鹽酸伊立替康注射液的細菌內毒素檢查方法研究

王婷婷，李 亙，周 瑞

（1.江蘇省連云港市藥品檢驗所，江蘇 連云港 222006； 2.正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇 連云港 222006）

鹽酸伊立替康注射液的細菌內毒素檢查方法研究

王婷婷1，李 亙1，周 瑞2

（1.江蘇省連云港市藥品檢驗所，江蘇 連云港 222006； 2.正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇 連云港 222006）

目的 建立鹽酸伊立替康注射液細菌內毒素的檢查方法。方法 依據2015年版《中國藥典（四部）》通則1143細菌內毒素檢查法凝膠法的要求，通過預干擾和干擾試驗確定樣品最大無干擾濃度，并進行方法學驗證。結果 樣品用堿性調節(jié)稀釋劑Ⅱ調節(jié)樣品pH至6.0～7.0，細菌內毒素檢查(BET)用水稀釋至0.95 g／L時對細菌內毒素檢查法無干擾作用。結論 該方法用于檢查鹽酸伊立替康注射液的細菌內毒素可行。

鹽酸伊立替康注射液；細菌內毒素檢查；凝膠法；干擾試驗

鹽酸伊立替康是半合成喜樹堿衍生物類抗腫瘤藥物，能特異性抑制DNA拓撲構型異構酶Ⅰ，從而阻礙DNA的合成，具有水溶性好、毒副作用小、廣譜抗癌等特點，被認為是近年來最有前途的抗癌藥物。其制劑于1994年在日本進入臨床，2001年3月在中國上市，主要用于成人大腸癌復發(fā)和惡化的一線治療，并對小細胞及非小細胞肺癌、卵巢癌等有一定療效[1－2]。2015年版《中國藥典》尚未收載該品種，在目前執(zhí)行的國家藥品標準中仍采用熱原檢查法，結果獲得較慢，易受家兔干擾而出現假陽性或假陰性結果。為了提高該品種的質量標準，控制產品質量，本研究中依據2015年版《中國藥典（四部）》通則1143細菌內毒素檢查法[3]，并參考文獻[4－7]對鹽酸伊立替康注射液的細菌內毒素檢查法進行了可行性研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MET－50型智能恒溫加熱儀（天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸伊立替康注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號分別為16030138，16031938，16051938，規(guī)格為每支5 mL∶100 mg）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150601－201580，規(guī)格為每支80 EU）；細菌內毒素檢查用水（BET用水，中國食品藥品檢定研究院，批號為 160006－201510，規(guī)格為每支5 mL）；堿性調節(jié)稀釋劑Ⅱ（湛江博康海洋生物有限公司，批號為1507300）；鱟試劑（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，標示靈敏度為0.25 EU／mL，批號為1508240，標示靈敏度為0.125 EU／mL，批號為1510135；湛江安度斯生物科技有限公司，標示靈敏度為0.25 EU／mL，批號為 1509251，標示靈敏度為 0.125 EU／mL，批號為1511172）。

2 方法與結果

2.1 TAL靈敏度復核

將細菌內毒素工作標準品用BET用水溶解，配置成2.0 λ，1.0 λ，0.5 λ，0.25 λ的溶液，按《中國藥典》[3]操作，以BET用水做2支陰性對照（NC），對2個廠家的鱟試劑進行標示靈敏度復核，結果見表1。4批鱟試劑靈敏度均在0.5 λ～2.0 λ范圍內，均符合規(guī)定，可用于試驗。

2.2 內毒素限值（L）的計算

根據公式L＝K／M[3]，注射劑K＝5 EU／（kg·h）。M為人用每千克體質量每小時最大劑量，根據藥品說明書推薦劑量為350 mg／m2，人均體質量劑量注射時間不足1 h按1 h計，供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即轉換為每千克體質量劑量，M＝350×0.027＝9.45（mg／kg），則L＝5／9.45＝0.529 EU／mg。為保障安全用藥，將本品的限值設為每1 mg鹽酸伊立替康注射液中含內毒素應小于0.264 EU。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果

2.3 最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

根據公式 MVD＝C×L／λ[3]，L為供試品的內毒素限值0.264 EU／mg，C等于20 g／L，以市售凝膠法最高靈敏度 0.03 EU／mL為基準，MVD＝C×L／λ＝（20 g／L×0.264 EU／mg）／0.03 EU／mL＝176。

2.4 干擾試驗預試驗

取3批鹽酸伊立替康注射液，用堿性調節(jié)稀釋劑II調節(jié)樣品pH至6.0～7.0，再用BET用水稀釋成1.89， 0.95，0.47，0.23，0.11 g／L作為供試品系列（NPC），同時每個稀釋度下均制備含有2 λ濃度細菌內毒素的溶液作為供試品陽性對照系列（PPC）。用λ為0.25 EU／mL的2個廠家的鱟試劑分別與2個系列溶液反應，每個稀釋度作2支。另取2支加入 BET用水作陰性對照（NC），2支加入2 λ濃度的內毒素標準溶液作為陽性對照（PC），結果見表2?？梢?，鹽酸伊立替康質量濃度在0.95 g／L時，對2個廠家的鱟試劑與細菌內毒素反應無明顯干擾抑制作用。

表2 樣品預干擾試驗結果

2.5 正式干擾試驗

根據預干擾試驗結果，取3個批號的鹽酸伊立替康注射液，用堿性調節(jié)稀釋劑Ⅱ調節(jié)樣品 pH至6.0～7.0，用BET用水稀釋成0.95 g／L，作為供試品溶液，用供試品溶液及BET用水分別稀釋內毒素工作標準品，制成細菌內毒素濃度為0.5，0.25，0.125，0.062 5 EU／mL的系列溶液。每個濃度平行做4管，分別與2個廠家靈敏度為0.25 EU／mL的鱟試劑反應，另取供試品溶液和BET用水做2管陰性對照（NC），參考文獻[4－6]進行干擾試驗，按公式 Es＝lg－1（∑ Xs／4）和 Et＝lg－1（∑Xt／4）計算各系列反應終點內毒素濃度的絕對值。結果見表3（表中 Es及 Et分別為用BET用水、供試品溶液制成的細菌內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值）?？梢?，Es均在 0.5～2.0 λ范圍內，且 Et均在0.5 Es～2.0 Es范圍內，表明鹽酸伊立替康注射液稀釋成0.95 g／L后對TAL（λ＝0.25 EU／mL）的鱟試劑試驗無明顯干擾作用，可用于細菌內毒素檢查。

2.6 樣品細菌內毒素檢查法的驗證

取3個批號的供試品，用堿性調節(jié)稀釋劑Ⅱ調節(jié)樣品pH至6.0～7.0，用BET用水稀釋為0.95 g／L，使用λ＝0.125 EU／mL的2個廠家的鱟試劑進行內毒素檢查，并按文獻[4－6]報道的方法做陽性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對照，結果3批鹽酸伊立替康注射液的內毒素檢查均符合規(guī)定。詳見表4。

3 討論

細菌內毒素是革蘭陰性細菌細胞壁上的一種脂多糖和微量蛋白的復合物，O－特異性鏈、核心多糖和類脂A是其主要化學成分，O－特異性鏈決定了菌體熱原的特異性，類脂A是引發(fā)發(fā)熱、血流動力學改變等內毒素毒性反應的主要基團[7－9]。細菌內毒素研究表明，細菌在正常狀態(tài)時不釋放細菌內毒素，只有當細菌死亡自溶或黏附在其他細胞時才釋放。

表3 樣品干擾試驗結果

表4 樣品細菌內毒素檢查結果

對于熱原物質的檢查，2015年版《中國藥典》收載的方法有細菌內毒素法和家兔熱原法，雖然后法自建立后對有效遏制臨床熱原反應事件的發(fā)生發(fā)揮了巨大作用，但同時也充分暴露了其不足的一面，如試驗周期長、靈敏度低、重復性差、檢測成本高等[10]。細菌內毒素檢查法是利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，包括凝膠法和光度測定法，后法包括濁度法和顯色基質法。與家兔熱原法相比較，細菌內毒素檢查法具有重復性好、檢測靈敏度高、檢測成本低、結果準確和可進行標準化等優(yōu)點。鹽酸伊立替康注射液在臨床通過靜脈給藥，直接進入患者血液循環(huán)，如果內毒素含量超過一定限量，則可引起熱原反應，甚至導致患者死亡。因此，對其熱原的控制尤其重要。

鹽酸伊立替康注射液的pH為 3.0～4.0，本試驗研究了樣品 pH對凝膠法結果的影響，當干擾試驗采用單一稀釋法時，供試品系列（NPC）反應呈陰性，結果表明經稀釋后的樣品對鱟試劑與細菌內毒素反應有明顯干擾作用。鱟試劑雖有一定的緩沖作用，但與內毒素之間是一個復雜的酶促反應過程，pH可影響凝膠的形成。為了減少由pH值所產生的干擾作用，本試驗中用堿性調節(jié)稀釋劑Ⅱ調節(jié)樣品pH至6.0～7.0。本試驗結果表明，當鹽酸伊立替康注射液限值設定為0.264 EU／mg，樣品用BET用水稀釋至質量濃度為0.95 g／L時，對兩個廠家的鱟試劑和細菌內毒素的凝集反應無明顯干擾作用。因此，可用凝膠法對鹽酸伊立替康注射液進行細菌內毒素檢查。

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Study on the Bacterial Endotoxin Test Method for Irinotecan Hydrochloride Injection

Wang Tingting1，Li Heng1，Zhou Rui2
（1.Lianyungang Institute for Drug Control，Lianyungang，Jiangsu，China 222006； 2.Chia－tai Tianqing Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Lianyungang，Jiangsu，China 222006）

Objective To establish the bacterial endotoxin test method of irinotecan hydrochloride injection.Methods According to the appendix of Chinese Pharmacopoeia（2015 edition）1143 gel method for he bacterial endotoxin test，maximal non－interference concentrationsof sampleswere determined by pre－interference test and interference test，then the methodology validation wasconducted.Results There was no interference on bacterial endotoxin test when the sample pH was adjusted to 6.0－7.0 with Alkaline regulatorⅡand concentration diluted to 0.95 g／L with BET water.Conclusion The established method is feasible to detect the bacterial endotoxin of irinotecan hydrochloride injection.

irinotecan hydrochloride injection；bacterial endotoxin test；gel－clot；interference test

R927.11；R979.1

A

1006－4931(2016)22－0069－03

王婷婷，女，主管藥師，主要從事藥物分析工作，（電子信箱）124603079＠qq.com。

2016－07－11)