興義維蚋蚋卵(胚胎)原代培養(yǎng)細(xì)胞核型分析*

周 靜， 劉占鈺， 徐 旭， 崔立秋， 陳漢彬， 楊 明**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗科， 江西 贛州 341000； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝病實驗室， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

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·專題研究1·

興義維蚋蚋卵(胚胎)原代培養(yǎng)細(xì)胞核型分析*

周 靜1， 劉占鈺2， 徐 旭3， 崔立秋4， 陳漢彬4， 楊 明4**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗科， 江西 贛州 341000； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 肝病實驗室， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

目的： 分析興義維蚋蚋卵(胚胎)原代培養(yǎng)細(xì)胞核型。方法：應(yīng)用組織塊法處理野外采集興義維蚋蚋卵(胚胎)，以改良Shields and Sang M3為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH 6.0～6.5，置于28 ℃生化恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，選取10個處于有絲分裂增殖時期的細(xì)胞，通過秋水仙素處理，制作中期染色體標(biāo)本，進(jìn)行核型分析。結(jié)果：顯微鏡下觀察，前中期染色體為3對(2n=6)，染色體凝集程度未達(dá)最大化呈現(xiàn)長桿狀，染色體長度為9.43～13.58 μm；中期染色體為3對(2n=6)，高度凝集呈現(xiàn)短桿狀，染色體長度為2.43～4.67 μm，兩條中期染色體臂比值<1.67，屬中著絲粒染色體，4條染色體臂比值>1.67，屬亞中著絲粒染色體。結(jié)論：初步闡析了興義維蚋蚋卵(胚胎)原代培養(yǎng)細(xì)胞核型特征。

蚋科； 興義維蚋； 胚胎； 原代細(xì)胞； 核型分析

蚋類，俗稱黑蠅(blackflies)，是一類小型駝背的雙翅目吸血昆蟲，可在人類和禽畜中傳播盤尾絲蟲病(onchocerciasis)、禽鳥住白細(xì)胞蟲病(Leucocytozoonsis)和水泡性口炎(vesicular stomatitis)等，嚴(yán)重危害人類和禽畜的健康和安全，對蚋類生態(tài)習(xí)性的研究對蚋類的生物防治具有重要的理論和臨床意義。迄今，全球已知現(xiàn)生的2 151蚋種中，研究人員已對390種進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)研究[1-2]。蚋類細(xì)胞通過有絲分裂確保遺傳物質(zhì)傳遞，使得細(xì)胞分化和組織發(fā)生得以實現(xiàn)，確保了蚋蟲的生長發(fā)育。對于蚋類原代細(xì)胞染色體的核型分析，可以豐富蚋類遺傳學(xué)知識體系，指導(dǎo)蚋類分類系統(tǒng)研究，并為蚋類細(xì)胞系建立提供鑒定依據(jù)[3]。目前，國外學(xué)者對蚋類染色體在形態(tài)分類中的作用進(jìn)行了研究[4-6]，國內(nèi)學(xué)者主要對河南紡蚋、黑山水蚋和興義維蚋等唾腺多線染色體進(jìn)行研究[7-11]，這些研究主要是通過組織標(biāo)本進(jìn)行蚋類染色體研究，而對于蚋類細(xì)胞有絲分裂增殖過程中染色體的核型研究尚無相關(guān)報道。本研究以貴州省貴陽市郊區(qū)興義維蚋蚋卵(胚胎)為研究材料，在適宜的細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下對蚋卵(胚胎)組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，選取處于增殖生長旺盛時期的原代培養(yǎng)細(xì)胞，制備原代細(xì)胞前中期和中期染色體，進(jìn)行核型分析,以期為蚋類細(xì)胞系鑒定奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于原代細(xì)胞培養(yǎng)的組織均為蚋科前幼蟲期卵塊標(biāo)本，從貴陽市郊區(qū)(花溪、羊昌、烏當(dāng))野外采集蚋卵(胚胎)，未發(fā)育至前幼蟲期蚋卵可經(jīng)蚋類槽式循環(huán)飼養(yǎng)系統(tǒng)處理，待其發(fā)育至前幼蟲期(肉眼為棕黑色，鏡下通過透明卵殼可見紅眼點(diǎn)出現(xiàn)，破卵器形成)[1]，經(jīng)鑒定為興義維蚋后用于原代細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)及觀察 將野外采集的蚋卵(胚胎)從卵閥上分離，無菌水清洗4～5次進(jìn)行消毒前預(yù)處理；70%乙醇浸泡10 min，無菌水沖洗2～3次；1%過氧乙酸浸泡15 min，無菌水沖洗3～4次；2.8% NaClO浸泡5 min，無菌水沖洗4～5次[12]。將消毒好的蚋(卵)胚胎吸入2 mL離心管中，眼科剪剪碎，加入1/2體積的0.25%胰蛋白酶，27 ℃處理10 min，紗布過濾，濾液800 r/min，離心5 min，去除上清，應(yīng)用改良型Shields and Sang M3(20% FBS、500 U/mL青霉素、500 mg/L硫酸鏈霉素、12.5 mg/L兩性霉素B、5 mg/L胰島素)細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮組織細(xì)胞并計數(shù)，按1×105個/mL，接種于經(jīng)多聚賴氨酸 (PLL) 處理一次性塑料培養(yǎng)皿中，置于28 ℃生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。組織細(xì)胞懸液接種后，根據(jù)細(xì)胞生長情況，進(jìn)行1/2、1/3及1/4部分換液，倒置顯微鏡下定期觀察組織細(xì)胞的貼壁情況及細(xì)胞的遷移、增殖狀態(tài)，并拍照分析。

1.2.2 原代細(xì)胞染色體制備 選取處于有絲分裂增殖期的原代培養(yǎng)細(xì)胞，秋水仙素培養(yǎng)處理5～6 h，KCl低滲處理2次，Carnoy’s固定液固定后置于載玻片上，姬姆薩染色，中性樹膠封片。在40倍物鏡下尋找背景干凈、染色體分散較好的有絲分裂相，在100倍物鏡下CCD獲取染色體圖像。選取染色體分散較好的10個分裂相細(xì)胞，進(jìn)行染色體計數(shù)，測量染色體的長度，計算臂比值，對染色體進(jìn)行分類[13]。統(tǒng)計分析各條染色體的相對長度，根據(jù)相對長度對染色體進(jìn)行列隊，排出核型圖，進(jìn)行核型分析[14-16]。

2 結(jié)果

2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)

根據(jù)細(xì)胞生長情況，定期對原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行換液處理。蚋卵(胚胎)組織塊接種12 h后，組織細(xì)胞貼壁生長；培養(yǎng)1周，大量細(xì)胞從組織塊周圍脫落遷移生長。培養(yǎng)3周，可見圓形細(xì)胞有絲分裂為兩個子代細(xì)胞(圖1A)，細(xì)胞增殖較為明顯(圖1B)。該時期細(xì)胞增殖活躍，可作為蚋卵(胚胎)原代細(xì)胞核型分析材料。

2.2 核型分析

選取染色體分散較好的前中期或中期分裂相細(xì)胞共10個進(jìn)行拍照，顯示前中期染色體為3對(2n=6)，按照染色體長度進(jìn)行編號排序，3對染色體分別以Ⅰ1、Ⅰ2，Ⅱ1、Ⅱ2，Ⅲ1、Ⅲ2進(jìn)行編號，該期染色體長度為9.43～13.58 μm(表1)。中期染色體染色體為3對(2n=6)，染色體編號與前中期相同，該期染色體長度為2.43～4.67 μm，臂比值結(jié)果顯示2條染色體為中著絲粒染色體，4條染色體為亞中著絲粒染色體(表2)。蚋卵(胚胎)原代細(xì)胞染色體核型模式圖顯示：前中期染色體未達(dá)最大化凝集呈現(xiàn)長桿狀(圖2A),染色體數(shù)目2n=6，按照染色體長度進(jìn)行編號排序(圖2B)；中期染色體高度凝集呈現(xiàn)短桿狀(圖3A)，按照臂比值可劃分為中著絲粒和亞中著絲粒染色體，并對其進(jìn)行編號排序，其中中著絲粒染色體2條、占總?cè)旧w數(shù)目的1/3，亞中著絲粒染色體4條、占總?cè)旧w數(shù)目2/3(圖3B)。

表1 興義維蚋蚋卵前中期染色體長度

Tab.1 The measurement of prometaphase chromosomes ofSimulium(Wilhelmia)xingyiense

染色體編號前中期染色體長度(μm)Ⅰ113.58Ⅰ213.46Ⅱ111.25Ⅱ210.47Ⅲ19.57Ⅲ29.43

表2 興義維蚋蚋卵中期染色體絕對長度、相對長度、臂比值、染色體類型(x±s)

Tab.2 The statistics of metaphase chromosome ofSimulium(Wilhelmia)xingyiense

注：p為短臂，q為長臂，M為中央著絲粒，SM為亞中央著絲粒

3 討論

昆蟲核型分析是對細(xì)胞前中期和中期染色體數(shù)目、大小、形態(tài)等特征的分析研究[17]。對于遺傳疾病機(jī)制、物種親緣關(guān)系與進(jìn)化，遠(yuǎn)緣雜種的鑒定具有重要意義，同時也是建立細(xì)胞系時對不同物種來源細(xì)胞系鑒定的最佳方法[18-20]。

蚋類核型分析是蚋類遺傳防治和蚋類分類鑒定的重要實驗方法，本研究主要通過興義維蚋蚋卵(胚胎)原代細(xì)胞培養(yǎng)，選取細(xì)胞增殖過程中處于有絲分裂旺盛時期的原代細(xì)胞制作染色體，進(jìn)行核型分析。研究結(jié)果顯示興義維蚋前中期和中期染色體數(shù)目均為3對(2n=6)，中期染色體高度凝集長度在4 μm左右，Ⅰ號染色體具中央著絲粒，Ⅱ和Ⅲ號染色體均為亞中央著絲粒(圖3)。與黃麗等[10]制備興義維蚋唾腺多線染色體數(shù)目2n=6相一致。興義維蚋多線染色體是唾腺細(xì)胞中多股染色單體平行排列形成一種纜狀巨大染色體，長度在20 μm左右[8]。

本研究主要是展示了蚋類原代細(xì)胞有絲分裂過程中前中期和中期染色體核型特征，一方面可協(xié)助分子分類鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的種屬來源；另一方面，完善了蚋類原代細(xì)胞培養(yǎng)的歷史檔案，便于與后期建成的細(xì)胞系的核型特征進(jìn)行比較分析。不同蚋種來源細(xì)胞中期染色體在數(shù)量上較恒定(2n=6)。但對于不同蚋種細(xì)胞中期染色體大小、形態(tài)及帶型上的差異及規(guī)律還有待進(jìn)一步探索研究。

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注:A為兩個有絲分裂子代細(xì)胞，B為多個有絲分裂子代細(xì)胞

前中期染色體 前中期染色體核型

中期染色體 中期染色體核型

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(2016-07-30收稿，2016-11-11修回)

中文編輯： 周 凌； 英文編輯： 劉 華

Karyotype Analysis of Primary Cells Cultured from Blackfly Eggs(Embryos) ofSimulium(Wilhelmia)xingyiense

ZHOU Jing1, LIU Zhanyu2, XU Xu3, CUI Liqiu4, CHEN Hanbin4, YANG Ming4

(1.CollegeofBiologyandEngineering,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalCollege,Gannan341000,Jiangxi,China; 3.LiverDiseaseLaboratory,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 4.CollegeofBasicMedicalSciences,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To culture primary cells of blackfly eggs (embryos) and analyze their karyotype. Methods: The tissue block method was applied to treat the blackfly eggs (embryos) fromSimulium(Wilhelmia)xingyiensethat were collected in field. The blackfly eggs (embryos) were cultured in the modified Schneider's and Sang M3 medium at pH 6.0～6.5, and incubated in a biochemical incubator at 28 ℃. The primary cells in the mitotic and proliferative phase were selected and treated with colchicine, and their metaphase chromosomes were prepared for karyotype analysis. Results: The prometaphase chromosomes are 3 pairs(2n=6), which were not aggregated at a maximum degree and showed themselves long rhabditiform, and the length of chromosome is 9.43～13.58 μm. Metaphase chromosome was 3 pairs (2n=6), and which were highly aggregated and showed themselves short rhabditiform, and the length of chromosome was 2.43～4.67 μm. Two metaphase chromosomes' arm ratio is less than 1.67, belonging tocentric chromosome, and the 4 chromosomes' arm ratio is more than 1.67, belonging to the submetacentric chromosome. Conclusions: The karyotype characteristics of primary cells cultured from the blackfly eggs (embryos) ofSimulium(Wi.)xingyiensewere preliminarily elucidated in this study.

Simuliidae；Simulium(Wilhelmia)xingyiense; embryos; primary cells; karyotype analysis

國家自然科學(xué)基金(30660021)； 貴州省社會發(fā)展科技攻關(guān)計劃[黔科郝曉宇合(2012)3100]； 貴州省科技計劃項目[黔科合LH字(2016)7357]； 貴州醫(yī)科大學(xué)高等學(xué)校2015年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510660034)

?? E-mail:culex@gmc.edu.cn

時間：2016-11-15 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1164.R.20161115.1757.021.html

Q962； R384.5

A

1000-2707(2016)11-1241-04

10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.11.001