血液中酚類環(huán)境雌激素與子宮肌瘤關聯性的病例對照研究

徐潔，吳艷婷，許茜，盧清，任慕蘭，沈楊

(1.張家港市第一人民醫(yī)院 婦產科，江蘇 張家港 215600； 2.東南大學附屬中大醫(yī)院 婦產科，江蘇 南京 210009； 3.南通市婦幼保健院，江蘇 南通 226000； 4.東南大學 公共衛(wèi)生學院，江蘇 南京 210009； 5.東南大學 醫(yī)學院，江蘇 南京 210009)

?

·論 著·

血液中酚類環(huán)境雌激素與子宮肌瘤關聯性的病例對照研究

徐潔1，吳艷婷2，3，許茜4，盧清5，任慕蘭2，沈楊2

(1.張家港市第一人民醫(yī)院 婦產科，江蘇 張家港 215600； 2.東南大學附屬中大醫(yī)院 婦產科，江蘇 南京 210009； 3.南通市婦幼保健院，江蘇 南通 226000； 4.東南大學 公共衛(wèi)生學院，江蘇 南京 210009； 5.東南大學 醫(yī)學院，江蘇 南京 210009)

目的:通過對人體血漿中環(huán)境雌激素含量的檢測，從臨床流行病學角度探討其與子宮肌瘤的關聯性。方法:以張家港及南京地區(qū)漢族子宮肌瘤患者為病例組，非子宮肌瘤者為對照組，進行一般人口學調查，采集血液標本，應用高效液相串聯質譜法(HPLC- MS)對血漿中雙酚A(BPA)、辛基酚(OP)、壬基酚(NP)等酚類環(huán)境雌激素進行定量檢測，分析比較兩組間差異。結果:病例組214例，對照126例。兩組間酚類環(huán)境雌激素暴露水平、準確檢出人數及濃度分布范圍等存在不同。Logistic分析發(fā)現，NP暴露水平(OR為1.059，95%CI為1.002～1.120)與子宮肌瘤發(fā)病率的關聯性具有統計學意義(P<0.05)。結論:NP暴露可能是子宮肌瘤發(fā)病的危險因素，酚類環(huán)境雌激素的人體暴露水平與子宮肌瘤的發(fā)生存在一定的相關性。

酚類環(huán)境雌激素； 雙酚A； 辛基酚； 壬基酚； 子宮肌瘤

子宮肌瘤是最常見的女性生殖道良性腫瘤，多見于30～50歲的育齡期婦女，發(fā)病率高達20%～50%，尸檢中女性子宮肌瘤患病率高達77%，其中50%的患者是無臨床癥狀的[1]。近年來子宮肌瘤因發(fā)病率的逐年上升，已成為臨床因病切除子宮的首要原因，故而我們婦科腫瘤工作者理應越來越多地關注其防治。然而其確切病因仍尚未明確，多數婦科學者認為子宮肌瘤的發(fā)生可能與雌激素的變化有關[2]。隨著環(huán)境雌激素(environmental estrogens，EEs)污染的日益加劇，雙酚A(bisphenol A，BPA)、辛基酚(octylphenol，OP)及壬基酚(nonylphenol，NP)作為最具代表性的酚類環(huán)境雌激素，因其應用的廣泛性而在人類生活中無處不在[3]。本研究采用固相萃取-高效液相串聯質譜法(HPLC- MS)定量檢測人體血漿中BPA、OP及NP，并通過比較子宮肌瘤病例組與對照組間的差異，分析BPA、OP及NP 3種酚類環(huán)境雌激素人體暴露水平與子宮肌瘤發(fā)生的關聯性。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇

病例組：均為張家港及南京地區(qū)的漢族女性，為2013年9月至2015年2月期間在張家港第一人民醫(yī)院以及東南大學附屬中大醫(yī)院婦產科就診的子宮肌瘤住院病人。納入標準：(1) 生育年齡，未絕經；(2) 漢族，在江蘇地區(qū)居住15年或累計居住超過30年且在外連續(xù)居住不超過5年；(3) 結合病史、一般婦科檢查、影像學檢查(肌瘤直徑≥5 cm)及(或)術后病理檢查，由兩名主治醫(yī)師確診為子宮肌瘤。

對照組選擇和納入標準：(1) 生育年齡，未絕經；(2) 漢族，在江蘇地區(qū)居住15年或累計居住超過30年且在外連續(xù)居住不超過5年；(3) 非子宮肌瘤患者或體檢中心健康體檢者，影像學檢查無子宮肌瘤。

排除標準：(1) 3個月內曾使用過激素類藥物；(2) 生殖系統其他腫瘤的現癥或既往患者；(3) 經縣以上醫(yī)療機構診斷，患有惡性腫瘤、內分泌系統疾病等其他雌激素依賴性疾病，并經上述醫(yī)院復診明確診斷。

1.2 標本采集

在獲得研究對象知情同意的情況下，取子宮肌瘤患者及對照組人員外周靜脈血5 ml于抗凝管中，放至4 ℃冰箱保存。共取得血液標本340例，其中子宮肌瘤組214例，對照組126例。

1.3 酚類環(huán)境雌激素檢測

1.3.1 儀器與裝置 OAS1S HLB固相萃取柱：美國，Waters公司；分析天平：METTLER，AT- 250；氮吹儀：美國，EYELA公司；固相萃取儀：美國，Sigma公司；高液相色譜儀：Agilent，1100；質譜儀：Agilent，6410；色譜柱：C18，1.7μm，2.1 mm×100 mm。

1.3.2 樣品檢測方法 量取血漿0.5 ml于10 ml玻璃離心管中，經前處理后，采用HPLC- MS進行BPA、OP及NP的檢測。前期方法學研究顯示：血漿中BPA、OP、NP的最低檢出限(LOD)分別為0.25、0.18、0.20 ng·ml-1，定量限分別為0.85、0.60及0.70 ng·ml-1，2、5、20 μg·ml-13種加標濃度的方法回收率分別為(116.1±14.5)%、(92.7±16.8)%、(91.5±13.5)%(n=6)。

1.4 統計學處理

為了便于分析，所有數值均采用賦值法。數值采用SPSS 17.0統計軟件進行t檢驗、秩和檢驗及Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1 研究對象基本特征

本次研究共收集子宮肌瘤病例組214例，對照組126例，全部采集血液標本。病例組與對照組直接從目標人群中選取，兩組除年齡構成差異有統計學意義(P<0.05)外，其他一般資料如體重指數(BMI)、婚姻、文化程度、大月份妊娠史等具有可比性(P>0.05)。詳見表1。

表1 研究對象基本特征

Tab 1 General demographic characteristics

因 素病例組對照組POR(95%CI)年齡/歲43．44±6．37540．36±6．075<0．001BMI/kg·m-2 <18．51(0．5)0(0) 18．5～25140(65．4)88(69．8)0．999 >2573(34．1)38(30．2)0．999婚姻 未婚17(7．9)14(11．1) 已婚191(89．3)110(87．3)0．3471．430(0．679～3．013) 離異/喪偶6(2．8)2(1．6)0．3112．471(0．429～14．213)文化程度 高中以下70(32．7)35(27．8) 高中及大專84(39．3)53(42．1)0．3910．792(0．466～1．349) 本科及以上60(28．0)38(30．2)0．4200．789(0．445～1．402)大月份(>5個月)妊娠史 無15(7．0)16(12．7) 1次153(71．5)77(61．1)0．0512．119(0．995～4．513) 2次26(12．1)20(15．9)0．4831．387(0．556～3．460) ≥3次20(9．3)13(10．3)0．3281．641(0．609～4．425)

注：括號中單一數字為構成百分比

2.2 血漿中環(huán)境雌激素檢測結果

將兩組數據進行非參數檢驗發(fā)現，BPA、OP及NP暴露水平間差異無統計學意義(P>0.05)。但通過對3個目標物的檢測結果進行計算及觀察發(fā)現，BPA、OP、NP的平均暴露濃度及濃度分布范圍存在明顯不同，對照組中環(huán)境雌激素的暴露水平高于病例組。兩組血液中BPA、OP、NP的檢測結果見表2。

表2 兩組血液中BPA、OP、NP的檢測結果比較 ng·ml-1

Tab 2 Test results comparison of BPA、NP、OP in plasma ng·ml-1

2.3 環(huán)境雌激素與子宮肌瘤的關聯性分析

采用Logistic回歸模型分析3種環(huán)境雌激素與子宮肌瘤的關聯性。結果發(fā)現，NP暴露水平與子宮肌瘤發(fā)病率的關聯性具有統計學意義(P<0.05)，而BPA和OP的暴露水平對子宮肌瘤的發(fā)生無明顯影響(P>0.05)。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析結果
Tab 3 Logistic regression analysis of risk factors and uterine fibroids

危險因素BWaldPOR(95%CI)BPA0．0170．1230．7260．983(0．892～1．083)NP0．0584．0940．0431．059(1．002～1．120)OP0．0780．0470．8290．925(0．457～1．873)

3 討 論

目前子宮肌瘤的病因尚未完全明確，許多臨床觀察和實驗結果已證明子宮平滑肌瘤是一種依賴于雌激素生長的腫瘤[2]。據文獻報道，高雌激素的長期刺激可能是子宮肌瘤發(fā)生的主要誘因，尤其通過食物攝入及生活接觸等途徑進入機體的外源性雌激素的刺激[4]。

BPA、OP、NP是一類生產工藝中普遍應用、生活中廣泛暴露的酚類環(huán)境雌激素。本研究通過對人群酚類EEs物質的定量檢測，探尋其與子宮肌瘤發(fā)生的關聯性。

3.1 酚類環(huán)境雌激素個體暴露的定量檢測

環(huán)境有害物質的暴露濃度監(jiān)測主要分為暴露對象所接觸的環(huán)境介質中有害物質監(jiān)測和個體暴露監(jiān)測兩種方式，前者監(jiān)測方式所獲得的有害物質的濃度稱為外暴露劑量，后者稱為內暴露劑量；與前者相比，個體暴露監(jiān)測尤其是通過對機體生物材料中有害物質及其代謝產物進行直接定量測定(生物監(jiān)測，biomonitoring)的方式，另外它充分考慮到暴露對象的個體差異，因而所得到的有害物質暴露數據能更準確地反映機體接觸有害物質的真實情況[5]。血漿樣本中酚類環(huán)境雌激素分析的前處理方法主要有液- 液萃取法、固相萃取法、攪拌棒固相萃取法等[6- 7]。固相萃取法與其他傳統的前處理方法相比，具備有機溶劑用量少、重現性好、易于實現自動化等優(yōu)點，因而在機體復雜的樣品分析中應用廣泛。此外，目前國內外對血液中酚類環(huán)境雌激素的分析檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜- 質譜法、高效液相色譜質譜法及免疫分析法等[8- 10]。高效液相色譜- 質譜法與其他檢測方法相比，集多組分定性、定量于一體，具備高效分離能力，且適用于高沸點、不揮發(fā)及熱不穩(wěn)定化合物的分離，因而近年來廣泛應用于生物樣本中多種酚類環(huán)境雌激素的分析檢測。本實驗采用固相萃取前處理技術，通過HPLC- MS法成功建立了人血液中BPA、OP、NP的分析檢測方法，具備檢出限低、回收率高、靈敏度高、重現性好等特點，符合生物樣本中痕量分析的要求。

3.2 酚類環(huán)境雌激素與子宮肌瘤的相關性

本實驗定量檢測病例組與對照組血漿中酚類環(huán)境雌激素暴露水平，以探尋酚類環(huán)境雌激素暴露與子宮肌瘤發(fā)生的關聯性。通過秩和檢驗比較兩組人群的環(huán)境雌激素暴露水平，觀察BPA、OP、NP的平均暴露濃度及濃度分布范圍顯示，對照組的暴露水平高于病例組。通過Logistic回歸分析控制混雜因素后發(fā)現，NP暴露水平對子宮肌瘤發(fā)病率有顯著影響，而BPA和OP的暴露水平對子宮肌瘤的發(fā)生無明顯影響。我們研究預期3種環(huán)境雌激素與疾病的發(fā)生可能存在濃度相關性，而實驗結果與我們的設想仍有些不同。我們認為其可能原因有：(1) 本次研究只是對所納入人群進行了一般人口學特征采集，而未對飲食、精神、體力活動等因素進行詳細研究；(2) 對照組的選擇中雖然對相關影響因素進行了控制，但非子宮肌瘤患者可能存在潛在的病因不明確的非雌激素相關性疾病等問題，因而可能使實驗結果產生偏倚；(3) 環(huán)境雌激素進入人體后，通過肝臟及腸道的代謝，最終經腎臟排泄至尿中，其在血液中的半衰期低于6 h，血液中3種環(huán)境雌激素的暴露水平反映的是一個即刻水平，相對不穩(wěn)定。雖然如此，我們仍發(fā)現NP暴露可能是子宮肌瘤發(fā)病的危險因素，且病例組和對照組間酚類環(huán)境雌激素暴露水平、準確檢出人數及濃度分布范圍等存在不同。

基于本實驗研究結果，本課題組在后續(xù)的研究中將對研究對象進行更為規(guī)范的選擇，運用已經建立的分析檢測方法繼續(xù)深入研究，以期準確地反映酚類環(huán)境雌激素的人體暴露水平與子宮肌瘤發(fā)生可能的相關性，為研究降低子宮肌瘤人群患病率的綜合防治提供理論依據。

[1] DUHAN N,SIROHIWAL D.Uterine myomas revisited[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2010,152(2):119- 125．

[2] ISLAM M S,PROTIC O,GIANNUBILO S R,et al.Uterine leiomyoma: available medical treatments and new possible therapeutic options[J].J Clin Endocrinol Metab,2013,98(3):921- 934．

[3] CALAFAT A M,YE X,WONG L Y,et al.Exposure of the U.S.population to bisphenol A and 4- tertiary- octylphenol: 2003- 2004[J].Environ Health Perspect,2008,116(1):39- 44．

[4] MARUO T,OHARA N,WANG J，et al.Sex steroidal regulation of uterine leiomyoma growth and apoptosis[J].Hum Reprod Update,2004,10(3): 207- 220．

[5] DEKANT W，VOLKEL W.Human exposure to bisphenol A by biomonitoring: methods，results and assessment of environmental exposures[J].Toxicol Appl Pharmacol,2008,228(1):114- 134．

[6] KAWAGUCHI M,SAKUI N,OKANOUCHI N,et al.Stir bar sorptive extraction with in situ derivatization and thermal desorption- gas chromatography—mass spectrometry for measurement of phenolic xenoestrogens in human urine samples[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2005,820(1):49- 57．

[7] CALAFAT A M，KUKLENYIK Z，REIDY J A，et al.Urinary concentrations of bisphenol A and 4- nonylphenol in a human reference population[J].Environ Health Perspect,2005,113(4):391- 395．

[8] YE X，KUKLENYIK Z，NEEDHAM L L，et al.Automated online column- switching HPLC- MS/MS method with peak focusing for the determination of nine environmental phenols in urine[J].Anal Chem，2005,77(16):5407- 5413．

[9] KAWAGUCHI M，ITO R，HAYATSU Y，et al.Stir bar sorptive extraction with in situ de- conjugation and thermal desorption gas chromatography- mass spectrometry for measurement of 4- nonylphenol glucuronide in human urine sample[J].J Pharm Biomed Anal,2006，40(1):82- 87．

[10] KUKLENYIK Z，EKONG J，CUTCHINS C D，et al.Simultaneous measurement of urinary bisphenol A and alkylphenols by automated solid- phase extractive derivatization gas chromatography/mass spectrometry[J].Anal Chem,2003,75(24): 6820- 6825．

A case- control research on the association between phenolic environmental estrogens of the blood and uterine leiomyoma

XU Jie1，WU Yan- ting2，3，XU Qian4，LU Qing5，REN Mu- lan2，SHEN Yang2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology，Zhangjiagang First People’s Hospital，Zhangjiagang 215600，China；2.DepartmentofObstetricsandGynecology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China；3.NantongMaternityandChildHealthCareHospital，Nantong226000，China；4.SchoolofPublicHealth，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China；5.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective： To investigate whether environmental estrogens(EEs) of human plasma are associated with potential reduced risk of uterine fibroids. Methods: We collected plasma samples and investigated general demographic data from a case control study conducted in the No.1 People’s Hospital of Zhangjiagang and Zhongda Hospital of Southeast University. High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(HPLC- MS) was used for quantitative detection of bisphenol A(BPA)， octylphenol(OP)， nonylphenol(NP) and other phenolic compounds in the blood. The differences between the case group and the control group were analyzed and compared. Results: We collected 214 cases of uterine myoma patients as case group, and 126 cases of non- uterine myoma subjects as control group. The results showed that there were some differences in the exposure to environmental estrogens， the exactly detected number of people and the range of concentration between the two groups. Logistic regression analysis showed that NP exposure(OR1.059，95%CI1.002- 1.120) was associated with the onset of uterine fibroids. Conclusion: NP exposure may be the risk factor of uterine fibroids. The exposure to environmental estrogen has certain correlation with the occurrence of uterine fibroids．

environmental estrogens； bisphenol A； octylphenol； nonylphenol； uterine fibroids

2016- 01- 19

2016- 03- 23

江蘇省衛(wèi)生廳青年基金項目(Q201305)；南京市科技計劃項目(201201054)；江蘇省婦幼保健科研項目(F201407)；蘇州市青年科技基金項目(kjxw2014041)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目(SJLX_0105)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(SJLX_0105)；東南大學國家自然科學基金預研項目(KJ2010493)；東南大學SRTP項目(T11431001)

徐潔(1987-)，女，江蘇蘇州人，住院醫(yī)師。E- mail：170322622@qq.com

沈楊 E- mail：shenyang0924@sina.cn

徐潔，吳艷婷，許茜，等.血液中酚類環(huán)境雌激素與子宮肌瘤關聯性的病例對照研究[J].東南大學學報：醫(yī)學版，2016，35(4)：506- 510．

R711.74

A

1671- 6264(2016)04- 0506- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.007