大黃素治療大鼠急性肝功能衰竭時(shí)核因子－ B的動(dòng)態(tài)變化

于 盈，王鳳玲

（浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院感染內(nèi)科，浙江 臺(tái)州 318000）

大黃素治療大鼠急性肝功能衰竭時(shí)核因子－ B的動(dòng)態(tài)變化

于 盈，王鳳玲

（浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院感染內(nèi)科，浙江 臺(tái)州 318000）

目的 探討大黃素治療大鼠急性肝功能衰竭時(shí)大鼠肝臟中核因子－ B(NF－ B)的動(dòng)態(tài)變化。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組、肝衰竭模型組（ALF組）、大黃素治療組。以 D－氨基半乳糖（D－Gal）建立大鼠急性肝功能衰竭模型，建模后12 h，大黃素治療組腹腔注射10 mg／kg大黃素，2次／天。ALF組及大黃素治療組分別在建模后24，72，120，168 h隨機(jī)各取6只大鼠，取門靜脈血查肝功能，10%甲醛液固定肝組織，免疫組化檢測(cè)NF－ B。結(jié)果 造模后24 h，大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）明顯升高，且顯著高于健康對(duì)照組（以72 h為著），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝5.521，7.743，P＜0.01）；建模后72 h相同時(shí)點(diǎn)，ALF組大鼠肝功能指標(biāo)均顯著高于大黃素治療組（P＜0.01）；建模后24 h，ALF組NF－ B表達(dá)高于健康對(duì)照組（q＝3.325，P＜0.01），其表達(dá)72 h達(dá)高峰，120 h后逐漸下降；建模后72，120，168 h大黃素治療組與 ALF組的NF－ B表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q＝5.638，5.527，5.314，P＜0.01）。結(jié)論 大黃素對(duì)大鼠急性肝功能衰竭有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)NF－ B的表達(dá)有關(guān)。

肝功能衰竭；急性；大黃素；核因子－ B；大鼠

肝功能衰竭是由多種因素引起的肝細(xì)胞合成、分泌及生物轉(zhuǎn)化嚴(yán)重障礙臨床綜合征，患者以黃疸、肝性腦病、腹腔積液、凝血功能障礙等為主要臨床表現(xiàn)。其包括急性、慢性和亞急性肝功能衰竭，其中急性肝功能衰竭（ALF）是由于肝臟功能急劇減退，導(dǎo)致以明顯黃疸、凝血功能低下和肝性腦病為主要表現(xiàn)的綜合征，是最嚴(yán)重的一種表現(xiàn)。ALF患者發(fā)病急，病情進(jìn)展迅速，當(dāng)前臨床尚無特效治療方法。大黃是臨床使用較廣泛的中藥之一，其主要有效成分為大黃素，不少臨床研究和試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大黃素具有多種生物學(xué)作用，包括抗炎、肝功能保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等，也有不少學(xué)者采用大黃制劑防治肝癌、保護(hù)肝功能等[1－4]。細(xì)胞增殖S期會(huì)表達(dá)核因子－κB（NF－κB）蛋白，不少研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB能參與細(xì)胞增殖過程，NF－κB的變化能直接反映細(xì)胞的增殖功能，因此可用來評(píng)價(jià)肝細(xì)胞的再生作用。本研究中擬通過建立ALF大鼠模型，采用大黃素干預(yù)，分析NF－κB變化，探討大黃素對(duì)肝臟功能保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥、動(dòng)物

1.1.1 儀器及試藥

主要儀器包括全自動(dòng)生化分析儀（濟(jì)寧市潤煤工礦物資有限公司）。主要試劑包括NF－κB一抗（廣州泰諾迪生物科技有限公司）；D－氨基半乳糖（D－Gal，重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室）；大黃素（廣州泰諾迪生物科技有限公司，批號(hào)為110756－200110）。NF－κB免疫組化試劑盒（廣州泰諾迪生物科技有限公司）。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

研究符合動(dòng)物試驗(yàn)倫理學(xué)原則。選取健康清潔級(jí)雄性SD大鼠（溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào)為2010－04－12）54只，體質(zhì)量180～220 g。按隨機(jī)數(shù)字表法分成健康對(duì)照組（6只），肝功能衰竭模型組（ALF組，24只），大黃素治療組（24只）。3組大鼠均給予相同喂養(yǎng)條件和飲食：溫度18～26℃，相對(duì)濕度5% ～10%，噪聲小于85 dB，每1 h通氣換風(fēng)8～12次，飼喂量5 g。術(shù)前12 h禁食，術(shù)前4 h禁飲。大黃素治療組和ALF組分別于建模后24，72，120，168 h取6只大鼠，采集門靜脈血標(biāo)本，同時(shí)留取肝組織標(biāo)本。

1.2 模型建立

準(zhǔn)確稱取 D－Gal 10 g，溶入0.9%氯化鈉注射液100 mL中，采用1 mol／L NaOH調(diào)溶液pH至7.0，溶液最終濃度在10%。ALF組大鼠腹腔注射1.25 g／kg D－Gal溶液，健康對(duì)照組大鼠注射等量生理鹽水。12 h后，大黃素治療組大鼠腹腔注射 10 mg／kg大黃素，2次／天。健康對(duì)照組大鼠在給藥24 h后留取靜脈血，取肝組織。ALF組及大黃素治療組分別在給藥后24，72，120，168 h時(shí)取6只大鼠行腹腔麻醉，取靜脈血，同時(shí)留取大鼠肝組織。靜脈血離心取上清液，在－80℃冰箱保存；大鼠肝組織采用甲醛固定，行病理及免疫組化檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清標(biāo)本中肝功能指標(biāo)變化，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。甲醛固定肝組織，石蠟包埋切片，蘇木素－伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

甲醛固定肝組織，脫水，檢測(cè)NF－κB水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。采用苯基丁酸（PBA）為陰性對(duì)照，以出現(xiàn)棕黃色細(xì)胞核為陽性。采用Image－ProPlus 6.0圖像分析，測(cè)量肝組織平均光密度 OD值，光密度OD＝積分光密度（IODSUM）／組織面積（Area SUM）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 Microsoft Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多樣本計(jì)量資料比較采用 SNK法，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較采用 LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALT與AST水平

血清ALT和AST經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，組間兩兩比有顯著性差異（F＝36.28，P＜0.01）；建模24 h后，ALF組肝功能指標(biāo)均顯著上升，與對(duì)照組相比有顯著性差異（t＝5.521，7.743，P＜0.01）；建模后24 h，ALF組和大黃素治療組血清ALT和AST等差異不明顯，建模后72 h達(dá)高峰。此后，大黃素治療組ALT和AST顯著下降，相同時(shí)間點(diǎn)，顯著低于ALF組（P＜0.01）。ALF組和大黃素治療組建模后120，168 h血清ALT和AST均持續(xù)下降。詳見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肝功能變化（s，U／L，n＝6）

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肝功能變化（s，U／L，n＝6）

注：與健康對(duì)照組比較， P＜0.05；與 ALF組同時(shí)點(diǎn)比較，P＜0.05。

組別 時(shí)間健康對(duì)照組ALF組 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h大黃素治療組 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h ALT 28.7±2.6 321.3±89.7 724.0±121.4 191.4±51.0 88.3±13.9 293.9±69.5 187.4±52.1 102.7±27.2 52.4±9.7 AST 76.4±5.2 575.5±117.3 223.2±73.1 171.7±53.9 150.5±38.7 535.3±110.9 179.5±71.5 110.3±25.6 75.7±15.1

2.2 肝組織病理學(xué)改變

HE染色結(jié)果表明，健康對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，能清晰看到肝索。注射 D－Gal后，ALF組大鼠肝組織染色顯示，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞大面積壞死。見圖1和圖2。

圖1 健康對(duì)照組大鼠肝組織（HE染色，×400）

圖2 ALF組大鼠肝組織（HE染色，×400）

2.3 肝組織NF－ B的表達(dá)

健康對(duì)照組 NF－κB不表達(dá)或有少量表達(dá)，24 h后，ALF組 NF－κB水平顯著高于健康對(duì)照組（q＝3.325，P＜0.01），ALF組和大黃素治療組NF－κB均在72 h達(dá)到最高，隨后開始緩慢下降。72 h開始至168 h，大黃素治療組肝組織NF－κB表達(dá)較ALF組明顯減少（q＝5.638，5.527，5.314，P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肝組織內(nèi)NF－ B表達(dá)水平比較（s， g／mL，n＝6）

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肝組織內(nèi)NF－ B表達(dá)水平比較（s， g／mL，n＝6）

注：與健康對(duì)照組相比， P＜0.05；與 ALF組同時(shí)點(diǎn)比較，P＜0.05。

組別 時(shí)間健康對(duì)照組ALF組 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h大黃素治療組 建模后 24 h 72 h 120 h 168 h NF－ B 0.038±0.004 0.121±0.020 0.201±0.032 0.109±0.007 0.092±0.006 0.113±0.014 0.172±0.025 0.074±0.006 0.053±0.006

3 討論

急性肝功能衰竭最突出的表現(xiàn)是短時(shí)間內(nèi)肝細(xì)胞變性、壞死等，炎性因子顯著增加，由于ALF病情進(jìn)展快，存在多種并發(fā)癥，臨床治療難度較大，而且預(yù)后極差，死亡率很高，其治療是研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)。肝移植治療肝功能衰竭較有效，但臨床應(yīng)用中由于供體缺乏、費(fèi)用昂貴，無法推廣采用[5－6]，故研究更加合理的中藥治療有重要現(xiàn)實(shí)意義。

大黃素是大黃主要有效成分之一，屬于蒽醌類，又名朱砂蓮甲素，提取出的大黃素常溫下呈針狀結(jié)晶狀。近幾年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中對(duì)大黃素的研究較為廣泛，當(dāng)前的研究發(fā)現(xiàn)，大黃素具有多種生物學(xué)作用，包括肝細(xì)胞保護(hù)、抗炎、抗腫瘤作用等，有學(xué)者分析了大黃在急性胰腺炎中的應(yīng)用，治療前，兩組患者淀粉酶、二胺氧化酶（DAO）等指標(biāo)差異不明顯，連續(xù)治療1周，兩組患者血淀粉酶、DAO等均顯著下降，觀察組血淀粉酶、DAO顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），故認(rèn)為大黃能抑制鈉離子和鉀離子，促進(jìn)上皮細(xì)胞離子主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)，具有廣泛抗菌、抗病毒的效果[7]。大黃素對(duì)機(jī)體具有雙重調(diào)節(jié)作用，既能抑制T淋巴細(xì)胞增殖，減小膿毒血癥陽性率，減小炎性因子過度釋放，又能抑制不同有絲分裂刺激脾細(xì)胞增殖。

本研究中建立了大鼠急性肝功能衰竭模型，同時(shí)在建模72 h后注射大黃素，結(jié)果大鼠血清ALT及AST水平顯著下降，且與肝衰竭模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明大黃素對(duì)肝功能有一定保護(hù)作用。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，大黃素能抑制炎性因子作用，減少內(nèi)毒素血癥，同時(shí)在清除氧自由基、減少炎性遞質(zhì)方面也有明顯作用[8]。其他研究中還發(fā)現(xiàn)，注射大黃素后，體內(nèi)炎性因子，如腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白細(xì)胞介素（IL）－6、IL－1等的分泌顯著減少，故認(rèn)為大黃素能減少肝細(xì)胞凋亡，減輕炎性反應(yīng)[9]。本試驗(yàn)中，大黃素的肝保護(hù)作用可能與上述機(jī)制有關(guān)。

NF－κB為反映肝細(xì)胞增殖的重要蛋白質(zhì)，細(xì)胞DNA的合成與NF－κB密切相關(guān)[10]。NF－κB對(duì)啟動(dòng)細(xì)胞增殖有重要作用，其表達(dá)量能直接反映細(xì)胞增殖和復(fù)制活躍程度，已成為反映細(xì)胞增殖效應(yīng)的重要指標(biāo)[11－14]。

本研究中觀察了NF－κB水平的變化，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，肝衰竭模型組大鼠肝組織的NF－κB水平上升，在72 h達(dá)到最高峰，隨后逐漸下降，而采用大黃素處理后，NF－κB則明顯下降，且下降趨勢(shì)一直持續(xù)到建模后168 h，這種變化趨勢(shì)與肝衰竭模型組存在明顯差異。說明大黃素不僅會(huì)對(duì)ALT和AST產(chǎn)生影響，還會(huì)影響NF－κB的表達(dá)。提示大黃素可能通過抑制炎癥細(xì)胞分泌和聚集減少NF－κB表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，本研究中通過建立肝衰竭大鼠模型，同時(shí)注射大黃素進(jìn)行治療，分析大黃素對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)大黃素可能減少炎性因子的釋放，抑制IKK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而達(dá)到抑制肝細(xì)胞凋亡的效果，也能為肝細(xì)胞再生提供微環(huán)境，這可能是其治療肝功能衰竭的機(jī)制，對(duì)大黃素今后的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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Effects of Emodin on NF－κB in Rats with Acute Liver Failure

Yu Ying，Wang Fengling
（Department of Infectious Diseases，Taizhou Municipal Hospital，Taizhou，Zhejiang，China 318000）

Objective To explore the dynamic changes of NF－κB in the liver of rats treated with emodin in acute hepatic failure.M ethods SD rats were randomly divided into three groups：healthy control group，liver failure model group（ALF group），and emodin group.A rat model of acute liver failure was made by D－galactosamine（D－Gal）.12 h after the model was established，the emodin group received intraperitoneal injection of 10 mg／kg emodin twice daily.At 24，72，120 and 168 h after modeling，6 rats were randomly selected from the ALF group and the emodin group.The hepatic function was examined by portal vein blood.Liver tissue was fixed with 10% formalin，and immunohistochemistry was used to detect NF－κB.Results After 24 h of modeling，the levels of alanine aminotransferase（ALT） and aspartate aminotransferase（AST） in serum were significantly higher than those in the healthy control group，the difference was statistically significant（t＝5.521，7.743，P＜0.01）；after 72 h of modeling，the liver function of rats in ALF group was significantly higher than that of emodin group at the same time point（P＜0.01）；after 24 h of modeling，the expression of NF－κB in ALF group was significantly higher than that in healthy control group（q＝3.325，P ＜0.01），and reached the peak at 72 h，and decreased after 120 h.There were significant differences in the expression of NF－κB between the emodin group and the Alf group（q＝5.638，5.527，5.314，P＜0.01）at 72，120 and 168 h after modeling.Conclusion Emodin has protective effect on acute liver failure in rats，and its mechanism may be related to the down－regulation of NF－κB expression.

liver function failure；acute；emodin；NF－κB；rats

2016－07－13；

2016－08－11)

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2010ZA118；浙江省臺(tái)州市椒江區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：112070。

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2016)22－0023－04