高效液相色譜法測定殼寡糖的含量

蔣慧，李恒，張瀾，李妍，李悅明，徐建春，辛躍強

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250000；2.日照市食品藥品檢驗檢測中心，山東日照276800；3.青島市黃島區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，山東青島266400；4.青島科海生物有限公司，山東青島266400）

高效液相色譜法測定殼寡糖的含量

蔣慧1，李恒1，張瀾2，李妍3，李悅明4，徐建春4，辛躍強4

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250000；2.日照市食品藥品檢驗檢測中心，山東日照276800；3.青島市黃島區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，山東青島266400；4.青島科海生物有限公司，山東青島266400）

探討高效液相色譜（HPLC）法在殼寡糖含量測定中的應用。選用Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）測定殼寡糖樣品中2～6個聚合度殼寡糖的含量。檢測器為示差折光檢測器，流動相V（乙腈）∶V（水）=75∶25，流速1.2 mL/min，柱溫30℃。液相檢測殼寡糖的回收率為96.9%～98.2%，相對標準偏差為0.1%～1.0%。結果表明：該定量分析方法可快速、高效地測定殼寡糖樣品中2～6個聚合度殼寡糖的含量。

殼寡糖；高效液相色譜法；含量；測定

隨著生活水平的提高，肥胖、高血壓、膽固醇等疾病的發(fā)病率也隨之升高，食品安全和健康問題日益成為人們關注的焦點。殼寡糖（Chitosan oligosaccharide，簡稱COS）是以殼聚糖為原料經(jīng)酶解反應得到的，它是以2～10個乙酰氨基葡萄糖經(jīng)β-1,4糖苷鍵連接而成的水溶性好、易被人體吸收且生物活性高的低分子量寡聚糖[1-6]。殼寡糖是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中唯一帶正電荷、呈堿性的水溶性多糖，具有優(yōu)越的生物活性[7-9]。殼寡糖不僅保留了殼聚糖大分子所具有的功能性質，如降血壓、降低膽固醇、防治糖尿病、治療燒燙傷、排除體內(nèi)有毒有害物質、強化肝臟機能等[10-13]，同時不同分子量的殼寡糖還具有殼聚糖所不具備的獨特的生理功能[14]，特別是6個聚合度的殼寡糖[15]，如調節(jié)腸道菌群，在人體腸道內(nèi)增殖雙歧桿菌，抑制大腸桿菌的生長[16]；抑制腫瘤細胞的生長，促進脾臟抗體生成[17-19]；強化肝臟功能，防止胃潰瘍[20]；在微酸性環(huán)境中具有較強的抗菌作用和顯著的保溫吸濕能力[21-22]；作為營養(yǎng)強化劑的載體等作用[23]。因此，殼寡糖在保健品、生物醫(yī)藥等方面具有極為廣泛的應用范圍和發(fā)展前途。

目前，殼寡糖含量的檢測方法一般采用化學試劑法[24-26]，化學試劑法的原理是將高分子聚糖在強酸的條件下分解成單糖N-乙酰氨基葡萄糖，然后通過3,5-二硝基水楊酸（DNS）測定還原糖的方法測定單糖含量，從而計算出高分子聚糖的含量[27-28]。該方法檢測成本低、易操作，但檢測結果無法確定聚合度在2～10個之間的殼寡糖的含量。筆者探討了高效液相色譜法在殼寡糖含量測定中的應用，期望通過運用高相液相色譜法尋找快速、精密度高和重現(xiàn)性好的殼寡糖含量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器與設備

LC-1200高效液相色譜儀，含RID-20A示差折光檢測器、LC-20AT二元泵、控制器、CTO-20A柱溫箱，日本島津公司；AS 20600B超聲清洗儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.1.2 試劑與藥品

殼寡糖標準物質殼二糖（≥97%）、殼三糖（≥98%）、殼四糖（≥98%）、殼五糖（≥97%）、殼六糖（≥96%），購自青島博智匯力生物科技有限公司；殼寡糖樣品，青島科海生物科技有限公司提供；HPLC級乙腈，美國天地試劑（TEDIA，USA）；超純水，娃哈哈集團瓶裝用水。

1.1.3 標準溶液的配制

將標準物質殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖、殼六糖分別配成質量分數(shù)為1.5%，2.5%，5.0%，7.5%，10%的標準溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，4℃冷藏備用。

1.1.4 殼寡糖樣品溶液的配制

將殼寡糖樣品配制成適宜濃度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，4℃冷藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件：

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：V（乙腈）∶V（水）=75∶25；流動相流速：0.6～1.2 mL/min；柱溫：26～34℃；進樣體積：20 μL。

1.2.2 試驗過程

配制流動相乙腈-水的混合溶液，分別設置0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL/min五個流動相流速以及分別選取26，28，30，32，34℃五個柱溫進行殼寡糖高效液相色譜分析。

將1.1.3和1.1.4步驟中配制好的標準溶液和殼寡糖樣品溶液分別注入高效液相色譜儀中進行色譜分離，記錄不同條件下殼寡糖標準物質和樣品的出峰保留時間和峰面積。

2 結果與討論

2.1 分析條件的確定

由于乙腈的洗脫能力強，基線噪音低和分離度高，在多種糖的分離中應用廣泛，選擇乙腈-水作為流動相并使用氨基柱進行殼寡糖的分離[29-32]。經(jīng)過比較不同柱溫分析殼寡糖樣品的結果，最終確定柱溫為30℃，此溫度下各聚合度殼寡糖的出峰時間相隔適宜，有效將2～6個聚合度殼寡糖分離開的同時，所用時間最短。經(jīng)過比較不同流動相流速分析殼寡糖樣品的結果，最終確定流速為1.2 mL/min，此流速下色譜圖顯示各峰無拖尾現(xiàn)象，各峰分離效果最好，同時縮短了檢測時間。因此，確定的分析條件為：V（乙腈）∶V（水）=75∶25；柱溫30℃；流動相流速1.2 mL/min。

2.2 精密度試驗

對殼寡糖樣品溶液進行定性定量分析。取殼寡糖樣品溶液重復測定7次，結果見表1。由表1看出：相對標準偏差（RSD）為0.1%～1.0%，都小于2%，精密度高，說明這種分析方法是可靠的。

2.3 方法回收率

取同一殼寡糖樣品溶液四份，其中一份作本底，另三份添加一定量的不同聚合度、不同濃度的殼寡糖標準溶液后測定各聚合度殼寡糖的峰面積，每份樣品進行平行測定3次，考察方法的回收率，結果見表2。從表2看出：殼寡糖的回收率在96.9%～98.2%之間，說明該方法準確度較高、重現(xiàn)性好。

表1 精密度試驗結果（n=7）

表2 殼寡糖的回收率試驗結果

2.4 樣品中殼寡糖的檢測

圖1～5為殼二糖至殼六糖標準物質的液相色譜圖，其中殼二糖標準物質的出峰保留時間在8.78 min，峰面積為5 618 366；殼三糖標準物質的出峰保留時間在12.77 min，峰面積為1 774 508；殼四糖標準物質的出峰保留時間在18.72 min，峰面積為8 856 095；殼五糖標準物質的出峰保留時間在27.52 min，峰面積為10 096 350；殼六糖標準物質的出峰保留時間在39.39 min，峰面積為6 698 981。

殼寡糖樣品液相色譜圖如圖6所示，對應各聚合度殼寡糖標準物質的出峰保留時間，對樣品出峰進行歸屬，并記錄各聚合度殼寡糖的峰面積，結果如表3所示。

根據(jù)殼寡糖標準物質的濃度和峰面積的比值與樣品中相應聚合度殼寡糖的濃度和峰面積的比值相等的關系，便可求得樣品中各聚合度殼寡糖的濃度，各聚合度殼寡糖濃度之和與樣品的配制濃度的比值，即為2～6個聚合度殼寡糖的含量。如表3所示的殼寡糖樣品中殼二糖的質量分數(shù)為1%，殼三糖的質量分數(shù)為11%，殼四糖的質量分數(shù)為7%，殼五糖的質量分數(shù)為5.6%，殼六糖的質量分數(shù)為3.5%，因此樣品中2～6個聚合度殼寡糖的總質量分數(shù)為28.1%，殼寡糖樣品配制的質量分數(shù)為31%，由此算得2～6個聚合度殼寡糖的質量分數(shù)為90.6%，符合國家2014年頒布的《關于批準殼寡糖等6種新食品原料的公告》中殼寡糖含量≥80%的要求。

表3 殼寡糖樣品中各聚合度殼寡糖的峰面積

3 結論

采用高相液相色譜中示差折光檢測器，使用Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），V（乙腈）∶V（水）=75∶25作為流動相，流速為1.2 mL/min，柱溫30℃，可較好地完成對殼寡糖含量的檢測。經(jīng)過多次試驗證明，該方法具有處理簡單、靈敏度高、分析速度快和結果準確等優(yōu)點，對測定殼寡糖樣品中2～6個聚合度殼寡糖的含量具有重要意義。

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（責任編輯：朱小惠）

Determination of chitosan oligosaccharide by high performance liquid chromatography

JIANG Hui1,LI Heng1,ZHANG Lan2,LI Yan3,LI Yueming4,XU Jianchun4,XIN Yueqiang4
(1.Shandong Provincial Food and Drug Inspection and Research Institute,Jinan 250000,China;2.Rizhao Center for Food and Drug Control,Rizhao 276800,China;3.Huangdao Drug Supervision and Administration Bureau, Qingdao 266400,China;4.Qingdao Kehai Biochemistry Co.,Ltd.,Qingdao 266400,China)

Chitosan oligosaccharides containing 2-6 degree of polymerization were analyzed by high performance liquid chromatography with a refraction index detector.Samples(20 μL)were separated in a Shodex Asahipak NH2P-50 4E column(4.6 mm×250 mm,5 μm).Eluent V (acetonitrile)∶V(water）=75∶25 was used as mobile phase and the flow rate was set at 1.2 mL/min at 30℃.The recovery of chitosan oligosaccharides were 96.9%-98.2%and the relative standard deviation were 0.1%-1.0%.The results indicated that it was a rapid and effective method to determine the content of chitosan oligosaccharides.

chitosan oligosaccharide;high performance liquid chromatography;content;detection

O657

A

1674-2214（2016）04-0232-05

2016-07-02

蔣慧（1964—），女，山東濱州人，副主任藥師，主要從事食品、藥品檢驗和產(chǎn)品質量控制工作，E-mail：xubz19@163.com.