中華鱉弗氏檸檬酸桿菌的鑒定及病理組織觀察

黃莉萍，安莉麗，李 芳，楊成年，李 虹，呂光俊，向 梟，孫翰昌，翟旭亮，*，朱成科，*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460； 2.重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，重慶 400020； 3.重慶文理學(xué)院 林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 402160)

中華鱉(Pelodiscussinensis)，俗名團(tuán)魚、甲魚，隸屬脊索動(dòng)物門、爬行綱、龜鱉目、鱉科、鱉屬，主要分布于我國(guó)的長(zhǎng)江、黃河流域和華南地區(qū)[1]。中華鱉肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有高蛋白低脂肪的特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者喜愛[2]。據(jù)2018《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》，全國(guó)鱉的養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)32.2萬t[3]，市場(chǎng)需求旺盛。近年來，主要養(yǎng)殖方式有溫室養(yǎng)殖、兩段式養(yǎng)殖、純外塘養(yǎng)殖[4]和仿生態(tài)養(yǎng)殖，其中仿生態(tài)養(yǎng)殖中華鱉外觀良好、體質(zhì)健壯、活動(dòng)力強(qiáng)、鮮味氨基酸含量豐富、口感較好，且經(jīng)濟(jì)效益明顯優(yōu)于前幾種養(yǎng)殖模式[5]。但由于仿生態(tài)養(yǎng)殖的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，易受環(huán)境影響，養(yǎng)殖條件難以控制[6]，易暴發(fā)各類病害，尤其是細(xì)菌性疾病，如已報(bào)道的紅脖子病、紅底板病、白底板病、穿孔病、腐皮病等[7]，給仿生態(tài)養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失。

2018年5月，重慶市永川區(qū)某仿生態(tài)養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)中華鱉大量死亡現(xiàn)象，主要癥狀表現(xiàn)為病鱉四肢軟弱無力，反應(yīng)遲鈍；病鱉體表泛紅，底板有出血性紅斑；腮腺充血發(fā)炎，腸道糜爛性出血，患病率較高，死亡率達(dá)70%以上。為查明病因，本研究以癥狀明顯的瀕死中華鱉為材料，對(duì)其進(jìn)行病原菌分離鑒定和病理組織切片觀察，以期為該病的臨床防治和診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)鱉

患病中華鱉于2018年5月采自重慶市永川區(qū)某仿生態(tài)鱉養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量約(1 500±100)g，具有明顯的患病癥狀。健康中華鱉購(gòu)自重慶市榮昌區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)，組織切片對(duì)照試驗(yàn)鱉體質(zhì)量(1 000±100)g，共3只；人工感染試驗(yàn)的鱉體長(zhǎng)(10±2)mm，體質(zhì)量(30±5)g，共180只，觀察一周確認(rèn)健康無異常后用于感染試驗(yàn)。

1.1.2 試驗(yàn)主要試劑與儀器

試劑：普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(TaKaRa公司)、PCR反應(yīng)體系(TaKaRa公司)、pMD-19T(TaKaRa公司)、大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)。儀器：恒溫?fù)u床(江蘇省金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠)、生化培養(yǎng)箱(寧波新芝生物科技股份有限公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、切片機(jī)(德國(guó)萊卡RM2235)、光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯BX51TF)等。

1.2 病原菌分離及純化

選擇具有典型患病癥狀的瀕死中華鱉于超凈工作臺(tái)中，75%乙醇擦拭病鱉體表進(jìn)行消毒。解剖后用接種環(huán)蘸取患病鱉各臟器組織于普通瓊脂培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并選取其中的優(yōu)勢(shì)單菌落進(jìn)行重復(fù)劃線純化，4 ℃保存待用。

1.3 人工感染試驗(yàn)

將分離菌株劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，用0.65%的生理鹽水洗脫并離心收集菌體，參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度，健康鱉分成4組試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組30只，試驗(yàn)組分別用濃度為1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105CFU·mL-1的菌懸液注射感染[8]。注射方式為腿部肌肉注射，每只鱉注射菌液0.1 mL，對(duì)照組每只注射0.1 mL 0.65%的生理鹽水。水溫28～30 ℃，每天正常通氣換水，投喂深圳新光飼料有限公司的中華鱉配合飼料，日投餌率為3%，觀察接種后鱉的活動(dòng)情況并記錄其發(fā)病與死亡情況。對(duì)人工感染后具有自然病狀的瀕死中華鱉再次進(jìn)行病原菌分離鑒定。

1.4 病原菌生理生化鑒定

參照ATB系統(tǒng)細(xì)菌自動(dòng)檢定儀(法國(guó)Bio-merieux公司)、API 20E試劑盒使用說明進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果參考文獻(xiàn)[9]和[10]的標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)菌種類。

1.5 16S rRNA和gyrB序列的擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用煮沸法提取病原菌總DNA[11]。16S rRNA基因擴(kuò)增采用通用引物F-16S/R-16S，F(xiàn)-16S：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R-16S：5′-TGCGGCTGGATCACCTCCTT-3′[12]；gyrB基因擴(kuò)增采用通用引物F-gyrB/R-gyrB，F(xiàn)-gyrB：5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′；R-gyrB：5′-GACGAGTACAACCCGGACAA-3′[13]。PCR用50 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer(含Mg2+)5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，rTaq酶(5 U·μL-1)0.4 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，ddH2O 39.6 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，16S rRNA基因72 ℃延伸50 s，31個(gè)循環(huán)，gyrB基因30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min[14]。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用TaKaRa公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化，pMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆送華大基因公司測(cè)序。

1.6 組織病理觀察

取自然患病瀕死中華鱉和健康中華鱉的肝臟、脾臟、腎臟、胰臟和前腸組織，用10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木精—伊紅(HE)染色，中性樹脂膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察[15]。

1.7 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(National Committee For Clinical Laboratory Standards，NCCLS)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)K-B法進(jìn)行[16]。將分離純化的菌株挑入普通液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 h后，將菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，等距貼上藥敏紙片[17]。28 ℃培養(yǎng)24 h，依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，判定病原菌對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)病情況

患病中華鱉主要表現(xiàn)為：長(zhǎng)時(shí)間停留在水面，伸長(zhǎng)脖子，四肢無力，反應(yīng)遲鈍，極易捕捉；病鱉體表泛紅，背板有大量淤泥沉積，底板有出血性紅斑；患病死亡的鱉頭頸腫脹發(fā)軟、口鼻出血、四肢伸開、生殖器外突。解剖患病瀕死中華鱉發(fā)現(xiàn)腮腺出血糜爛，有纖毛狀凸起，呈潰瘍性病灶；咽喉部糜爛出血嚴(yán)重；有大量腹水；肝臟腫脹充血；腸道彈性降低，內(nèi)壁紅腫、充血，呈糜爛狀(圖1)。

2.2 致病菌的分離與形態(tài)學(xué)觀察

僅從瀕死病鱉腸道分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為PS01。菌株P(guān)S01在28 ℃普通固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，形成直徑1.0～1.5 mm的圓形菌落，經(jīng)革蘭氏染色呈陰性，細(xì)菌形態(tài)為短桿菌，兩端鈍圓或平直，多數(shù)單個(gè)排列，大小為3～6 μm，見圖2。

2.3 人工感染試驗(yàn)

對(duì)健康鱉進(jìn)行腿部肌肉注射分離菌株，感染結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，對(duì)照組中華鱉在7 d內(nèi)無異常。1.0×108CFU·mL-1試驗(yàn)組中華鱉2 d內(nèi)全部死亡；1.0×107CFU·mL-1試驗(yàn)組中華鱉7 d內(nèi)死亡率為73.3%；1.0×106CFU·mL-1試驗(yàn)組中華鱉7 d內(nèi)死亡率為26.7%；1.0×105CFU·mL-1試驗(yàn)組中華鱉7 d內(nèi)死亡率為6.7%；根據(jù)孫氏寇氏改良法[18]得到分離菌株對(duì)30 g左右的中華鱉半數(shù)致死濃度為9.3×104CFU·g-1。人工感染的中華鱉四肢無力，體表泛紅，底板有出血性紅斑，解剖發(fā)現(xiàn)大量腹水同時(shí)腸道出血，腮腺輕度發(fā)炎，其癥狀與自然發(fā)病癥狀基本一致。

表1 人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 病原菌生理生化鑒定

菌株P(guān)S01能運(yùn)動(dòng)，不能產(chǎn)生H2S；MR試驗(yàn)和和七葉靈水解陽(yáng)性，VP試驗(yàn)陰性；賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶、精氨酸雙水解酶陰性；能利用D-甘露醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖、鼠李糖和半乳糖，不能利用D-葡萄糖、肌醇、衛(wèi)矛醇、棉籽糖、木糖，其生理生化特性見表2。經(jīng)ATB Expression生化自動(dòng)鑒定儀(IS32 STREP)軟件的分析結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)[9]和[10]的標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)菌種類可初步判定分離菌株P(guān)S01為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)。

表2 PS01菌株的生化鑒定結(jié)果

A，患病中華鱉底板；B，患病中華鱉腮腺; C，患病中華鱉腸道。A，Shell of diseased P. sinensis; B，Parotid gland of diseased P. sinensis; C，Intestine of diseased P. sinensis.圖1 患病中華鱉臨床特征Fig.1 Clinical characteristics of diseased P. sinensis

A，PS01普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落形態(tài)；B，分離菌革蘭染色觀察(1 000×)。A，Colony morphology of PS01 common nutrient medium; B，Observation on Gram staining of isolated bacteria (1 000×).圖2 致病菌形態(tài)及革蘭氏染色Fig.2 Morphology of pathogenic bacteria and Gram straining

2.5 16S rRNA和gyrB序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以PS01的菌液DNA為模板，分別用16S rRNA和gyrB基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期可得到長(zhǎng)度大約為1 500和1 200 bp的條帶，見圖3，與預(yù)期結(jié)果相一致。對(duì)目的條帶進(jìn)行割膠回收、純化、與pMD-19T vector載體連接、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)S01所獲得的16S rRNA和gyrB基因部分序列片段大小分別為1 494和1 087 bp。

菌株P(guān)S01 16S rRNA基因與GenBank上登錄的弗氏檸檬酸桿菌(登錄號(hào)：KY352232)的相似性高達(dá)99.7%。菌株P(guān)S01gyrB基因與GenBank上登錄的弗氏檸檬酸桿菌(登錄號(hào)：JX001436)的相似性高達(dá)98.7%。分別以菌株P(guān)S01的16S rRNA和gyrB基因與GenBank中已登錄的其他檸檬酸桿菌屬進(jìn)行比對(duì)，并以遲緩愛德華菌(Edwardsiellatarda)為外類群，用MEGA 5.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，菌株P(guān)S01均與弗氏檸檬酸桿菌聚為一支，且支持率均高達(dá)99%，如圖4、圖5，可判定菌株P(guān)S01為弗氏檸檬酸桿菌。

圖5 菌株P(guān)S01 gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on gyrB gene sequences

圖4 菌株P(guān)S01 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

M，DL2000 DNA marker；1，16S rRNA；2，gyrB；3，陰性對(duì)照。M，DL2000 DNA marker; 1，16S rRNA; 2，gyrB; 3，Negative control.圖3 病原菌株P(guān)S01的16S rRNA和gyrB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA and gyrB gene in strain PS01

2.6 病理切片觀察

患病中華鱉主要受損器官為肝臟、脾臟、腎臟、胰臟和腸道。觀察比較健康中華鱉與患病中華鱉的受損器官病理組織切片差異。

健康鱉的肝細(xì)胞呈多角形，以中央靜脈為中心，放射狀排列形成肝索。肝索互相吻合成網(wǎng)狀，網(wǎng)眼內(nèi)為血液流經(jīng)的地方，是肝小葉內(nèi)的毛細(xì)血管，稱為肝血竇(圖6-A)?；疾△M肝臟類纖維化變性，毛細(xì)血管破裂，肝血竇淤血嚴(yán)重，蘇木精-伊紅(HE)染色下深紅色的條狀肝血竇與淡紅色的變性壞死肝細(xì)胞相間存在。肝組織基本結(jié)構(gòu)模糊，表現(xiàn)嚴(yán)重血腫，肝細(xì)胞彼此之間界限不明，胞體腫漲，呈顆粒變性，更嚴(yán)重的則為空泡變性，胞內(nèi)有大小不等的空泡，胞核腫大，空泡化(圖6-a)。

健康鱉脾實(shí)質(zhì)由紅髓、白髓和邊緣區(qū)三部分組成，紅髓與白髓區(qū)分明顯，實(shí)質(zhì)細(xì)胞豐富，正常，組織內(nèi)還有橢圓體和零散的黑色素巨噬細(xì)胞，橢圓體外圍鞘室內(nèi)含有紅細(xì)胞及巨噬細(xì)胞(圖6-B)?；疾△M脾臟橢圓體消失，紅髓、白髓區(qū)分不明顯，紅細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合分布，黑色素巨噬細(xì)胞有增多趨勢(shì)(圖6-b)。

健康鱉腎臟顏色鮮紅，腎血管球、腎小囊腔體積正常。腎實(shí)質(zhì)包括皮質(zhì)和髓質(zhì)，腎皮質(zhì)包括腎小體、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管等結(jié)構(gòu)(圖6-C)。正常鱉腎小管之間間隙明顯，而患病鱉腎小管上皮細(xì)胞腫脹，使管間間隙變小，幾乎消失，HE染色變淺。部分腎小球萎縮，腎小囊腔相對(duì)增大(圖6-c)。

健康鱉胰腺表面的被膜由外層的致密結(jié)締組織和內(nèi)層的疏松結(jié)締組織構(gòu)成，疏松結(jié)締組織深入胰實(shí)質(zhì)內(nèi)，將實(shí)質(zhì)分隔成很多小葉，小葉間結(jié)締組織少，使小葉分隔并不明顯，其內(nèi)有小葉間導(dǎo)管(圖6-D)?；疾△M胰腺組織之間間隙增大，空白區(qū)域增多趨勢(shì)明顯，有輕度腫脹。胰腺細(xì)胞胞核腫大，部分呈空泡狀，HE染色變淺(圖6-d)。

A，健康中華鱉肝；B，健康中華鱉脾；C，健康中華鱉腎；D，健康中華鱉胰；E、F，健康中華鱉腸；a，患病中華鱉肝；b，患病中華鱉脾；c，患病中華鱉腎；d，患病中華鱉胰；e、f，患病中華鱉腸。H，肝細(xì)胞；HS，肝血竇；L，淋巴細(xì)胞；E，橢圓體；M，黑色素細(xì)胞；RBC，紅細(xì)胞；WP，白髓；RP，紅髓；DT，遠(yuǎn)曲小管；TG，腎小管間隙；PT，近曲小管；PC，泡心細(xì)胞；Pg，胰腺組織間隙；S，漿膜；EC，上皮細(xì)胞；GC，杯狀細(xì)胞。A，Liver of healthy P. sinensis; B，Spleen of healthy P. sinensis; C，Kidney of healthy P. sinensis; D，Pancreas of healthy P. sinensis; E，F(xiàn)，Intestinal of healthy P. sinensis; a，Liver of diseased P. sinensis; b，Spleen of diseased P. sinensis; c，Kidney of diseased P. sinensis; d，Pancreas of diseased P. sinensis; e，f，Intestinal of diseased P. sinensis. H，Hepatocyte; HS，Hepatic sinusoid; L，Lymphocyte; E，Ellipsoid; M，Melancyte; RBC，Erythrocyte; WP，White pulp; RP，Red pulp; DT，Distal convoluted tubule; TG，Tubular gap; PT，Proximal convoluted tubule; PC，Pancreatic cells; Pg，Pancreatic gap; S，Serosa; EC，Epithelial cell; GC，Goblet cell.圖6 健康中華鱉和患病中華鱉內(nèi)臟病理組織學(xué)特征Fig.6 Pathological and histological features of viscus in healthy P. sinensis and sick P. sinensis

健康鱉腸壁分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜。由黏膜的上皮細(xì)胞和固有膜共同形成許多腸絨毛，黏膜下層由結(jié)締組織構(gòu)成，深入上皮形成褶皺。肌層由內(nèi)環(huán)外縱兩層平滑肌構(gòu)成，肌間有結(jié)締組織和神經(jīng)叢。外膜為漿膜，由單層扁平細(xì)胞構(gòu)成(圖6-E、F)?；疾△M前腸固有層的毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，黏膜下層和肌層的毛細(xì)血管有不同程度擴(kuò)張充血，漿膜脫落，黏膜層潰爛嚴(yán)重，腸壁結(jié)構(gòu)被破壞，腸腔內(nèi)有大量由脫落的腸黏膜碎片和因毛細(xì)血管破裂溢入管腔的紅細(xì)胞及其碎片。腸絨毛絕大部分壞死脫落，僅存的一些結(jié)構(gòu)也不完整，毛細(xì)血管破裂，紅細(xì)胞大量溢出，HE染色變深。固有層充血嚴(yán)重，杯狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞大部分壞死凋亡(圖6-e、f)。

2.7 藥敏特性

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了菌株P(guān)S01對(duì)氟苯尼考等39種抗生素的抗性(表3)。其中包括麥迪霉素等三種大環(huán)內(nèi)酯類，頭孢哌酮等9種β-內(nèi)酰胺類，多西四環(huán)素等3種四環(huán)素，呋喃妥因等2種硝基呋喃類，復(fù)方新諾明等2種磺胺類，阿米卡星等6種氨基糖苷類，恩諾沙星等5種喹諾酮類，氟苯尼考等兩種氯霉素類以及林可霉素，多黏霉素等6種其他類抗生素。結(jié)果表明，分離菌株對(duì)多西環(huán)素等18種抗菌藥高度敏感，對(duì)氟苯尼考等3種抗菌藥中度敏感，對(duì)復(fù)方新諾明等18種抗菌藥表現(xiàn)為耐藥。

表3 PS01菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究從患病中華鱉腸道中分離得到一株致病菌PS01，人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果符合科赫法則，確定菌株P(guān)S01為中華鱉的致病菌。經(jīng)生理生化鑒定初步判定菌株P(guān)S01為弗氏檸檬酸桿菌，為進(jìn)一步確定其準(zhǔn)確的分類地位，本研究進(jìn)行了16S rRNA和gyrB基因序列分析。16S rRNA基因分子量大小適中便于序列分析，但是其對(duì)同屬近緣種的分辨率不足。而gyrB基因較16S rRNA具有更高的替換率，適合親緣關(guān)系較近的物種區(qū)別與鑒定[19]。因此，為了更準(zhǔn)確地確定分離菌株的分類，本研究進(jìn)行了gyrB基因序列分析。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rRNA和gyrB序列分析，綜合判定分離菌株P(guān)S01為弗氏檸檬酸桿菌，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)。

弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)隸屬于變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科、檸檬酸桿菌(Citrobacter)屬，且為檸檬酸桿菌屬的模式種。弗氏檸檬酸桿菌的致病性報(bào)道最先出現(xiàn)在魚類，已報(bào)道弗氏檸檬酸桿菌對(duì)羅非魚(Oreochromsmossambcus)[20-21]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[22]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[19]、花鰻鱺(Anguillamarmorata)[23]、棘胸蛙(Quasipaaspinosa)[24]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[25-26]等水生動(dòng)物有較強(qiáng)的致病性。近年來，在竹鼠(Rhizomyssinensis)[13]、小鼠(Musmusculus)[22]、牛(Bostaurus)、人(Homosapiens)[27]中都相繼發(fā)現(xiàn)感染弗氏檸檬酸桿菌的患病實(shí)例，且該菌有毒力增強(qiáng)、耐藥性顯著的趨勢(shì)。結(jié)合孫氏寇氏改良法確定分離菌株P(guān)S01對(duì)中華鱉的LD50為：9.3×104CFU·g-1，其致病性較高，能夠引起動(dòng)物的大量死亡，與文獻(xiàn)[28-29]的報(bào)道相一致。已有報(bào)道弗氏檸檬酸感染中華鱉[30-32]，感染癥狀與本研究中描述的基本一致，但內(nèi)臟病變更加嚴(yán)重。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，中華鱉肝臟、脾臟、腎臟、胰臟和前腸組織都有明顯病變。肝臟的病變情況與中華鱉非寄生性肝病的報(bào)道[33]癥狀相似，肝臟因細(xì)胞變性和腫脹，擠壓內(nèi)臟器官，出現(xiàn)血腫癥狀，繼續(xù)惡化則可發(fā)展為肝硬化、肝性水腫。脾臟、腎臟和胰臟病變情況與已報(bào)道的其他細(xì)菌感染中華鱉[34-35]的癥狀存在差異，本研究未見細(xì)胞壞死脫落，但初期癥狀相似，基本都有細(xì)胞空泡變性等。腸道病變最為嚴(yán)重，漿膜脫落，黏膜層嚴(yán)重潰爛，腸絨毛絕大部分壞死脫落。病原從中華鱉的腸道中分離，同時(shí)腸道也是感染最為嚴(yán)重的組織，可以推測(cè)腸道是該菌的主要靶器官。弗氏檸檬酸桿菌主要引起動(dòng)物的腸道感染，但是近年來，臨床上發(fā)現(xiàn)毒力較強(qiáng)的菌株可以穿過腸黏膜，進(jìn)而在全身擴(kuò)散傳播，引起機(jī)體系統(tǒng)感染[27]，這可能是造成肝臟、脾臟等器官同時(shí)病變的原因之一。此外，春季隨著水溫升高，腸道內(nèi)的病原菌開始大量繁殖，分泌產(chǎn)生溶血性、腸毒性和細(xì)胞毒性的外毒素，也可進(jìn)人腸道微血管，隨血液循環(huán)到全身各內(nèi)臟組織，使各內(nèi)臟發(fā)生變性、壞死和發(fā)炎。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株對(duì)多西環(huán)素、四環(huán)素、恩諾沙星等18種抗菌藥高度敏感，對(duì)先鋒霉素、氟苯尼考、新霉素3種抗菌藥中度敏感。對(duì)桿菌肽、吡哌酸、復(fù)方新諾明等18種抗菌藥表現(xiàn)為耐藥。與花鰻鱺[27]體內(nèi)分離得到的菌株抗藥性存在部分差異，可能是由于菌株來源、地理環(huán)境以及用藥情況等不同造成的。因此，在養(yǎng)殖過程中應(yīng)結(jié)合無公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則(NY 5071—2002)，有針對(duì)性地嚴(yán)謹(jǐn)選擇敏感性藥物，避免病原菌產(chǎn)生抗藥性。