趨化素上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶的表達促進大鼠球囊損傷后頸動脈重塑

劉華東 熊瑋 董少紅 吳美善 李江華 張鍵

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·基礎(chǔ)研究·

趨化素上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶的表達促進大鼠球囊損傷后頸動脈重塑

劉華東 熊瑋 董少紅 吳美善 李江華 張鍵

目的 觀察抑制趨化素基因?qū)Υ笫箢i動脈球囊損傷后血管重塑的作用及機制。方法 構(gòu)建大鼠頸動脈球囊損傷模型，模型組只進行球囊損傷術(shù)，不進行局部轉(zhuǎn)染；慢病毒對照組球囊損傷術(shù)后于頸總動脈局部灌注對照慢病毒30min；慢病毒抑制組大鼠在球囊損傷術(shù)后于頸總動脈局部灌注趨化素基因缺陷慢病毒30min。在頸動脈局部轉(zhuǎn)染趨化素基因缺陷性慢病毒，轉(zhuǎn)染后第3天采用Real-timePCR檢測頸動脈局部組織中趨化素的表達水平。觀察抑制趨化素表達后頸動脈的內(nèi)膜形態(tài)變化。采用5-溴-脫氧脲苷(BrdU)法檢測頸動脈組織中血管平滑肌細胞的增殖情況，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測頸動脈組織中磷酸化的p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK1/2)、磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)的水平。結(jié)果 在轉(zhuǎn)染趨化素基因缺陷慢病毒后第3天，慢病毒抑制組趨化素mRNA水平顯著低于模型組[(0.1633±0.02)比(1.005±0.02)，P<0.001]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。球囊損傷導(dǎo)致大鼠頸動脈內(nèi)膜BrdU陽性顆粒明顯增加，內(nèi)膜顯著增生，p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK的蛋白水平顯著上升；抑制頸動脈中趨化素表達后，大鼠頸動脈內(nèi)膜BrdU陽性顆粒減少，內(nèi)膜增生程度減輕，p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK的蛋白表達水平也隨之顯著下降。結(jié)論 趨化素可以通過上調(diào)p38MAPK、ERK1/2及JNK的磷酸化水平，促進頸動脈損傷后內(nèi)膜增生的發(fā)生。

趨化素； 血管平滑肌細胞； 血管重塑； 絲裂原活化蛋白激酶

血管損傷后的重塑過程是動脈粥樣硬化和血管介入損傷后再狹窄的主要機制，其病理學(xué)基礎(chǔ)主要是局部炎性細胞的浸潤和中膜血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的增殖和遷移[1]。趨化素(chemerin)最初被認為是一種脂肪因子，對其研究主要集中在內(nèi)分泌和代謝領(lǐng)域[2-3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)趨化素還具有趨化因子和生長因子的作用，與腫瘤生長和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)，但具體作用尚不清楚[4-7]。在前期研究中，本研究組發(fā)現(xiàn)沉默VSMC中的趨化素基因后，VSMC的增殖能力顯著降低，磷酸化c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, p-JNK)的表達下降，表明趨化素具有促進VSMC增殖的作用[8-9]。本研究探討趨化素與球囊損傷導(dǎo)致的血管重塑關(guān)系及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

大鼠趨化素基因缺陷性慢病毒和對照慢病毒由本實驗室合成和鑒定，于-80℃保存。5-溴-脫氧脲苷(5-bromo-deoxyuridine，BrdU)抗體購自Santa Cruze公司，磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p38 mitogen activated protein kinase，p-p38 MAPK)、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶( extracellular regulated protein kinases1/2，p-ERK 1/2)、p-JNK抗體購自Abcam公司。

1.2 實驗動物和分組

健康成年雄性SD大鼠(300±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2012-0001，SPF級，動物合格證號為11400700115856。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20℃～25℃，相對濕度40%～70%。大鼠在實驗前于動物房環(huán)境中適應(yīng)6 d。

83只SD大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組(n=15)、模型組(n=20)、慢病毒抑制組(n=24)和慢病毒對照組(n=24)。

1.3 實驗方法

1.3.1 構(gòu)建球囊損傷頸動脈內(nèi)膜增生模型 按照本研究組前期研究采用的方法構(gòu)建大鼠頸動脈球囊損傷模型[10]。其中假手術(shù)組只進行頸動脈結(jié)扎，不進行球囊損傷術(shù)；模型組只進行球囊損傷術(shù)，不進行局部轉(zhuǎn)染；慢病毒對照組球囊損傷術(shù)后于頸總動脈局部灌注對照慢病毒30 min；慢病毒抑制組大鼠在球囊損傷術(shù)后于頸總動脈局部灌注趨化素基因缺陷慢病毒30 min。轉(zhuǎn)染后第3天取頸總動脈組織，采用Real-time PCR檢測頸動脈組織中趨化素mRNA的表達，驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.3.2 血管平滑肌細胞增殖 轉(zhuǎn)染后第7天各組隨機處死5只大鼠，在大鼠處死前24 h經(jīng)腹腔注射BrdU(100 mg/kg)。用4%多聚甲醛原位灌注固定后取頸總動脈，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片，進行BrdU免疫組化染色。在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)中膜和新生內(nèi)膜BrdU陽性細胞核。BrdU指數(shù)=二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色的陽性細胞核/蘇木素染色的總細胞核。

1.3.3 頸動脈內(nèi)膜形態(tài)學(xué)檢測 轉(zhuǎn)染后第14天各組隨機取5只大鼠處死，取頸總動脈損傷處中段約2 cm血管組織，部分常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察內(nèi)膜形態(tài)，在計算機圖像分析系統(tǒng)中測量內(nèi)膜、中膜面積，計算內(nèi)膜/中膜面積比。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot) 轉(zhuǎn)染后第14天各組隨機取5只大鼠處死，取頸總動脈損傷處中段約2 cm血管組織，常規(guī)提取總蛋白。在10%的SDS-PAGE中每孔加入20 μL蛋白溶液，以80 V、30 min及120 V、1 h進行電泳分離；半干轉(zhuǎn)液38 mA、90 min轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%牛奶封閉2 h。加入兔抗大鼠p-p38 MAPK一抗、p-JNK一抗(1∶200)、p-ERK 1/2一抗(1∶200)及GAPDH一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。1‰ TBST洗3次，每次10 min，加入羊抗兔二抗(1∶6000)孵育1 h，再以1‰ TBST洗3次，每次10 min，加入ECL發(fā)光液100 μl在Image Quant RT ECL冷CCD成像系統(tǒng)進行顯影，用Imagequant TL軟件進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效果

在轉(zhuǎn)染趨化素基因缺陷慢病毒后第3天，采用Real-time PCR驗證轉(zhuǎn)染效果顯示，模型組與慢病毒對照組趨化素mRNA比較[(1.005±0.02)比(0.950±0.03)，P>0.05]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而慢病毒抑制組趨化素mRNA水平顯著低于模型組[(0.1633±0.02)比(1.005±0.02)，P<0.001]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

圖1 Real-time PCR檢測頸動脈組織的趨化素mRNA水平(n=5)

2.2 趨化素促進血管平滑肌細胞增殖

在轉(zhuǎn)染慢病毒7 d后采用免疫組化法檢測頸動脈組織中BrdU的表達，假手術(shù)組大鼠未見明顯BrdU陽性顆粒；模型組和慢病毒對照組大鼠頸動脈組織可見大量棕褐色BrdU陽性顆粒，表明VSMC顯著增殖；慢病毒抑制組大鼠頸動脈中棕褐色BrdU陽性顆粒顯著減少，表明抑制趨化素表達后VSMC增殖減少(圖2)。

2.3 趨化素促進頸動脈內(nèi)膜增生

在轉(zhuǎn)染趨化素基因缺陷性慢病毒14 d后檢測頸動脈內(nèi)膜形態(tài)，假手術(shù)組大鼠頸動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)彈力膜完整，中膜血管平滑肌細胞排列整齊，無新生內(nèi)膜形成；模型組和慢病毒對照組大鼠頸動脈管壁中的血管平滑肌細胞由中膜向內(nèi)膜增生，新生內(nèi)膜形成，細胞排列紊亂，管腔狹窄，新生內(nèi)膜較厚，并伴隨泡沫細胞和纖維結(jié)締組織形成；而慢病毒抑制組大鼠頸動脈內(nèi)膜雖然存在增生，但增生程度明顯減輕，泡沫細胞和纖維結(jié)締組織較少，內(nèi)皮較光滑(圖3)。

2.4 趨化素上調(diào)p38MAPK磷酸化水平

在球囊損傷后14 d檢測蛋白表達，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠頸動脈組織的p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2表達上調(diào)；慢病毒抑制組中抑制趨化素基因表達后，球囊損傷誘導(dǎo)的p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2表達上調(diào)均被抑制(表1、圖4)，表明趨化素具有上調(diào)MAPK蛋白表達的作用。

表1 各組蛋白質(zhì)相對表達量比較情況

注：p-ERK1/2，酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；p-JNK，磷酸化c-jun氨基末端激酶；p-p38MAPK，磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶;a，與假手術(shù)組相比，P>0.05；b，慢病毒抑制組與模型組相比，P<0.01；c，慢病毒抑制組與模型組相比，P<0.05

3 討論

趨化素是孤獨G蛋白偶聯(lián)受體趨化因子受體1(CMKLR1)的內(nèi)源性配體，其主要產(chǎn)生部位是肝和白色脂肪組織，在成熟的脂肪細胞中趨化素和CMKLR1表達水平較高，因而最初認為趨化素是一種脂肪因子，促進脂肪細胞生長，參與脂肪組織生成[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，趨化素通過CMKLR1活化p38MAPK通路，誘導(dǎo)白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶等表達，促進巨噬細胞的活性，募集炎癥細胞在損傷部位聚集和黏附，表明趨化素具有趨化因子的作用[12]。在胃癌細胞中，趨化素通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-7的表達，促進p38MAPK和ERK1/2的磷酸化，促進胃癌細胞的生長和侵襲，表明趨化素具有生長因子的作用[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠高血壓病、冠心病、擴張型心肌病及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎合并心血管疾病的患者中，循環(huán)血趨化素水平明顯升高[5-7,13]。體外研究發(fā)現(xiàn)，趨化素通過CMKLR1可以促進新生血管的生成[14]，且可呈濃度依賴性促進胸主動脈的收縮舒張，調(diào)節(jié)血管功能[15]。這些研究均表明趨化素與心血管疾病發(fā)生具有相關(guān)性。

圖2 免疫組化法檢測頸動脈組織5-溴-脫氧脲苷表達(×100) A：假手術(shù)組；B：模型組；C：慢病毒對照組；D：慢病毒抑制組

圖3 頸動脈內(nèi)膜形態(tài)學(xué)分析(×100) A：假手術(shù)組；B：模型組；C：慢病毒對照組；D：慢病毒抑制組

p-ERK1/2，酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶；p-JNK，磷酸化c-jun氨基末端激酶；p-p38MAPK，磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶圖4 趨化素上調(diào)頸動脈組織中的蛋白表達

VSMC是血管中膜的主要細胞，其表型轉(zhuǎn)換、增殖和遷移是導(dǎo)致動脈粥樣硬化、血管介入后發(fā)生再狹窄的主要病理機制[16]。本研究組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，沉默VSMC中的趨化素基因后，VSMC的增殖能力顯著降低，同時JNK磷酸化水平下降，表明趨化素具有促進VSMC增殖的作用[8-9]。在本研究中，利用慢病毒載體沉默頸動脈局部組織中的趨化素基因發(fā)現(xiàn)，在抑制頸動脈局部組織中的趨化素基因后，球囊損傷導(dǎo)致的內(nèi)膜增生顯著減輕，頸動脈組織VSMC的增殖也被顯著抑制。與此同時，球囊損傷導(dǎo)致的p38MAPK、ERK 1/2、JNK磷酸化水平上調(diào)也在沉默趨化素基因后被顯著抑制。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)趨化素具有促進大鼠頸動脈損傷后血管重塑的作用，該作用與p38MAPK磷酸化水平上調(diào)有關(guān)，對其詳細調(diào)控機制尚需進一步研究探索。

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Chemerin stimulated rat carotid neointimal remodeling by activation of MAPK

LIUHua-dong,XIONGWei,DONGShao-hong,WUMei-shan,LIJiang-hua,ZHANGJian.DepartmentofCardiology,ShenzhenPeople′sHospital，theSecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Shenzhen518020，China

Correspondingauthor:DONGShao-hong,Email:dsh266@medmail.com.cn

Objective To investigate the role and mechanism of chemerin in carotid artery remodeling after angioplasty. Methods Chemerin gene was knockdown by chemerin gene deficient lentivirus in carotid injured rats caused by angioplasty. Chemerin mRNA was tested by real time PCR. After chemerin was knockdown, the intimal morphology of carotid was surveyed and the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) was explored by BrdU staining. The protein levels of phosphorylated-p38 MAPK, phosphorylated-ERK 1/2, phosphorylated-JNK were investigated by Western blot analysis. Results Local chemerin expression of carotid was significantly suppressed by chemerin deficient lentivirus (P<0.001). In carotid injured rats, significant intimal hyperplasia and VSMCs proliferation occurred. The protein levels of p-p38 MAPK, p-ERK 1/2, p-JNK were up-regulated. After chemerin was knockdown, the intimal hyperplasia of carotid and VSMCs proliferation were significantly attenuated and the protein levels of p-p38 MAPK, p-ERK 1/2, p-JNK were simultaneously down-regulated. Conclusions Chemerin may stimulate rat carotid neointimal remodeling by activation of MAPK.

Chemerin； Vascular smooth muscle cell； Vascular remodeling； Mitogen activated protein kinase

10.3969/j.issn.1004-8812.2016.11.013

深圳市科技創(chuàng)新計劃項目(jcyj20150403101028192)

518020 廣東深圳，深圳市人民醫(yī)院心內(nèi)科 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(劉華東、熊瑋、董少紅、吳美善、李江華)；廣東深圳，中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院(張鍵)

董少紅，Email：dsh266@medmail.com.cn

R543

2016-06-05)