醇脫氫酶不對(duì)稱還原2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯

余道福，張曉健，黃建峰，陳翔，柳志強(qiáng)

(1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014；

2.浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310014)

醇脫氫酶不對(duì)稱還原2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯

余道福1,2，張曉健1,2，黃建峰1,2，陳翔1,2，柳志強(qiáng)1,2

(1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014；

2.浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310014)

孟魯司特鈉是主要的抗哮喘藥物之一，2-[3-(S)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯是孟魯斯特鈉的關(guān)鍵手性砌塊。以實(shí)驗(yàn)室篩選到的醇脫氫酶不對(duì)稱還原2-[3-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯，制備2-[3-(S)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯。在輔酶添加量為0.1 g/L，底物濃度為219.3 mmol/L，菌體用量為30 g/L，pH 7.5，45℃反應(yīng)7 h后，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，時(shí)空產(chǎn)率為31.2 mmol/(L·h)，產(chǎn)物e.e.值大于99.9%。通過分批補(bǔ)料，反應(yīng)5 h，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，e.e.＞99.9%，時(shí)空產(chǎn)率達(dá)43.7 mmol/(L·h)，是一次性投料的1.4倍。

醇脫氫酶；孟魯司特鈉；不對(duì)稱還原

孟魯斯特鈉（Montelukast Sodium），化學(xué)名為[R-(E)]-1-[[[1-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-[2-(1-羥基-1-甲基乙基)苯基]丙基]硫代]甲基]環(huán)丙基乙酸鈉（結(jié)構(gòu)式如右圖），是目前主要的抗哮喘藥物之一，由Merk公司研制[1]。孟魯斯特鈉作為一種白三烯受體拮抗劑，對(duì)I型半胱氨酰白三烯（CysLT）受體具有高度的親和性和選擇性，能有效抑制半胱氨酰白三烯（LTC，LTD，LTE）與CysLT受體結(jié)合所產(chǎn)生的生理效應(yīng)而無任何受體激動(dòng)活性[2]。2-[3-(S)-[3-[2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸甲酯（(S)-2）是孟魯斯特鈉的關(guān)鍵手性中間體，作為該藥物的主體結(jié)構(gòu)，其高效合成方法的研究一直是孟魯斯特鈉合成的研究熱點(diǎn)。該中間體的合成分為化學(xué)法和酶法合成兩類方法?；瘜W(xué)合成孟魯斯特鈉最初由Merck Frosst Canada Inc.開發(fā)，并申請(qǐng)了多個(gè)相關(guān)專利[3-5]，關(guān)鍵反應(yīng)步驟是通過手性試劑還原得到手性中間體醇[6-7]。在手性還原試劑的作用下，底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的對(duì)映體選擇性均可滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。但是，該類型反應(yīng)條件苛刻，需高溫高壓、氮?dú)獗Ｗo(hù)、極度低溫等系列操作條件，一定程度上限制了工業(yè)化應(yīng)用[8-9]。Zhu等[10]報(bào)道的以Ir/SpiroPAP作為手性催化劑進(jìn)行手性中間體醇的合成，其反應(yīng)條件較為溫和，單位底物的催化劑添加量較低。但該方法轉(zhuǎn)化率只有90%～95%，且副產(chǎn)物較多，另外要求在高壓及完全干燥的環(huán)境下進(jìn)行。

以醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase,ADH，EC 1.1.1.1）為催化劑，進(jìn)行關(guān)鍵中間體的合成首先由Roberge等報(bào)道，如下圖所示。利用Microbacterium sp.MB 5614中的醇脫氫酶催化底物酮生成S構(gòu)型的醇，e.e.值達(dá)到了95%，且酶法催化具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好以及原子利用率高等優(yōu)勢(shì)[11-12]。底物酮1在水相中幾乎不溶，需要選擇合適的有機(jī)溶劑進(jìn)行溶解[13]，而生物酶在有機(jī)溶劑中活力低、穩(wěn)定性差[14]，制約了酶的工業(yè)化應(yīng)用。篩選對(duì)有機(jī)溶劑耐受性強(qiáng)、酶活力高和穩(wěn)定性好的生物催化劑具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。筆者利用實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的氧化還原酶酶庫，篩選獲得一株產(chǎn)醇脫氫酶菌株E.coli BL21/ pET 28b-ADH，并對(duì)其催化合成(S)-2的反應(yīng)條件進(jìn)行了考察。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

菌株Escherichia coli BL21/pET28b-ADH（實(shí)驗(yàn)室編號(hào)：ZJB14004），由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂糖20 g/L，pH 7.0，121℃滅菌20 min后補(bǔ)加卡那霉素至最終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

種子培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，121℃滅菌20 min后補(bǔ)加卡那霉素至最終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g/L，酵母粉12 g/L，NaCl 10 g/L，(NH4)2SO45 g/L，甘油15 g/L，KH2PO41.36 g/L，K2HPO4·3H2O 2.28 g/L，MgSO4· 7H2O 0.375 g/L，pH 7.0，滅菌后補(bǔ)加卡那霉素至最終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體培養(yǎng)方法

種子液培養(yǎng)：將甘油管保藏的菌種進(jìn)行卡那抗性平板劃線活化培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12 h后用接種環(huán)挑取單菌落至卡那抗性斜面活化。用接種環(huán)挑取1接種環(huán)菌接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，150 r/min，37℃培養(yǎng)8 h，至OD600為4.5～5.0時(shí)用作種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：吸取2 mL種子液接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，150 r/min，37℃培養(yǎng)至菌液OD600為0.4～0.6時(shí)加入乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑最終質(zhì)量濃度為10 g/L，于150 r/min，28℃下誘導(dǎo)11 h。

1.2.2 酶促催化反應(yīng)

靜息細(xì)胞制備：誘導(dǎo)結(jié)束后，發(fā)酵液在8 000 r/min，4℃條件下離心10 min，收集菌體細(xì)胞，用9%的生理鹽水洗滌菌體2次，離心棄上清后保存于-20℃冰箱中備用。

催化反應(yīng)過程：催化反應(yīng)體系10 mL，異丙醇5 mL，三乙醇胺緩沖液（100 mmol/L，pH 7.0）4 mL，甲苯1 mL，NADP+0.1 g/L，醇脫氫酶質(zhì)量濃度為30 g/L。加入219.3 mmol/L底物后，500 r/min，40℃磁力攪拌轉(zhuǎn)化。

樣品處理方法：取50 μL轉(zhuǎn)化液加到50 μL四氫呋喃中終止反應(yīng)，溶解其中的產(chǎn)物和底物，離心后上清用流動(dòng)相稀釋300倍，經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾后進(jìn)行高效液相檢測(cè)。

1.2.3 分析方法

底物、產(chǎn)物采用高效液相色譜分析。色譜柱使用Chiracel OD-H正相柱（250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動(dòng)相V（正己烷）∶V（異丙醇）=80∶20，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫40℃。

產(chǎn)物的e.e.值按如下公式計(jì)算

式中：A（S）表示S構(gòu)型產(chǎn)物的峰面積，A（R）表示R構(gòu)型產(chǎn)物的峰面積。

底物的轉(zhuǎn)化率η按如下公式計(jì)算

式中：C0表示起始底物濃度，g/mL；C表示反應(yīng)后底物濃度，g/mL；V表示反應(yīng)體系體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 輔酶依賴類型的確定

醇脫氫酶在進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，需輔酶參與，不同來源的醇脫氫酶所需輔酶類型也不相同。添加不同類型輔酶，檢測(cè)反應(yīng)最終的轉(zhuǎn)化率及e.e.值，對(duì)該酶的輔酶依賴類型進(jìn)行考察。該酶在添加NADP+時(shí)，轉(zhuǎn)化率為99.7%，明顯高于添加NAD+時(shí)的轉(zhuǎn)化率（90.4%）?？梢源_定該細(xì)胞中存在內(nèi)源性的輔酶，而且該酶是以NADPH作為氫供體進(jìn)行催化還原反應(yīng)。另外，不同類型輔酶添加不影響e.e.值（均大于99.9%）。

2.2 輔酶濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了輔酶的濃度對(duì)該酶催化不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1所示。在不添加輔酶的情況下，反應(yīng)24 h，底物轉(zhuǎn)化率為95.9%，底物不能完全轉(zhuǎn)化；隨著輔酶質(zhì)量濃度從0 g/L升高到0.1 g/L，底物轉(zhuǎn)化率升高到99.6%，表明內(nèi)源性輔酶并不能滿足不對(duì)稱還原反應(yīng)的需要，需要添加外源性輔酶以維持反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行；在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)增加輔酶質(zhì)量濃度，底物轉(zhuǎn)化率沒有明顯的提高，因此確定該反應(yīng)需添加外源性輔酶，添加量為0.1 g/L。

2.3 催化劑形式對(duì)催化反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)考察了菌體用量為30 g/L時(shí)，細(xì)胞破碎液與全細(xì)胞兩種催化劑形式對(duì)催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示。采用細(xì)胞破碎液催化和采用全細(xì)胞作為催化劑，二者最終的轉(zhuǎn)化率均為96%；以細(xì)胞破碎液為催化劑，在17 h底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值，全細(xì)胞則需要24 h。考慮綜合成本，本實(shí)驗(yàn)采用全細(xì)胞進(jìn)行催化。

2.4 催化反應(yīng)有機(jī)相種類與比例的確定

為提高底物的溶解性，實(shí)驗(yàn)考察了13種常用有機(jī)溶劑，添加的體積分?jǐn)?shù)為10%，結(jié)果如表1所示。底物在以甲苯、二甲苯和間二甲苯作為助溶劑的反應(yīng)體系中，轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)98%左右；以其他類型的有機(jī)溶劑作為助溶劑，底物轉(zhuǎn)化率均低于90%。對(duì)轉(zhuǎn)化率和lg P值綜合分析可知，隨著有機(jī)溶劑lg P值的升高，轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，推測(cè)隨著lg P值的增高，有機(jī)溶劑在水相中的分配比例降低，對(duì)酶的抑制作用減小，轉(zhuǎn)化率增加。綜合考慮經(jīng)濟(jì)性及催化效率，選擇甲苯作為助溶劑進(jìn)行催化反應(yīng)。另外，實(shí)驗(yàn)室所選擇的13種有機(jī)溶劑，產(chǎn)物e.e.值均大于99.9%，說明有機(jī)溶劑對(duì)于酶的立體選擇性沒有影響。

表1 兩相體系催化合成(S)-1中有機(jī)溶劑的篩選

在兩相體系反應(yīng)中，底物和產(chǎn)物主要溶于有機(jī)相，酶則存在于水相。實(shí)驗(yàn)考察了甲苯的添加比例對(duì)催化反應(yīng)的影響。當(dāng)甲苯的體積分?jǐn)?shù)為5%～15%時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)99.5%以上；甲苯的體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值99.8%；當(dāng)甲苯的體積分?jǐn)?shù)大于15%后，繼續(xù)增加甲苯的體積分?jǐn)?shù)，底物轉(zhuǎn)化率迅速下降。說明有機(jī)溶劑的比例過高，會(huì)嚴(yán)重降低酶的活力。

2.5 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)催化反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)考察了轉(zhuǎn)化溫度對(duì)不對(duì)稱還原效率的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度在25～35℃時(shí)，隨著溫度的升高，底物轉(zhuǎn)化率由84%升高到97%；當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度在35～45℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率在97%左右；當(dāng)溫度繼續(xù)升高至50℃以上時(shí)，轉(zhuǎn)化率迅速下降。進(jìn)一步對(duì)35，40，45℃下的反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行研究（圖4），當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度在45℃時(shí)，反應(yīng)速度最快，5 h達(dá)到平衡。因此選擇45℃作為最優(yōu)反應(yīng)溫度。

2.6 pH對(duì)催化反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)考察了pH為6.5～8.9時(shí)對(duì)催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)pH由6.5升高到7.5時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率逐漸升高；當(dāng)pH為7.5時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值97.6%；當(dāng)pH高于7.5時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率明顯下降。pH對(duì)酶的立體選擇性沒有影響，e.e.值始終保持在99.9%以上。因此選擇pH 7.5為最適反應(yīng)pH。

2.7 金屬離子種類與濃度對(duì)催化反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)考察了不同種類、不同濃度的金屬離子對(duì)酶催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如表2所示。金屬離子對(duì)酶的立體選擇性沒有任何影響，e.e.值均在99.9%以上。不同金屬離子在不同濃度下對(duì)酶催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率影響較大。在體系中分別添加1 mmol/L的Co2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+，K+等金屬離子，底物的轉(zhuǎn)化率保持在99.5%以上，而Fe3+，Zn2+和Mn2+對(duì)酶活具有明顯的抑制作用，底物轉(zhuǎn)化率分別只有77.4%，56.8%和40.6%；當(dāng)金屬離子添加濃度為10 mmol/L時(shí)，Ca2+，Mg2+，Ba2+，K+的底物轉(zhuǎn)化率保持在99.4%以上，說明Ca2+，Mg2+，Ba2+，K+具有提高該酶催化活性的作用；而其余的金屬離子對(duì)酶催化反應(yīng)都有明顯的抑制作用，添加Fe3+，F(xiàn)e2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+后，幾乎檢測(cè)不到產(chǎn)物，說明以上金屬離子對(duì)酶有很強(qiáng)的抑制作用。

2.8 分批補(bǔ)料對(duì)催化反應(yīng)的影響

考慮到反應(yīng)體系中可能存在底物抑制，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了分批補(bǔ)料催化的研究。在初始底物濃度為65.5 mmol/L的反應(yīng)體系中，于反應(yīng)80，160 min時(shí)分別加入65.5和87.3 mmol/L底物，對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。反應(yīng)5 h，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，產(chǎn)物產(chǎn)量218.3 mmol/L，e.e.＞99.9%，時(shí)空產(chǎn)率為43.7 mmol/(L·h)，高于一次性投料轉(zhuǎn)化的水平（31.2 mmol/(L·h)，圖7）。

表2 金屬離子對(duì)不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響

在補(bǔ)料反應(yīng)的基礎(chǔ)上增加了每次添加的底物濃度，反應(yīng)初始底物濃度為87.3 mmol/L，反應(yīng)100，200 min時(shí)分別向體系中加入87.3 mmol/L的底物，對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖8所示。反應(yīng)320 min時(shí)，底物添加量累積達(dá)到263.2 mmol/ L，產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到261.9 mmol/L，單位菌體時(shí)空產(chǎn)率為1.64 mmol/(L·h)，高于已有報(bào)道水平[13]；在320 min繼續(xù)添加87.3 mmol/L底物后，底物不能完全轉(zhuǎn)化，說明酶已部分失活或存在產(chǎn)物抑制作用。

3 結(jié)論

筆者利用實(shí)驗(yàn)室篩選的醇脫氫酶產(chǎn)生菌株E.coli BL21/pET 28b-ADH（本實(shí)驗(yàn)室保藏，編號(hào)為ZJB14004）不對(duì)稱還原底物酮1，制備關(guān)鍵手性中間體醇(S)-2。在菌體用量30 g/L，底物濃度219.3 mmol/L的條件下，確定最了適反應(yīng)條件。在最優(yōu)條件下，反應(yīng)7 h后底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，時(shí)空產(chǎn)率31.2 mmol/(L·h)，產(chǎn)物e.e.值大于99.9%。分批補(bǔ)料研究表明：分兩批補(bǔ)料，反應(yīng)5 h，轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，產(chǎn)物生成量為218.3 mmol/L， e.e.＞99.9%，時(shí)空產(chǎn)率為43.7 mmol/(L·h)，是一次性投料的1.4倍。本研究為孟魯司特鈉關(guān)鍵手性中間體(S)-2制備提供了一種高效低成本的綠色生物合成方法，具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Asymmetric reduction of methyl 2-[3-[3-(2-(7-chloro-2-quinolinyl) ethenylphenyl]-3-oxopropyl]benzoate by alcohol dehydrogenase

YU Daofu1，2,ZHANG Xiaojian1，2,HUANG Jianfeng1，2,CHEN Xiang1，2,LIU Zhiqiang1，2
(1.College of Biotechnology and Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China；
2.Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province，Hangzhou 310014，China)

Montelukast sodium is one of the main anti-asthmatic drugs.Methyl[E]-2-[3-(S)-[3-[2-(7-chloro-2-quinolinyl)ethenyl]phenyl]-3-hydroxypropyl]benzoate is the key chiral block for the synthesis of montelukast sodium.The alcohol dehydrogenase screened previously in our lab was used for the asymmetric reduction of methyl 2-[3-[3-(2-(7-chloro-2-quinolinyl)ethenyl] phenyl]-3-oxopropyl)benzoate to produce methyl[E]-2-[3-(S)-[3-[2-(7-chloro-2-quinolinyl) ethenyl]phenyl]-3-hydroxypropyl]benzoate.Under the conditions of coenzyme 0.1 g/L,substrate concentration 219.3 mmol/L,cell loading 30 g/L,pH 7.5 and 45℃,the substrate was converted completely in 7 h with the space time yield of 31.2 mmol/(L·h),and e.e.of 99.9%.The fed-batch asymmetric reduction mode increased the space time yield to 43.7 mmol/(L·h),with a final conversion of 100%,and e.e.value of 99.9%.

alcohol dehydrogenase;montelukast sodium;asymmetric reduction

Q599

A

1674-2214（2016）04-0220-06

2016-05-12

余道福（1990—），男，浙江杭州人，碩士，研究方向?yàn)樯锩复呋?，E-mail：1007022623@qq.com.通信作者：柳志強(qiáng)教授，E-mail:microliu@zjut.edu.cn.