高效液相色譜法同時(shí)測定壯骨方煮散中朝藿定C和淫羊藿苷含量

田元春，李雙蕾，鄧紫娉，吳麗如，王嘉俊

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

高效液相色譜法同時(shí)測定壯骨方煮散中朝藿定C和淫羊藿苷含量

田元春，李雙蕾，鄧紫娉，吳麗如，王嘉俊

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

目的 建立同時(shí)測定壯骨方煮散中抗骨質(zhì)疏松有效成分朝藿定C和淫羊藿苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Plastisil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），以乙腈－水（27∶73）為流動相，流速為1.0 mL／min，檢測波長為270 nm，柱溫為30℃。結(jié)果 朝藿定C進(jìn)樣量在0.050～2.016 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0.999 9），淫羊藿苷進(jìn)樣量在0.032～1.280 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0.999 9）；朝藿定C和淫羊藿苷平均加樣回收率分別為98.94%和100.99%，RSD分別為1.69%和1.07%（n＝6）。結(jié)論 該方法簡便，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，適用于壯骨方煮散中朝藿定C和淫羊藿苷的質(zhì)量控制。

壯骨方煮散；朝藿定C；淫羊藿苷；高效液相色譜；含量測定

壯骨方煮散為治療骨質(zhì)疏松、防治低骨量的有效驗(yàn)方，由淫羊藿、黃芪、丹參、杜仲、山藥、三七等中藥材組方，具有益腎填精、活血化瘀、通絡(luò)止痛之功效[1]。淫羊藿為方中君藥，所含淫羊藿黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗骨質(zhì)疏松作用[2]。淫羊藿中的黃酮類化合物主要有淫羊藿苷、朝藿定 C、朝藿定 A、朝藿定 B、寶藿苷Ⅰ等[3]。2010年版《中國藥典（一部）》收載的淫羊藿藥材有4種基源，其質(zhì)量受物種來源、產(chǎn)地、用藥部位、采收期和炮制方法等因素影響，目前市售淫羊藿藥材中淫羊藿苷的含量差異較大，部分低于藥典標(biāo)準(zhǔn)，而朝藿定C含量普遍較高[4－6]。為此，筆者建立了測定壯骨方煮散中的抗骨質(zhì)疏松主要有效成分朝藿定C和淫羊藿苷含量的高效液相色譜(HPLC)法，為其質(zhì)量控制、優(yōu)化工藝研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司)，包括SPD－20A紫外檢測器，LC－Solution色譜工作站；GH－252型分析天平（廣州市艾安得儀器有限公司）；SimplicityTM型超純水系統(tǒng)（Millipore公司）；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

朝藿定C對照品（供含量測定用，成都曼斯特生物科技有限公司，批號為 MUST－15040715，純度為98.17%）；淫羊藿苷對照品（供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院，批號為 MUST－15052801，純度為99.97%）；乙腈（色譜純，美國 DIKMA公司，批號為70109），甲醇（色譜純，美國 DIKMA公司，批號為70112），水為超純水；壯骨方煮散和陰性樣品（按壯骨方煮散處方中所有藥味缺淫羊藿藥材進(jìn)行制備）均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Plastisil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保護(hù)柱：EasyGuard C18柱（10 mm×4 mm，5 μm）；流動相：乙腈－水（27∶73）；柱溫：30℃；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL／min。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)應(yīng)不低于1 500。

2.2 溶液制備

壯骨方煮散提取液：按照處方稱取藥材飲片，混合粉碎，加水常溫浸泡30 min，煎煮保持微沸30 min，趁熱過濾，濾液濃縮定容至100 mL，冷卻即得。

對照品溶液：稱取朝藿定C對照品和淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.252 g／L和0.160 g／L的單一成分對照品貯備液。取上述對照品貯備液各2 mL，置同一5 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，制成含朝藿定C 100.8 μg／mL和淫羊藿苷64.0 μg／mL的混合對照品溶液。

供試品溶液：精密吸取煮散提取液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇約4 mL，超聲提取30 min，取出，放至室溫，加甲醇定容至刻度，離心（3 500 r／min）5 min，取出；精密吸取上清液2 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按煮散提取制備方法制備缺淫羊藿藥材的壯骨方煮散陰性對照提取液，按供試品溶液方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。朝藿定C、淫羊藿苷的保留時(shí)間分別為11.3 min和14.0 min，分離度＞1.5，陰性對照品無干擾。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密吸取混合對照品溶液0.5，1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(A)對進(jìn)樣質(zhì)量(C，μg）進(jìn)行線性回歸，得朝藿定C與淫羊藿苷線性回歸方程分別為：A＝2×106C－23 799(r＝0.999 9，n＝6)和 A＝2× 106C－24 491(r＝0.999 9，n＝6)，進(jìn)樣質(zhì)量線性范圍分別為0.050～2.016 μg和0.032～1.280 μg。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1項(xiàng)色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果朝藿定C峰面積的 RSD為0.13%(n＝6)，淫羊藿苷峰面積的 RSD為1.12%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于室溫放置0，2，4，8，12，24 h，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL測定，記錄峰面積。結(jié)果朝藿定C、淫羊藿苷峰面積 RSD均為1.35%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批壯骨方煮散提取液，依法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10 μL測定，計(jì)算含量。結(jié)果朝藿定C、淫羊藿苷含量的 RSD分別為1.70%和1.87%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取6份已知朝藿定C和淫羊藿苷含量的煮散樣品，加入等量的朝藿定C和淫羊藿苷對照品，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 樣品含量測定

分別取3個(gè)批次煮散提取液，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL，測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

3 討論

中藥煮散是將中藥材粉碎成一定粒度與水共煎、去渣取汁制成的液體制劑，吸收快、起效迅速，與傳統(tǒng)飲片湯劑相比，有節(jié)省藥材及能源、煎煮率高等獨(dú)特優(yōu)勢，在目前藥材資源匱乏、藥價(jià)上漲明顯的情況下，推廣使用中藥煮散對于現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)和社會效益都意義重大[7]。

壯骨方煮散為臨床驗(yàn)方，組方滋腎與益氣活血并舉，補(bǔ)氣與養(yǎng)血通絡(luò)互存，虛實(shí)共治，補(bǔ)而不膩邪，通而不傷絡(luò)，共達(dá)益腎填精、活血化瘀、通絡(luò)止痛之效。淫羊藿為方中君藥，淫羊藿中多種黃酮成分具有抗骨質(zhì)疏松活性，如淫羊藿苷、淫羊藿苷元、淫羊藿定A、淫羊藿定B和淫羊藿定C等[8－9]，5種單體均有增加細(xì)胞基質(zhì)鈣及促進(jìn)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖和礦化作用[10－11]。淫羊藿黃酮可改善模型動物的骨密度和骨生化指標(biāo)[12]，促進(jìn)試驗(yàn)性骨質(zhì)疏松性骨折修復(fù)[13]，提高骨質(zhì)疏松癥患者的骨密度療效，且能改善骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)證候及主要癥狀[14]。淫羊藿總黃酮代謝產(chǎn)物也具有促進(jìn)骨形成活性[15]。

在檢測波長選擇時(shí)，經(jīng)全波長掃描，朝藿定C、淫羊藿苷在270 nm波長處均有較大吸收，根據(jù)藥典及文獻(xiàn)[4－5，16]，確定檢測波長為270 nm。在流動相選擇時(shí)，比較了甲醇－水溶液系統(tǒng)和乙腈－水溶液系統(tǒng)，乙腈－水溶液系統(tǒng)基線平穩(wěn)、柱壓低，通過調(diào)整乙腈和水的比例，朝藿定C和淫羊藿苷與其他成分得到良好分離。在柱溫選擇時(shí)，分別考察了不同柱溫（25，27，30，32，35℃）對分離效果的影響，柱溫30℃時(shí)朝藿定C和淫羊藿苷分離效果良好，保留時(shí)間適宜。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）

綜合分析，所建立的HPLC法操作簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，可用于壯骨方煮散的質(zhì)量控制和進(jìn)一步的工藝優(yōu)化。

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Content Determination of Epimedin C and Icariin in Zhuanggufang Zhusan by HPLC

Tian Yuanchun，Li Shuanglei，Deng Zipin，Wu Liru，Wang Jiajun
（The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，China 530023）

Objective To establish an HPLC method for the content determination of active ingredients（epimedin C and icariin）of antiosteoporosis in Zhuanggufang Zhusan.M ethods HPLC was used with the Plastisil C18column（250 mm × 4.6 mm，5 μm），acetonitrilewater（27∶73）as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL／min，the detecting wavelength of 270 nm，and the column temperature at 30℃.Results The good linear was over the range of 0.050 － 2.016 μg for epimedin C（r＝0.999 9）and the average recovery（n＝6）was 98.94% with RSD of 1.69%；the good linear was over the range of 0.032－1.280 μg for icariin（r＝0.999 9）and the average recovery（n＝6）was 100.99% with RSD of 1.07%.Conclusion The method is simple and with high repeatability and stability，which can be used for the quality control of Zhuanggufang Zhusan.

Zhuanggufang Zhusan；epimedin C；icariin；HPLC；content determination

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2016)22－0064－03

田元春，大學(xué)本科，主任藥師，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)、醫(yī)院藥學(xué)，（電話）0771－5840015（電子信箱）tianyc1989＠163.com；李雙蕾，大學(xué)本科，主任醫(yī)師，教授，主要從事臨床內(nèi)分泌及代謝性疾病工作，本文通訊作者，（電話）0771－5848628（電子信箱）lslei66＠126.com。

2016－08－11)

廣西科學(xué)研究與科技開發(fā)計(jì)劃科技攻關(guān)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號：桂科攻14124004－1－26。