右美托咪啶抑制NF-κB活化減輕肢體缺血再灌注損傷的研究

鄭艷雅 溫新意 袁培根 林麗娜 倪純玨 趙喜越

右美托咪啶抑制NF-κB活化減輕肢體缺血再灌注損傷的研究

鄭艷雅 溫新意 袁培根 林麗娜 倪純玨 趙喜越

目的 探討右美托咪啶預(yù)處理對(duì)抑制NF-κB活化及減輕肢體缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制。方法 將21只成年雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、缺血再灌注+右美托咪啶預(yù)處理組（DEX組），每組各7只。DEX組在麻醉后腹腔注射右美托咪啶25μg/kg，其余兩組給予相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液，30min后單側(cè)股部切口，無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉股動(dòng)脈，用橡皮筋以恒定張力結(jié)扎該側(cè)肢體，Sham組僅行股部手術(shù)、分離股動(dòng)脈不夾閉，其余兩組缺血3h后去除動(dòng)脈夾及橡皮筋。采用ELISA法檢測(cè)血清IL-1、IL-6、TNF-α，Western blot檢測(cè)胞核NF-κB，光鏡觀察腓腸肌形態(tài)，并測(cè)定濕/干重比值。結(jié)果 顯微鏡下可見(jiàn)Sham組大鼠腓腸肌肌纖維排列整齊、間質(zhì)少有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，I/R組大鼠腓腸肌肌纖維排列紊亂并出現(xiàn)明顯水腫、間質(zhì)中出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞，DEX組大鼠腓腸肌肌纖維排列欠規(guī)則、間質(zhì)中有少量炎性細(xì)胞，但較I/R組有所好轉(zhuǎn)。與Sham組相比，I/R組濕/干重比值、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB水平均明顯升高（均P＜0.05）；與I/R組相比，DEX組濕/干重比值、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB水平均明顯降低（均P＜0.05）。結(jié)論 右美托咪啶可抑制NF-κB信號(hào)通路活化，減輕肢體缺血再灌注損傷。

缺血/再灌注損傷 NF-κB 右美托咪啶

肢體缺血再灌注損傷是指肢體在缺血一段時(shí)間后恢復(fù)血流灌注，骨骼肌的損傷不但沒(méi)有減輕反而有所加重。肢體缺血再灌注損傷在臨床上比較常見(jiàn)，如腹主動(dòng)脈手術(shù)、斷肢再植、遠(yuǎn)端血管重建術(shù)等均會(huì)造成一定程度的肢體缺血再灌注損傷[1]。因此，尋找有效的治療手段來(lái)預(yù)防或減輕缺血再灌注損傷具有重要意義。近年來(lái)，隨著對(duì)右美托咪啶研究的深入，發(fā)現(xiàn)其不僅具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抗交感活性和穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)[2]，在心[3]、肺[4]等重要器官的缺血再灌注損傷中均有一定的保護(hù)作用，Xu等[5]發(fā)現(xiàn)右美托咪啶對(duì)肢體缺血再灌注損傷也有保護(hù)作用，這與其抗氧化抗炎作用有關(guān)，但對(duì)于其器官保護(hù)作用具體機(jī)制尚未明確。有報(bào)道指出肢體缺血再灌注后，機(jī)體的NF-κB信號(hào)通路被激活，進(jìn)而促發(fā)一系列的炎癥因子產(chǎn)生，導(dǎo)致骨骼肌因炎癥反應(yīng)而發(fā)生損傷[6]，這也是造成缺血再灌注損傷的一個(gè)重要因素。本研究通過(guò)觀察肢體缺血再灌注損傷后大鼠的NF-κB及其相關(guān)炎癥因子的變化，以及右美托咪啶對(duì)NF-κB信號(hào)通路活化和肢體缺血再灌注損傷的影響，初步探討右美托咪啶對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療肢體缺血再灌注損傷提供新的治療靶點(diǎn)及途徑。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠21只，SPF級(jí)，體重280～320g；由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；垂直電泳系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；IL-1、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（上海西塘生物科技有限公司）；胞質(zhì)胞核蛋白提取試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG（英國(guó)Abcam公司）；核內(nèi)參TBP（美國(guó)Bioworld Technology公司）；BCA Protein Assay Kit（美國(guó)Thermo公司）；右美托咪啶注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）。

1.2 動(dòng)物模型的建立與分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將21只SD大鼠分為假手術(shù)組（Sham組）、肢體缺血再灌注組（I/R組）、肢體缺血再灌注+右美托咪啶預(yù)處理組（DEX組）3組，每組7只。將25%烏拉坦和10%水合氯醛1:1混合液5ml/kg腹腔注射麻醉，待大鼠眼睫毛反射和刺激下肢反射消失后，右下肢股部切口分離股動(dòng)、靜脈，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉，用橡皮筋穿過(guò)動(dòng)、靜脈，以恒定張力環(huán)扎該側(cè)肢體，觀察到大鼠該側(cè)肢體由紅潤(rùn)色變成暗紫色，說(shuō)明缺血成功；夾閉3h后松開(kāi)動(dòng)脈夾及橡皮筋恢復(fù)血供，2h后將大鼠取血、處死，并取該側(cè)腓腸肌檢測(cè)。DEX組缺血前30min腹腔注射右美托咪啶25μg/kg，其它兩組給予相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液，Sham組僅行股動(dòng)、靜脈分離術(shù)不夾閉。

1.3 腓腸肌濕/干重比值測(cè)定 切取腓腸肌，即刻稱取濕重，然后置于55℃恒溫干燥箱中至恒重即為干重，采用濕重與干重的比值來(lái)反映腓腸肌的水腫程度。

1.4 腓腸肌形態(tài)觀察 腓腸肌置于10%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察腓腸肌組織形態(tài)變化。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清IL-1、IL-6、TNF-α水平 依照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別采用抗大鼠IL-1、IL-6、TNF-α單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的IL-1、IL-6、TNF-α與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠IL-1、IL-6、TNF-α，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450nm處測(cè)OD值，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到IL-1、IL-6、TNF-α水平。

1.6 Western blot檢測(cè)腓腸肌NF-κB的表達(dá) 依照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取胞核蛋白，采用BCA法測(cè)定濃度。蛋白在10%SDS-PAGE中室溫電泳分離，NF-κB（300mA、70min）濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加NF-κB（稀釋度1∶2 000）和TBP（稀釋度1∶500）一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，10min/次，加入生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，TBST洗膜3次，10min/次，ECL化學(xué)發(fā)光法覆蓋條帶，暗室中顯影、定影，將膠片沖洗后晾干。膠片掃描后，采用Image J測(cè)定各目的條帶的吸光度（A）值，并以目的蛋白和相應(yīng)內(nèi)參的A值比值表示目的條帶相對(duì)強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnet′t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組腓腸肌濕/干重比值的比較 Sham組濕/干重比值較??；與Sham組比較，I/R組骨骼肌濕/干重比值明顯升高（P＜0.05）；與I/R組比較，DEX組濕/干重比值降低（P＜0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 各組腓腸肌濕/干重比值的比較

2.2 各組腓腸肌形態(tài)變化 橫切面觀察發(fā)現(xiàn)：Sham組，肌纖維呈多邊形結(jié)構(gòu)規(guī)則排列，未見(jiàn)細(xì)胞腫脹，間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，血管周?chē)匆?jiàn)明顯炎癥細(xì)胞滲出；I/R組細(xì)胞排列不規(guī)則，染色明顯變淡、界限不清晰，細(xì)胞腫脹明顯，間質(zhì)見(jiàn)彌散的紅細(xì)胞，血管周?chē)梢?jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；DEX組細(xì)胞排列欠規(guī)則，細(xì)胞染色稍有變淡、界限欠清晰，間質(zhì)偶見(jiàn)紅細(xì)胞，血管周?chē)猩倭垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，但與I/R組相比有明顯好轉(zhuǎn)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組骨骼肌的病理改變（a：Sham組；b：I/R組；c：DEX組；HE染色，×400）

2.3 各組血清IL-1、IL-6、TNF-α水平的比較 Sham組IL-1、IL-6、TNF-α水平較低；與Sham組相比，I/R組IL-1、IL-6、TNF-α水平均明顯升高（均P＜0.05）；與I/R組相比，DEX組IL-1、IL-6、TNF-α水平均明顯降低（均P＜0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 各組血清IL-1、IL-6、TNF-α水平的比較（pg/ml）

2.4 各組腓腸肌NF-κB表達(dá)的比較 Sham組胞核NF-κB電泳條帶A值與內(nèi)參TBP電泳條帶A值的比值較小；與Sham組比較，I/R組胞核NF-κB A值與內(nèi)參A值得比值升高（P＜0.05）；與I/R組比較，DEX組胞核NF-κB A值與內(nèi)參A值的比值顯著降低（P＜0.05），詳見(jiàn)表3。

表3 各組骨骼肌NF-κB表達(dá)的比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)常用阻斷血管的方法成功制作了肢體缺血再灌注損傷模型，進(jìn)一步證實(shí)了右美托咪啶對(duì)肢體缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[5,7]。同時(shí)筆者也發(fā)現(xiàn)，右美托咪啶可以下調(diào)肢體缺血再灌注損傷后的NF-κB核內(nèi)轉(zhuǎn)移，使相關(guān)炎癥因子生成減少，減輕肢體缺血再灌注所造成的損傷。

肢體缺血再灌注損傷是臨床診療中不可忽視的一個(gè)問(wèn)題，越來(lái)越多的證據(jù)顯示炎癥反應(yīng)在肢體缺血再灌注損傷中起到了舉足輕重的作用，而IL-1、IL-6、TNF-α等大量炎癥因子的釋放是炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵[8]，同時(shí)作為轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活是上述基因表達(dá)的前提。隨著研究的深入，NF-κB對(duì)炎性分子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、在細(xì)胞凋亡中的作用逐漸引起人們重視。目前已經(jīng)證實(shí)，NF-κB的結(jié)合序列存在于多種基因的啟動(dòng)子區(qū)域，包括IL-1、IL-6、TNF-α等[9]。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物中NF-κB家族的亞單位有5種：Rel-A（p65）、Rel-B、c-Rel（Rel）、NF-κB1（p105/p50）和NF-κB2（p100/p52），Western blot檢測(cè)的具體是針對(duì)亞基為Rel-A（p65）。它們通常以同源二聚體或異源二聚體非活性形式與其抑制蛋白I-κB形成復(fù)合物，存在于幾乎所有類(lèi)型細(xì)胞的胞質(zhì)。當(dāng)I-κB磷酸化、被蛋白酶降解，NF-κB會(huì)從NF-κB-I-κB復(fù)合物中解離出來(lái)并轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核，與相應(yīng)的靶基因結(jié)合[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R組較Sham組NF-κB表達(dá)增多（P＜0.05），這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[6]，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，DEX組大鼠較I/R組NF-κB表達(dá)降低（P＜0.05），這說(shuō)明右美托咪啶可以減少NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)移。

IL-1由激活的巨噬細(xì)胞及幾乎所有的有核細(xì)胞產(chǎn)生，可促發(fā)多種體內(nèi)炎癥反應(yīng)如發(fā)熱、血管阻力降低、毛細(xì)血管通透性增加等；IL-6為巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞所分泌的一種炎癥介質(zhì)且能被IL-1和TNF-α所誘導(dǎo)，是急性期反應(yīng)的主要細(xì)胞因子[11]；TNF-α是主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種單核因子，是肢體缺血再灌注損傷過(guò)程中的始動(dòng)因子[8]，可提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，刺激內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)IL-1、IL-6的分泌[12]，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體局部炎癥反應(yīng)及組織損傷的擴(kuò)大。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，I/R組大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯增高（P＜0.05），表現(xiàn)為缺血腓腸肌的濕/干重比值明顯增多（P＜0.05），而與I/R組相比，DEX組IL-1、IL-6、TNF-α水平及濕/干重比值均明顯降低（均P＜0.05）。同時(shí)HE染色發(fā)現(xiàn)，Sham組肌纖維排列整齊、間質(zhì)少有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，I/R組肌纖維排列紊亂并出現(xiàn)明顯水腫、間質(zhì)中出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞，DEX組肌纖維排列欠規(guī)則、間質(zhì)中有少量炎性細(xì)胞，但較I/R組有所好轉(zhuǎn)。

綜上所述，右美托咪啶可以減少肢體缺血再灌注損傷骨骼肌NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)移，促使 IL-1、IL-6、TNF-α在內(nèi)的炎癥因子生成減少，降低肢體缺血再灌注后骨骼肌的損傷。

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Dexmedetomidine reduces ischemia-reperfusion injury in skeletal muscle via suppressing activation of NF-κB

ZHENG Yanya,WEN Xinyi，YUAN Peigen,et al.Department of Anesthesiology,Wenzhou People's Hospital,Wenzhou 325000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of dexmedetomidine (DEX)on skeletal muscle injury induced by ischemia-reperfusion and related mechanisms. Methods Twenty-one SD rats were randomly divided into sham-operated group(sham group),ischemia-reperfusion(I/R)group and I/R+DEX group.In DEX group,DEX(25μg/kg)was injected after anesthesia;while in the other groups,the same volume of saline was also injected.After 30 minutes,the hind limb ischemia was induced by clamping the common femoral artery and ligating collateral circulation.After 3h of ischemia,the clamp and tourniquet were removed and the rats underwent reperfusion for 2h.The plasma concentrations of IL-1,IL-6 and TNF-α were measured with enzyme-linked immunosorbent assay.The gastrocnemius muscle was harvested,the expression of NF-κB protein was detected by Western blot;the morphological changes were observed with HE staining;the wet/dry ratio was also measured. Results The intact muscle fiber and few inflammatory cells infiltration in interstitial space were observed with light microscopy in sham group.Disordered arrangement and edema of muscle fibers and interstitial inflammatory cells infiltration were showed in I/R group.In DEX group,the disordered arrangement of muscle fiber and infiltration of inflammatory cells in the stroma were attenuated as compared to I/R group.The wet/dry ratio,plasma levels of TNF-α and NF-κB were higher in I/R group than those in sham group(P＜0.05).The wet/dry,plasma IL-1,IL-6,TNF-α levels and NF-κB expression were significantly lower in DEX group than those in I/R group(P＜0.05). Conclusion Dexmedetomidine can reduce the ischemia-reperfusion injury of skeletal muscle,which is associated with the inhibition of NF-κB activation.

Reperfusion injury NF-κB Dexmedetomidine

2015-10-16）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140561）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)溫州市第三臨床學(xué)院、溫州市人民醫(yī)院麻醉科（鄭艷雅、溫新意）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科（袁培根、林麗娜、倪純玨、趙喜越）

趙喜越，E-mail：544649314@qq.com