自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織Sirt3表達(dá)的增齡性變化

郝廣華，韓振華，靳耀鋒，袁海峰，董新

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1.心內(nèi)科，2.病理科，3.腦病科，陜西 西安 710004)

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·論 著·

自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織Sirt3表達(dá)的增齡性變化

郝廣華1，韓振華1，靳耀鋒2，袁海峰3，董新1

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 1.心內(nèi)科，2.病理科，3.腦病科，陜西 西安 710004)

目的：探討自發(fā)性高血壓(SH)大鼠心肌組織沉默信息調(diào)節(jié)因子3(Sirt3)表達(dá)的增齡性變化。方法：將36只不同周齡Wistar- Kyoto(WKY)大鼠和SH大鼠分為WKY 16、32、64周3個(gè)周齡組和SH 16、32、64周3個(gè)周齡組，每組6只。采用尾套測壓法測量各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，采用Masson染色觀察心肌纖維化，免疫組化染色及免疫組織印跡法檢測左心室心肌組織Sirt3的表達(dá)。結(jié)果：與同周齡WKY大鼠相比，SH大鼠血壓顯著升高(P<0.05)，心肌組織膠原纖維組織明顯增多，Sirt3蛋白表達(dá)水平均顯著下降(均P<0.05)，且呈增齡性下降趨勢。結(jié)論：SH大鼠肥厚的心肌組織sirt3表達(dá)呈增齡性下降。

高血壓； 心肌肥厚； 心室重構(gòu)； 沉默信息調(diào)節(jié)因子3； 大鼠

高血壓心室重構(gòu)是指在血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷以及神經(jīng)體液因素等的長期作用下心臟的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生變化。早期的心室重構(gòu)是一種對(duì)抗心室壁張力增加的適應(yīng)性代償反應(yīng)；后期是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，與心律失常、猝死以及心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)，因此是心臟事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子3(silent information regulator protein 3， sirturin 3，Sirt3)屬于Ⅲ類組蛋白脫乙酰基酶類，利用NAD+作為底物，使乙?；鞍椎馁嚢彼崛ヒ阴；?，從而參與調(diào)節(jié)多種生理及病理過程，如壽命、細(xì)胞生存、細(xì)胞周期、能量代謝、基因組穩(wěn)定性、脂肪酸合成、糖及胰島素代謝[2]。本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓(spontaneously hypertensive，SH) 大鼠為研究對(duì)象，觀察高血壓重塑的左心室心肌組織中Sirt3的表達(dá)情況，探討高血壓心室重構(gòu)過程的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動(dòng)物 36只不同周齡(16、32、64周)SH大鼠和Wistar- Kyoto(WKY)大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào):SCXK(滬)2007- 0005]。將動(dòng)物分為不同周齡(16、32、64周)WKY和SH組，每組6只。動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫23 ℃左右、12 h明暗交替的環(huán)境中，允許自由飲食。所有實(shí)驗(yàn)操作已得到西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑 兔抗Sirt3多克隆抗體以及生物素化山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，DAB顯色劑購自北京中山生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠血壓測量 采用尾套測壓法測量各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)。方法如下：上午9：00點(diǎn)左右，在安靜環(huán)境下將清醒狀態(tài)大鼠置于37 ℃溫箱內(nèi)約15 min；調(diào)整測壓儀內(nèi)溫度達(dá)37 ℃后，將大鼠放到小籠內(nèi)，血壓測量儀的壓脈套固定大鼠尾部近心端；調(diào)整大鼠鼠尾和換能器接觸的部位，調(diào)節(jié)儀器的感知，定大鼠血壓域值。待大鼠安靜時(shí)用沖氣球加壓，快達(dá)到域值時(shí)緩慢放氣，速度3～4 mmHg·s-1，將感知鈕調(diào)到靈敏位置，此時(shí)儀器開始測壓，最后長鳴一聲標(biāo)志測壓結(jié)束，記錄此時(shí)的血壓值。測量3次，取平均值作為所測的血壓。

1.2.2 組織標(biāo)本制備 各組大鼠稱重并測壓，經(jīng)水合氯醛0.35 mg·kg-1腹腔麻醉后打開胸腔，迅速分離并取出心臟，投入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，洗凈殘血并去除大血管、心房及右心室，左心室稱重后沿垂直于心臟長軸方向分為兩部分：一部分放入4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋；另一部分分為數(shù)塊投入液氮中保存，用于組織總蛋白的提取。

1.2.3 Masson染色 4%多聚甲醛固定液固定組織，石蠟包埋切片，厚度為5 μm，常規(guī)脫蠟至水，置Masson復(fù)合染液中8 min，0.2%醋酸水溶液清洗2次，再置入1%磷鎢酸中15 min，0.2%醋酸水洗2次，至亮綠染液40 s，0.2%醋酸水溶液清洗2次，滴度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察，膠原纖維呈綠色，心肌纖維呈紅色。

1.2.4 免疫組化染色 組織切片常規(guī)脫蠟，0.01 mmol·L-1的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH 6.0)抗原熱修復(fù)，正常山羊血清抗體封閉后加入兔抗大鼠Sirt3多克隆抗體(1∶400)，4 ℃過夜后DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。實(shí)驗(yàn)中用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.5 免疫印跡檢測 用裂解液(RIPA)裂解組織后提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白含量。稀釋蛋白樣品為10 μg·μ l-1，加入上樣緩沖液后煮沸10 min后離心，進(jìn)行8%SDS- PAGE凝膠電泳并電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉緩沖液封閉1 h后滴加兔抗大鼠 Sirt3抗體(稀釋倍數(shù)1∶200)，4 ℃孵育過夜，山羊抗兔IgG孵育45 min，TBST洗膜，置于化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng)1～3 min；常規(guī)方法顯影定影，采用Gel Doc 2000系統(tǒng)拍照及行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血壓情況

如圖1所示：與同周齡WKY大鼠比較，SH大鼠收縮壓顯著增加(P<0.05)，并且隨周齡增加而呈增加趨勢；WKY組大鼠收縮壓的增齡性變化則不明顯。

2.2 各組大鼠心肌組織膠原含量變化

Masson染色可見SH大鼠心肌細(xì)胞肥大，心肌間質(zhì)及血管旁的膠原纖維組織明顯增多，排列紊亂，且隨周齡增加，SH大鼠的膠原染色明顯增加。WYK大鼠心肌間隙清晰可見，膠原纖維分布稀疏，著色淡，膠原纖維染色在不同WKY周齡組間變化不明顯。見圖2。

2.3 各組大鼠心肌組織Sirt3蛋白表達(dá)

免疫組化染色結(jié)果表明，Sirt3免疫染色陽性表達(dá)主要分布于心肌細(xì)胞細(xì)胞漿中(圖3)。與同周齡WKY大鼠相比，SH大鼠Sirt3蛋白表達(dá)水平顯著降低。且隨周齡增加，SH大鼠Sirt3表達(dá)呈明顯下降趨勢。WKY大鼠心肌細(xì)胞Sirt3表達(dá)亦呈下降趨勢，但不如SH大鼠的變化明顯(圖3)。

a 與同周齡WKY大鼠相比，P<0.05

圖1 各組大鼠SBP

Fig 1 SBP in SH and WKY rats

進(jìn)一步采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)方法觀察各組大鼠左心室心肌組織中Sirt3蛋白的表達(dá)水平。如圖4所示，SH大鼠心肌組織中Sirt3蛋白的表達(dá)顯著低于同周齡WKY大鼠(P<0.05)。與WKY大鼠相比，SH大鼠Sirt3蛋白表達(dá)呈明顯增齡性減低趨勢。

3 討 論

高血壓是最常見的心血管慢性疾病之一，近些年發(fā)病率呈明顯增高趨勢。流行病學(xué)調(diào)查顯示，老年性高血壓患者半數(shù)以上以收縮壓增高為主，且易出現(xiàn)心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、腦卒中等嚴(yán)重的心腦血管并發(fā)癥[3]。高血壓伴發(fā)的心室重構(gòu)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死、纖維化，心室擴(kuò)張，最終發(fā)生心力衰竭及心律失常[4]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)隨著SH大鼠周齡的增加，血壓增高，同時(shí)心肌細(xì)胞肥大，心肌間質(zhì)膠原纖維組織明顯增多。

圖2 各組大鼠膠原染色 普通光鏡×200

Fig 2 Left ventricular collagen fiber of rats evaluated by Masson staining(×200)

Sirtuin屬于NAD+依賴的蛋白去乙?；?，參與調(diào)節(jié)代謝、應(yīng)激反應(yīng)以及衰老過程[2]。其中Sirt3是線粒體內(nèi)存在的關(guān)鍵去乙?；浮irt3在心臟中大量表達(dá)，可拮抗心肌肥厚的發(fā)生[5]。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著SH大鼠血壓的升高以及心肌肥厚的發(fā)生，Sirt3的表達(dá)顯著下降。提示Sirt3表達(dá)下調(diào)參與了高血壓心室重構(gòu)的病理過程。既往研究顯示，Sirt3-/-小鼠更易發(fā)生心肌肥厚，而Sirt3過表達(dá)阻止了心肌肥厚的發(fā)生，其機(jī)制可能是Sirt3阻斷了心肌肥厚時(shí)Ras的活化，并進(jìn)一步阻斷MAPK/ERK以及PI3K/Akt通路[6]。心肌肥厚的另一個(gè)信號(hào)通路是氧化應(yīng)激以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生。Sirt3可部分阻斷促心肌肥厚因子引起的ROS產(chǎn)生，這一機(jī)制主要通過調(diào)控Foxo3a及其下游因子，如超氧化物歧化酶SOD、SOD2的線粒體亞型以及過氧化氫酶的表達(dá)及活性[6]。此外，也可能存在其他一些機(jī)制參與Sirt3的抗心肌肥厚作用,如Sirt3可介導(dǎo)LKB1去乙?；?，隨后激活A(yù)MPK，進(jìn)而阻斷心肌肥厚發(fā)生[7]。

圖3 各組大鼠Sirt3蛋白免疫組化染色 普通光鏡×200

Fig 3 Immunohistochemcal staining of Sirt3 in left ventricle of rats(×200 magnification)

a 與同周齡WKY大鼠相比，P<0.05

圖4 免疫印跡法顯示各組大鼠左心室Sirt3蛋白的表達(dá)

Fig 4 Sirt3 protein levels in left ventricle of rats analyzed by Western blotting analysis

除外心肌肥厚，Sirt3與衰老性疾病也有關(guān)。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與青年人相比，以靜態(tài)生活方式為主的60歲以上人群，其肌肉組織中Sirt3水平下降約40%，采用耐力鍛煉后，其Sirt3水平上升[8]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，WKY大鼠隨周齡增加，Sirt3亦呈下降趨勢，提示Sirt3表達(dá)不足可能參與了機(jī)體衰老的發(fā)生。線粒體電子傳遞過程中產(chǎn)生的ROS可破壞線粒體外的大分子結(jié)構(gòu)，這一過程參與了許多與衰老有關(guān)的病理過程。Sirt3可部分拮抗此作用。Sirt3通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)SOD2，繼而參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS的水平[9]。此外，Sirt3也可通過直接作用或去乙?；€粒體內(nèi)電子轉(zhuǎn)移鏈的一些組分，如復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ，直接調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生[10- 11]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Sirt使mPTP開放的調(diào)節(jié)因子CypD去乙?；种破浠钚?，減少通過mPTP的促凋亡因子流入細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)ATP的耗竭，從而有望成為治療與衰老有關(guān)心臟疾病的新手段[12]。

總之,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SH大鼠心室重構(gòu)發(fā)展過程中存在Sirt3表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象，此結(jié)果將有助于揭示高血壓心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，并為高血壓心室重構(gòu)的干預(yù)提供可能的靶點(diǎn)。

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Expression changes of Sirt3 with age in the left ventricle of spontaneously hypertensive rats

HAO Guang- hua1，HAN Zhen- hua1，JIN Yao- feng2，YUAN Hai- feng3，DONG Xin1

(1.Department of Cardiology，2.Department of Pathology，3.Department of Encephalopathy，the SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Xi’an710004，China)

Objective： To investigate the expression changes of Sirt3 with age in left ventricle of spontaneously hypertensive(SH) rats. Methods: Thirty- six Wistar- Kyoto(WKY) and SH rats of different age were divided into WKY (16，32，64 weeks) and SHR(16， 32， 64 weeks)groups with 6 rats in each group. Systolic blood pressure of rats was measured by tail cuff method and left ventricular fibrosis was detected by Masson staining. The level of Sirt3 expression was analyzed by immunohistochemistry staining and Western blotting. Results: In comparison with WKY rats of the same age， the systolic blood pressure(P<0.05) and left ventricular fibrosis of rats in SH rats were higher. The expression of Sirt3 protein was lower in the SH rat group and was decreased with age(P<0.05).Conclusion: Sirt3 expression in the hypertrophic left ventricle of SH rats is decreased with age.

hypertension； hypertrophy； cardiac remodeling； silent information regulator protein 3; rats

2016- 03- 28

2016- 04- 13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30900693)；陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015SF021)

郝廣華(1978-)，女，陜西寶雞人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。E- mail:guanghua- h@163.com

韓振華 E- mail：drhanzhenhua029@163.com

郝廣華，韓振華，靳耀鋒，等.自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織Sirt3表達(dá)的增齡性變化[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，35(4)：487- 491．

R- 33; R544.1

A

1671- 6264(2016)04- 0487- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.003