滴滴涕單克隆抗體的制備及其評價

楊星星，畢思遠，朱 海，顧大勇

(1.廣東省深圳市易瑞生物技術有限公司，廣東 深圳 518102；2.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東 深圳 518045 )

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滴滴涕單克隆抗體的制備及其評價

楊星星1，畢思遠1，朱 海1，顧大勇2*

(1.廣東省深圳市易瑞生物技術有限公司，廣東 深圳 518102；2.深圳市檢驗檢疫科學研究院，廣東 深圳 518045 )

以滴滴涕(DDT)的特征部分為基礎設計并合成了半抗原4-{4-[2,2,2-三氯-1-(4-氯-苯基)-乙基]-苯基}-丁酸(DDT-H1)、4-[4-(2,2,2-三氯-1-對甲苯基-乙基)-苯基]-丁酸(DDT-H2)，并采用活潑酯法制備免疫原 DDT-H1-BSA，以及混合酸酐法制備包被原DDT-H1-OVA、DDT-H2-OVA；用DDT-H1-BSA對小鼠進行免疫，通過細胞融合、篩選、克隆等步驟得到1株能穩(wěn)定分泌DDT農(nóng)藥抗體的單克隆細胞株。細胞株經(jīng)擴大培養(yǎng)后，注射小鼠體內產(chǎn)生腹水，并將其用辛酸-硫酸銨和protein A柱子純化出單克隆抗體。其分泌的單克隆抗體免疫球蛋白亞類為IgG1，單抗腹水的效價為1.68×105，親和力Ka為5.238×1011L·mol-1，與其它幾種代謝物有一定的交叉反應。在此基礎上，利用獲得的單抗研究建立DDT的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附檢測法(icELISA)。結果表明，所建立的間接競爭 ELISA 方法的線性范圍(IC20～IC80)為 6.6～521.8 ng/mL，可用于檢測農(nóng)副產(chǎn)品、環(huán)境中殘留的DDT及其代謝物。

滴滴涕；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫檢測；代謝物

有機氯農(nóng)藥滴滴涕(DDT)作為廣譜殺蟲劑從20世紀50年代開始在全世界范圍內廣泛使用。這一類含氯原子的有機合成殺蟲劑，具有極高的脂溶性和穩(wěn)定性，可在生物體內富集很高的濃度，且在環(huán)境中降解緩慢,其活性成分為p,p′-DDT，屬持久性有機污染物(POPs)[1-2]。DDT在沉積物中的兩種主要分解物為2，2-雙(4-氯苯基)-1，1-二氯乙烯(DDE)和2，2-雙(4-氯苯基)-1，1-二氯乙烷(DDD)，而DDD 本身也用作殺蟲劑。DDT在動物組織內可以緩慢降解為2，2-雙(4-氯苯基)乙酸(DDA)，但是DDA本身并不在體內積累，而是作為人或動物與DDT暴露接觸的指標[3]。由于這些代謝物具有較高的親脂性和生物富集作用，易在動物脂肪中積累，造成長期毒性[4-6]。此外，DDT還具有潛在的基因毒性、內分泌干擾作用和致癌性，可能造成包括糖尿病在內的多種疾病[7-10]。盡管從2004年起，DDT已被列為違禁化學物，但目前仍有25個國家將其作為控制瘧疾的藥物繼續(xù)使用，其對生態(tài)環(huán)境和人體健康存在的風險使人們對DDT及其代謝物的殘留劑量和分布日益關注。

目前國內外對DDT及其代謝物殘留的檢測主要依靠儀器分析方法[11-14]，其樣品前處理復雜，所需儀器昂貴，不適于大量樣品的分析檢測。免疫分析方法因操作簡便、快捷、靈敏度高、通量高，已成為食品安全快速篩選檢測的主要方法之一。而國內目前只有針對DDT代謝物DDA的免疫檢測方法[15-16],該方法以DDA作為半抗原，通過碳二亞胺法與載體蛋白偶聯(lián)制備抗原，其制備的抗體只能檢測DDA，不能檢測DDT及其它種類的代謝物。本研究嘗試制備可用于檢測DDT及其多個代謝物的高靈敏度的“寬譜”單克隆抗體，在文獻方法[17]的基礎上對半抗原的結構進行重新設計，并在抗體篩選過程中對包被抗原進行適當挑選，研發(fā)出可用于快速檢測DDT及其關鍵有害代謝物的檢測試劑。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、TLC薄層層析板(GF254)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過氧化物酶(HRP)、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)均為 Sigma 產(chǎn)品，農(nóng)藥標準品(Dr.Ehrenstorfer GmbH，德國)，其它化學試劑均為分析純。

1.1.2 實驗動物 Balb/c小鼠，雌性，7～8周齡，體重20～22 g；普通級雌性昆明鼠(廣東省實驗動物中心)；鼠骨髓瘤細胞SP2/0(深圳市易瑞生物技術有限公司，實驗室保存)。

1.1.3 儀 器 倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Multiskan MK3酶標儀、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；酶標板自動洗滌機(美國Bio-tech公司)；API 3000液質聯(lián)用儀(美國AB公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 半抗原的合成 稱取3.28 g水合氯醛、2 mL氯苯(或者2 mL甲苯)和1.6 g 4-苯基丁酸，置于圓底燒瓶中，水浴加熱攪拌直至所有晶體溶解，將圓底燒瓶置于冰浴下，緩慢加入7 mL 96%的濃硫酸，0 ℃下磁力攪拌，1.5 h后將混合物倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，蒸干有機溶劑后用硅膠柱純化得到終產(chǎn)物DDT-H1(X=Cl)、DDT-H2(X=CH3)，具體合成路線如圖1所示。

圖1 DDT半抗原的合成路線Fig.1 The synthesis scheme of DDT hapten

1.2.2 免疫原與包被原的制備 活潑酯法制備免疫原DDT-H1-BSA：將16.05 mg半抗原DDT-H1(50 mmol)、6.8 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，50 mmol)和12.15 mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，50 mmol)溶于1 mL無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫下攪拌反應18 h，反應液于4 000 r/min離心5 min，吸取上清活化液。再稱量120 mg BSA溶于8 mL碳酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 9.6)中，緩慢分次滴加400 μL活化液，室溫下攪拌反應3 h，再將黃色反應液裝入透析袋，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)透析，每4 h換液1次，換液7～8次，透析后于4 000 r/min離心5 min，上清液于-20 ℃保存。

混合酸酐法制備包被抗原DDT-H1-OVA和DDT-H2-OVA：稱取5.4 mg半抗原DDT-H1(或DDT-H2)約18 mmol溶于200 μL無水DMF中，按順序依次加入4.27 μL(約18 mmol)三正丁胺和2.34 μL(約18 mmol)氯甲酸異丁酯，室溫下攪拌反應1 h。將30 mg OVA 溶于2 mL碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌下緩慢滴加100 μL上一步反應液，室溫下攪拌反應3 h后，透析、離心，于-20 ℃保存。

1.2.3 免疫方案 取7～8周齡Balb/c雌性小鼠，將制備的免疫抗原與弗氏完全佐劑等量混合，完全乳化后，腹部皮下注射，劑量為含DDT-H1-BSA 100 μg，以后每隔3周以同劑量取人工抗原與弗氏不完全佐劑混合乳化后皮下多點注射，免疫4次后測定其效價和抑制率，選取效價和抑制率較高的小鼠進行細胞融合，融合前3 d加倍劑量強化免疫1次。

1.2.4 抗血清效價的測定 利用間接ELISA測定，以不同濃度的DDT-H1-OVA和DDT-H2-OVA分別包被酶標板，小鼠抗血清倍比稀釋。采用方陣滴定法優(yōu)化包被抗原濃度和抗血清工作濃度，選擇吸光值A450 nm約為1.0時的抗原濃度和抗體稀釋度作為工作濃度，采用間接競爭ELISA檢測血清的抑制效果。效價高、抑制效果好的小鼠加強免疫，用于細胞融合。

1.2.5 細胞融合及單克隆抗體制備 將小鼠骨髓瘤SP2/0細胞與脾細胞以5∶1的比例混合，在50%PEG下融合，洗滌、離心后以HAT培養(yǎng)基懸浮，接種于含飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，在37 ℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.6 雜交瘤細胞篩選及亞克隆 融合后6～9 d用HT培養(yǎng)液半量換液1次，在12～14 d后根據(jù)增殖情況改用完全培養(yǎng)液。待細胞貼壁至占板孔1/3時，取上清液，采用間接ELISA和間接競爭ELISA法進行陽性雜交瘤細胞篩選，對陽性并有競爭抑制反應的微孔進行顯微克隆和有限稀釋(亞克隆)。如此反復克隆2～5次，待所克隆的所有孔上清液中抗體陽性率為100%時，挑取單克隆細胞，擴大培養(yǎng)，建株。

1.2.7 腹水制備及抗體亞型鑒定 提前1周注射0.5 mL液體石蠟至Balb/c小鼠腹腔。將細胞(每只小鼠1 mL，含約(1～2)×108個細胞)腹腔注射小鼠腹部10～15 d，待小鼠腹部明顯膨大時采集腹水。ELISA法測定其效價，間接ELISA法鑒定單克隆抗體的免疫球蛋白類型和亞類。

1.2.8 抗體純化 采用飽和硫酸銨沉淀法除去雜蛋白，再經(jīng)過Protein A柱子純化出IgG，并采用考馬斯亮藍G250法檢測蛋白濃度。

圖2 DDT半抗原DDT-H1的質譜圖Fig.2 MS spectrum of DDT-H1 hapten

圖3 DDT半抗原DDT-H2的質譜圖Fig.3 MS spectrum of DDT-H2 hapten

1.2.9 單克隆抗體的親和常數(shù)(Ka)測定 以1 μg/mL DDT-H2-OVA包被，間接ELISA法測定不同濃度的抗DDT單克隆抗體與包被抗原反應的A450 nm，以單克隆抗體濃度為橫坐標，A450 nm值為縱坐標，繪制反應曲線，并在曲線上找到趨于平坦段A450 nm值的50%所對應的單克隆抗體濃度，以其倒數(shù)作為親和常數(shù)Ka。

1.2.10 單克隆抗體間競爭ELISA方法的建立 用棋盤滴定確定最佳包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)，采用常規(guī)ELISA操作步驟，建立穩(wěn)定靈敏的ELISA間接競爭方法。四參數(shù)擬合曲線，計算IC50，定量檢測范圍并確定檢出限。

2 結果與討論

2.1 半抗原的鑒定

上述合成的目標物DDT-H1、DDT-H2經(jīng)液相色譜-質譜(LC-MS)測定，結果如圖2～3所示。從圖2可知，DDT-H1的分子離子峰為m/z406.6[M+H]+，且該峰旁有一系列同位素峰m/z411.6和m/z412.7等；從圖3可知，DDT-H2的分子離子峰為m/z383.1[M-H]-，且該峰旁有一系列同位素峰m/z382.3和387.2等。這些峰均與該化合物的分子量相符。

2.2 人工抗原的鑒定

在波長200～350 nm區(qū)間，對各人工抗原的紫外吸收光譜進行測定，以鑒定半抗原與載體蛋白(BSA或OVA)是否偶聯(lián)成功[18]。圖4A中DDT-H1-BSA的波峰偏移至245～246 nm，波谷偏移至241 nm，OD值均明顯增大；DDT-H1-OVA的波峰波谷均消失，OD變化不大。圖4B中DDT-H2-OVA的波谷稍偏移至254～256 nm，OD值變化不大。以上結果說明3種人工抗原均已成功合成。

Fig.4 UV spectra of DDT-H1-BSA/OVA(A)and DDT-H2-OVA(B)

2.3 抗血清效果分析

血清中抗體的效價越高，說明有效抗體濃度越高，即小鼠的脾臟中激活的 B淋巴細胞越多，越有利于細胞融合。分別用濃度為1 μg/mL的DDT-H1-OVA和 DDT-H2-OVA于4 ℃過夜包板，測試抗血清的競爭變化，兩者的包被濃度皆由棋盤滴定法初步確定，其中小鼠C免疫產(chǎn)生的血清效價最高。采用濃度分別為0，200 ng/mL的DDT-H1-OVA和 DDT-H2-OVA作為抑制藥物，對不同小鼠的血清進行間接競爭ELISA檢測，結果以A450 nm值表示。抑制情況如表1所示，3只小鼠中，當以DDT-H2-OVA作為篩選的包被原，添加200 ng/mL藥物時，小鼠B血清的抑制率高達70.5%，因此選擇小鼠B進行細胞融合。

表1 不同包被原對DDT的抗血清抑制效果

Table 1 Inhibitory effects of DDT antiserum by using different coating antigens

RatserumDilutionratioDDT-H1-OVADDT-H2-OVA0ng/mL200ng/mLInbibition/%0ng/mL200ng/mLInbibition/%A30001152080130510210531480B45001130064642810850320705C55000958079317212160624487

圖5 抗體親和力的測定Fig.5 Determination of affinity of antibody

2.4 單克隆抗體亞類的鑒定與腹水效價測定

經(jīng)過細胞融合、篩選、克隆得到1株穩(wěn)定分泌抗DDT抗體的雜交瘤細胞3C5。以1 μg/mL的DDT-H2-OVA包被酶標板，采用icELISA方法檢測其腹水抗體亞型。檢測結果抗體亞型為IgG1，用icELISA得到腹水的效價為1.68×105。

2.5 單克隆抗體的親和常數(shù)測定

以1 μg/mL的DDT-H2-OVA包被酶標板，icELISA法測定單克隆抗體的親和力，結果如圖5所示，取趨于平坦段即A450 nm為2.4的50%所對應的單克隆抗體濃度，以其倒數(shù)作為親和常數(shù)(Ka)，所獲單克隆抗體的Ka為5.238×1011L·mol-1。

圖6 DDT的 icELISA標準曲線Fig.6 icELISA standard curve of DDT

2.6 抗體靈敏度的測定

采用Originlab 7.5的四參數(shù)擬合模塊對間接競爭ELISA反應曲線進行S擬合，如圖6所示，計算曲線IC50值為61.1 ng/mL，其線性范圍(IC20～IC80)為6.6～521.8 ng/mL。

2.7 抗體特異性的測定

通過表2 的交叉反應率可以看出，該抗體具有較寬的特異性，對p,p′-DDD的交叉反應率高于100%，對o,p′-DDT、p,p′-DDE、o,p′-DDE、o,p′-DDD 4個藥物的交叉反應率在10%～100%之間，而對三氯殺螨醇(Dicofol)的交叉反應率則低于10%。說明氯苯基三氯乙烷部分是其重要的決定簇，直接影響抗體的特異性；三氯殺螨醇則由于在此部分多了1個羥基而導致其與抗體的結合能力大大減弱；此外，另1個苯環(huán)上氯的相對位置也決定了交叉反應率，其中對位的交叉反應率最高，鄰位較低，可能是鄰位結構的藥物的空間位阻較大不能深入抗體的口袋腔中導致不能與之緊密結合。

表2 單克隆抗體與p,p′-DDT類似物的交叉反應率

Table 2 Cross reactivity of polyclonal antibody with analogous compound ofp，p′-DDT

CompoundStructureIC50(μg/L)CR(%)p，p′?DDT611100o，p′?DDT1465417p，p′?DDE801763o，p′?DDE2212276p，p′?DDD4561340o，p′?DDD1389440Dicofol>6000<001

3 結 論

本文篩選出一株細胞株3C5，采用icELISA方法檢測其腹水抗體亞型為IgG1，腹水的效價為1.68×105，單克隆抗體的Ka為5.238×1011L·mol-1。該抗體對p,p′-DDT 的 IC50為61.1 μg/L，檢測的線性范圍(IC20～IC80)為6.6～521.8 ng/mL，與其它幾種代謝物有一定的交叉反應率。實驗制備的單抗完全滿足檢測要求，為研制快速檢測DDT的其它免疫檢測方法奠定了基礎。

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Preparation and Evaluation of DDT Monoclonal Antibody

YANG Xing-xing1,BI Si-yuan1,ZHU Hai1,GU Da-yong2*

(1.Shenzhen Bioeasy Biotechnologies Co.Ltd.，Shenzhen 518102，China；2.Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine，Shenzhen 518045，China)

The haptens 4-{4-[2,2,2-trichloro-1-(4-chloro-phenyl)-ethyl]-phenyl}-butyric acid(DDT-H1)，4-[4-(2,2,2-trichloro-1-p-tolyl-ethyl)-phenyl]-butyric acid(DDT-H2) were designed and synthesized on the basis of characteristics part of DDT,and artificial antigens DDT-H1-BSA(immmue antigen),and DDT-H1-OVA.DDT-H2-OVA(coating antigens)were prepared by coupling with the carrier proteins using active ester method and mixture anhydrides method,respectively.The monoclonal antibody(MAb)against DDT was produced by immunity DDT-H1-BSA,cell fusion,screening,cloning.The MAb was prepared from ascetic fluids of Balb/c,which was purified with saturated ammonium sulfate followed by affinity chromatography on protein A.The monoclonal antibody characterized by IgG1 isotype showed a high cross-reactivity to some metabolites.The enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)titer of ascites was 1.68×105,and the affinity of antibody(Ka)was 5.238×1011L·mol-1.An indirect competitive ELISA was founded base on the monoclonal antibody.The results of indirect competitive ELISA showed that the linear range of the calibration curves ranged from 6.6 ng/mL to 521.8 ng/mL.The method could be applied in the detection of DDT and its metabolites in agriculture products and environment.

dichlorodiphenyltrichloroethane(DDT);monoclonal antibody;ELISA;metabolites

2015-07-27；

2015-09-15

深圳市科技研發(fā)資金項目(CXZZ20130322112111131)；深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金(GCZX20140509163151273)；廣東省特支計劃-科技創(chuàng)業(yè)領軍人才項目(2014TY01R099)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.003

O766.1;R392.11

A

1004-4957(2016)03-0271-06

*通訊作者：顧大勇，博士，研究員，研究方向：生物芯片、生物傳感器技術，Tel：0755-83391344，E-mail:wanhood@163.com