2孵育48 h后，轉(zhuǎn)基因組HUVECs存活率顯著高于空質(zhì)粒對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，n=6)(圖4)，顯示ALDH2基因轉(zhuǎn)染之后內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)H2O2引起的氧化損傷耐受增加。

2.4 ROS、HO-1mRNA和內(nèi)源性NO的表達(dá)

50、75、100和125 μmol/L H2O2孵育48 h, 各組HUVECs的ROS水平逐漸升高。與空質(zhì)粒對(duì)照組比較，75、100和125 μmol/L H2O2濃度下，轉(zhuǎn)基因組HUVECs可抑制H2O2誘導(dǎo)的ROS水平的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明在一定濃度范圍內(nèi)，ALDH2轉(zhuǎn)染能顯著降低H2O2誘導(dǎo)的ROS水平的增高。 不同濃度的H2O2孵育各組HUVECs細(xì)胞48 h, 各組HUVECs的HO-1表達(dá)水平逐漸升高。與空質(zhì)粒對(duì)照組及陰性對(duì)照組比較，在100、125 μmol/L H2O2濃度下，轉(zhuǎn)基因組HUVECs細(xì)胞HO-1mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。0、75、100和125 μmol/L H2O2濃度下孵育各組HUVECs細(xì)胞48 h,NO隨著H2O2濃度增大而降低。與空質(zhì)粒對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)基因組HUVECs在100和125 μmol/L H2O2濃度下NO的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見表1。

注：A為 RT-PCR電泳圖， B為 相對(duì)灰度值；(1)與陰性對(duì)照組、空質(zhì)粒對(duì)照組比較，P<0.01

注：A為 Western blot蛋白印跡圖，B為相對(duì)灰度值；(1)與陰性對(duì)照組、空質(zhì)粒對(duì)照組比較，P<0.01

(1)與同濃度H2O2處理的轉(zhuǎn)基因組比較，P<0.05；(2)與

3 討論

造血微環(huán)境(hematopoietic inductive microenvironment,HIM)是造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)定居、增殖、分化和發(fā)育的場(chǎng)所，主要由基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)組成。而內(nèi)皮細(xì)胞是基質(zhì)細(xì)胞組成的重要成分之一。對(duì)腫瘤患者放或化療及移植前預(yù)處理是損傷造血微環(huán)境的重要因素。該處理可產(chǎn)生大量的氧自由基及炎性因子，使得造血微環(huán)境中ROS大量堆積，損傷造血微環(huán)境，造血微環(huán)境中的多種基質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，影響造血重建。防護(hù)氧化損傷，對(duì)造血微環(huán)境的保護(hù)具有積極的意義。ALDH2是乙醛脫氫酶(ALDH)家族中醛類代謝活性最強(qiáng)的同工酶，過去的研究表明，ALDH2具有一定的抗氧化損傷的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)中將構(gòu)建的ALDH2真核表達(dá)載體導(dǎo)入HUVECs中，研究ALDH2過表達(dá)在該細(xì)胞中的生物學(xué)作用及是否具有改善內(nèi)皮功能的作用，為下一步明確其是否具有改善造血微環(huán)境及促進(jìn)造血重建的功能提供前期的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表1 不同濃度H2O2處理48 h后各組細(xì)胞HO-1 mRNA及ROS，NO水平(±s)Tab.1 HO-1 mRNA,ROS，NO levels in each cell group after treated with different concentrations of H2O2 for 48 h

本實(shí)驗(yàn)中，將構(gòu)建pcDNA3.1-ALDH2真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)HUVECs中，并得到穩(wěn)定表達(dá)。HUVECs具有內(nèi)皮細(xì)胞的大部分功能，所以我們選用該細(xì)胞系作為研究對(duì)象。為驗(yàn)證ALDH2促細(xì)胞增殖和抗氧化應(yīng)激引起的損傷的作用，我們選用了H2O2作為過氧化反應(yīng)的誘導(dǎo)劑，因?yàn)镠2O2是典型的O2還原生成H2O的過程中的代謝產(chǎn)物，它的重要的生物學(xué)意義在于產(chǎn)生高活性的羥基基團(tuán)，它的半衰期比ROS長(zhǎng)，在體外實(shí)驗(yàn)中常被用于誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度的增加，HUVECs明顯減少，而轉(zhuǎn)染ALDH2之后，細(xì)胞的損傷程度降低，細(xì)胞活性明顯比未轉(zhuǎn)基因組高。ALDH2可以保護(hù)HUVECs細(xì)胞對(duì)H2O2引起的損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖，該過程伴隨著ROS水平的降低，顯示其可能與防護(hù)過氧化損傷有光。

本試驗(yàn)中被激活的HO-1(也是一種熱休克蛋白)在轉(zhuǎn)染ALDH2之后隨著ROS的降低而降低。而在急性應(yīng)激反應(yīng)中，被激活的HO-1(也是一種熱休克蛋白)反應(yīng)了機(jī)體對(duì)氧化應(yīng)激的防護(hù)。HO-1在機(jī)體內(nèi)是可誘導(dǎo)的，可以被強(qiáng)烈的誘導(dǎo)來對(duì)細(xì)胞應(yīng)激和多種氧化刺激產(chǎn)生反應(yīng)，熱休克、重金屬、血紅素、應(yīng)激、低氧、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子及氧化劑等均可誘導(dǎo)HO-1的適應(yīng)性表達(dá)[8]。HO-1通過分解血紅素要消耗3分子O2，可消耗大量的內(nèi)源性ROS，減少組織的脂質(zhì)過氧化來發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。而且該過程伴隨著ROS水平的下降和可以在急性應(yīng)激反應(yīng)中被激活的HO-1(也是一種熱休克蛋白)的產(chǎn)生降低。ROS 和HO-1水平的下降可能是過氧化反應(yīng)的終末產(chǎn)物4-HNE被ALDH2清除之后，與過氧化損傷相關(guān)的信號(hào)通路以及其他重要分子的作用沒有被級(jí)聯(lián)放大的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HO-1的表達(dá)隨著H2O2濃度的增加而增加，但是在轉(zhuǎn)染ALDH2之后，伴隨著ROS的減少也隨之降低，進(jìn)一步說明在ALDH2轉(zhuǎn)染之后，細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的防護(hù)能力得到了顯著地提高。

NO是內(nèi)皮細(xì)胞釋放最為重要的內(nèi)皮源性血管舒張因子，除了能引起血管舒張外，還具有抑制炎性細(xì)胞的聚集分化、白細(xì)胞黏附、血小板聚集、平滑肌細(xì)胞增生等多種功能，對(duì)于維持血管內(nèi)皮功能具有重要的作用[9]。NO的水平高低也反映了內(nèi)皮功能的情況。我們也發(fā)現(xiàn)經(jīng)ALDH2基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力明顯高于轉(zhuǎn)空載體組及未轉(zhuǎn)基因組。因此，ALDH2可能通過促進(jìn)NO的產(chǎn)生發(fā)揮內(nèi)皮功能的保護(hù)效應(yīng)，但是ALDH2能否通過NO促進(jìn)VEGF的產(chǎn)生，從而促進(jìn)血管的生成，還值得我們進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)中，高表達(dá)ALDH2基因促進(jìn)HUVECs細(xì)胞的增殖并使HUVECs細(xì)胞對(duì)抗氧自由基引起的氧化損傷作用大大降低，該過程還伴隨著HO-1表達(dá)和ROS水平的降低以及NO的產(chǎn)生的增加，這對(duì)進(jìn)一步研究該基因在內(nèi)皮細(xì)胞功能的保護(hù)和造血微環(huán)境中扮演的生物學(xué)功能提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] Bianco P, Sacchetti B, Riminucci M. Osteoprogenitors and the hematopoietic microenvironment[J]. Best Pract Res Clin Haematol, 2011(24): 37-47.

[3] Lang XE, Wang X, Zhang KR, et al. Isoflurane preconditioning confers cardioprotection by activation of ALDH2 [J]. Trends Cardiovasc Med, 2013(8): e52469.

[4] Luo XJ, Liu B, Ma QL, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase, a potential drug target for protection of heart and brain from ischemia/reperfusion injury [J]. Curr Drug Targets, 2014 (10):948-955.

[5] Zhang Y, Gu N, Miao L, et al. Alcohol dehydrogenase-1B Arg47His polymorphism is associated with head and neck cancer risk in Asian: a meta-analysis [J]. Tumour Biol, 2015 (2):1023-1027.

[6] Hu XY, Fang Q, Wang JS, et al. Over-expression of aldehyde dehydrogenase-2 protects against H2O2-induced oxidative damage and apoptosis in peripheral blood mononuclear cells[J]. Acta Pharmacol Sin, 2011(32): 245-252.

[7] 王季石, 胡秀英, 方琴, 等. ALDH2基因?qū)雽?duì)K562細(xì)胞增殖和抗氧化損傷的影響[J]. 中華血液學(xué)雜志, 2010 (31): 721-725

[8] Durante W. Protective role of heme oxygenase-1 against inflammation in atherosclerosis [J]. Front Biosci (Landmark Ed), 2011(16):2372-2388.

[9] Qian J, Fulton DJ. Exogenous, but not Endogenous Nitric Oxide Inhibits Adhesion Molecule Expression in Human Endothelial Cells[J]. Front Physiol, 2012(3): 3.

(2016-07-22收稿，2016-10-30修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉 華

A Preliminary Study of Improving the Function of Vascular Endothelial Cells with High Expression of ALDH2 Gene

HU Xiuying1， FANG Qin2， WANG Jishi1， MA Dan2， JIANG Li2

(1.DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofPharmacy,theAffiliatedBaiyunHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the effect of aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) gene on the proliferation and anti-oxidative damage of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods: HUVECs were divided into 3 groups：transfected target gene group (transgenic group) transfected empty vector group(empty plasmid control group ) and non transfected plasmid group (negative control group). In the transgenic group, the eukaryotic expression vector containing human ALDH2 gene was introduced into HUVECs by liposome mediated method. Western blot RT-PCR were used to detect the expression of ALDH2 gene and protein in each group. Different concentration of H2O2(0, 50, 75, 100 and 125 μmol/L) were incubated with HUVECs. 48 hours later, the level of cell proliferation and the degree of oxidative damage were detected in the cells of each group and the changes of HO-1, ROS and NO level were detected in the cells of each group. Results: The fluorescence intensity and number of transgenic group were significantly higher than that of negative control group, suggesting that the ALDH2 gene was highly expressed in HUVECs cells. Compared with empty plasmid control group and negative control group, the expression of mRNA and protein of ALDH2 gene in the transgenic group were increased (P<0.01) 72 h after transfection. The survival rate of HUVECs cells in transgenic group was significantly increased (P<0.05) after 48 h incubation with different concentrations of H2O2. The transgenic group could inhibit the increase of ROS induced by a certain concentration of H2O2, reduce the expression of HO-1 and increase the production of NO, and the difference was statistically significant (P<0.05). Conclusion: High expression of ALDH2 Gene can reduce the damage of HUVECs cells induced by low oxygen free radicals, and protect the biological function of endothelial cells.

aldehyde dehydrogenase 2; transfection; oxidation damage; nitric oxide; endothelial cell

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81360501); 貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目[黔科合SY字(2012)3138]]； 貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目[黔科合LH字(2014)7130]； 貴州省省長(zhǎng)基金臨床應(yīng)用課題專項(xiàng)研究資助項(xiàng)目[黔省專合字(2012)97]

E-mail:fq_fangqin@sina.com

時(shí)間：2016-11-15 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.019.html

R34-33； R361

A

1000-2707(2016)11-1263-06

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.006