Leica DMI6000 B活細(xì)胞工作站的配置及應(yīng)用

李 婧， 尤元義， 石慶喜， 李 旭

(西安交通大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

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·儀器設(shè)備供應(yīng)與管理·

Leica DMI6000 B活細(xì)胞工作站的配置及應(yīng)用

李 婧， 尤元義， 石慶喜， 李 旭

(西安交通大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710061)

通過(guò)介紹Leica DMI6000 B活細(xì)胞工作站(Live Cell Application, LCA)的配置和技術(shù)參數(shù)，樣品制備要求，圖像采集的參數(shù)設(shè)置原則等，并以實(shí)例講解LCA目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。DMI6000 B配有細(xì)胞孵育系統(tǒng)和圖像采集系統(tǒng)，孵育系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行常氧或缺氧培養(yǎng)，圖像采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集細(xì)胞圖像。圖像采集系統(tǒng)中的焦平面跟蹤系統(tǒng)，可防止在延時(shí)拍攝中圖像變虛；明場(chǎng)與熒光多通道采集，可幫助實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞熒光示蹤；多位點(diǎn)采圖，可幫助實(shí)現(xiàn)多視野動(dòng)態(tài)觀察；拼接掃描可采集樣本全景圖像；z軸掃描可對(duì)樣本進(jìn)行立體觀察。LCA具有倒置熒光顯微鏡和細(xì)胞培養(yǎng)箱的雙重功能，可跟蹤觀察活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化；DMI6000 B還可在缺氧條件下完成上述功能。

活細(xì)胞工作站； Leica DMI6000 B； 延時(shí)拍攝； 配置及應(yīng)用

0 引 言

LCA是對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行不同水平動(dòng)態(tài)研究的一款新儀器，對(duì)活細(xì)胞在培養(yǎng)的同時(shí)進(jìn)行圖像采集，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)顯微鏡只能定時(shí)觀察的不足。LCA在細(xì)胞水平可以實(shí)現(xiàn)定性與定量分析、活細(xì)胞圖像處理、活細(xì)胞動(dòng)態(tài)示蹤，如研究活細(xì)胞增殖、遷移[1]、侵襲[2]、凋亡[3]、內(nèi)吞[4]等生物學(xué)現(xiàn)象，細(xì)胞遷移過(guò)程的動(dòng)態(tài)評(píng)估[5]、細(xì)胞遷移速率及軌跡的研究[6]、精卵結(jié)合過(guò)程研究[7]、受精卵起始72 h發(fā)育觀察[8]。在分子水平可做到基因定位定量表達(dá)的動(dòng)態(tài)分析，如蛋白質(zhì)翻譯[9]、降解、運(yùn)輸、蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)態(tài)研究、蛋白質(zhì)合成與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架(細(xì)胞3D結(jié)構(gòu)重建及空間定位)、細(xì)胞骨架的代謝動(dòng)力學(xué)測(cè)定、細(xì)胞周期各時(shí)相的動(dòng)態(tài)觀察[10]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET、熒光示蹤[11]等。因此，熟悉該儀器的配置和使用對(duì)從培養(yǎng)的細(xì)胞獲取更多有價(jià)值的研究資料具有非常重要意義。

1 Leica DMI6000 B配置和技術(shù)參數(shù)

(1) DMI6000 B倒置研究型熒光顯微鏡。該顯微鏡包含五個(gè)物鏡鏡頭：5×，10×，20×，40×，63×(油鏡)。其中5×，10×，20×物鏡具有相差功能。

顯微鏡使用EL6000緊湊型光源，熒光光源為汞燈，包含A、I3、N2.1三個(gè)熒光濾塊。A為UV激發(fā)藍(lán)光，激發(fā)光波長(zhǎng)范圍：340～380 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)425 nm；I3為藍(lán)光激發(fā)綠光，激發(fā)光：450～490 nm，發(fā)射光515 nm；N2.1為綠光激發(fā)紅光，激發(fā)光：515～560 nm，發(fā)射光590 nm。

顯微鏡配有shuttle開(kāi)關(guān)，用于減少延時(shí)拍攝中光源對(duì)樣本的損傷。每次采圖，shuttle自動(dòng)打開(kāi)，光源照射樣本采圖；采集完畢，shuttle自動(dòng)關(guān)閉。

(2) PECON O2-CO2-℃孵育系統(tǒng)。該系統(tǒng)可提供的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)條件：5%CO2，37 ℃恒溫，飽和濕度；可達(dá)到的缺氧濃度范圍1%～10%。

系統(tǒng)核心構(gòu)成包括五部分：孵育器S.，加熱插件P或M96，3700 CTI控制器，37-2型電子溫控器，氧氣控制器。另外還配有CO2氣瓶、氮?dú)鈿馄亢图訚衿鞯取?/p>

系統(tǒng)工作原理：孵育器和加熱插件構(gòu)成培養(yǎng)細(xì)胞的密閉小室；氮?dú)饣驂嚎s空氣通過(guò)氧氣控制器和加濕器后，與CO2氣體共同進(jìn)入CTI控制器加熱并混合，再輸出進(jìn)入小室，為細(xì)胞提供常氧或缺氧培養(yǎng)環(huán)境。電子溫控器調(diào)控加熱插件及混合氣體溫度，溫控范圍10～40 ℃；CTI控制器調(diào)控CO2濃度，調(diào)控范圍2%～7.5%；氧氣控制器通過(guò)調(diào)控氮?dú)膺M(jìn)入的流速來(lái)調(diào)控缺氧濃度。

(3) 焦平面跟蹤系統(tǒng)AFC(Adaptive Focus Control)。AFC可根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間及細(xì)胞空間位置(尤為垂直方向)的改變自動(dòng)調(diào)節(jié)焦平面，確保在整個(gè)延時(shí)拍攝中，持續(xù)獲得樣本最清晰圖像。

AFC還可幫助實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)延時(shí)拍攝，其AFC+HighSpeed模式可自動(dòng)、快速調(diào)節(jié)不同視野的焦平面，消除因數(shù)次位置移動(dòng)帶來(lái)的圖像變虛。

(4) CCD相機(jī)。配置了Leica DFC365FX，一款擁有144萬(wàn)像素的高端熒光全幀CCD相機(jī)。它在信號(hào)較弱時(shí)，仍能采集到清晰的熒光照片，并可扣除樣本雜背景。

相機(jī)擁有標(biāo)準(zhǔn)和NIR兩種采集模式。NIR為近紅外模式，可采集并增強(qiáng)波長(zhǎng)大于700 nm的近紅外波段，彌補(bǔ)了常規(guī)顯微鏡不能敏銳檢測(cè)近紅外波段熒光的缺陷。

(5) AF6000寬場(chǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)成像原理為“面成像”，即一個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得整個(gè)二維圖像，區(qū)別于激光共聚焦的點(diǎn)成像，點(diǎn)成像是對(duì)樣本焦平面實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明，點(diǎn)掃描[12]。

(6) 操作和分析軟件。LAS AF 2.5操作軟件。

2 活細(xì)胞工作站樣品制備要求

(1) 待觀察樣品。貼壁或懸浮細(xì)胞、部分活體組織(DFC365FX相機(jī)說(shuō)明書(shū)提及的三日齡黑腹果蠅幼蟲(chóng))。

(2) 熒光染料的選擇。參考前述1.1，熒光濾塊的觀察范圍。

(3) 培養(yǎng)器材的選擇。延時(shí)拍攝可選擇器材：直徑為35 mm或60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、激光共聚焦專(zhuān)用皿、POC-R2顯微鏡細(xì)胞組織培養(yǎng)系統(tǒng)(見(jiàn)圖1)、96孔板、三維培養(yǎng)Lab-Tek Chamber Slide(見(jiàn)圖2)等。

圖1 POC-R2系統(tǒng)

圖2 Lab-Tek chamber slide

普通拍攝可選擇器材：不同直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、孔板、載玻片(選用0.13～0.17 μm厚度的蓋玻片[13])等。

3 Leica DMI6000 B圖像采集基本參數(shù)設(shè)置

3.1 長(zhǎng)時(shí)間定時(shí)拍攝(延時(shí)拍攝)

(1) 時(shí)間序列采圖。單擊激活t選項(xiàng)，設(shè)置采集兩張圖片的時(shí)間間隔、采集圖像總時(shí)間或總循環(huán)數(shù)等(如，每15 min拍攝一張，拍攝8 h)。將圖像調(diào)節(jié)清晰后，選擇Adaptive Focus Control模式，勾選AFC on、on demand mode、Hold current position，開(kāi)啟圖像采集。

(2) 多位點(diǎn)采圖。激活“Mark & Find”選項(xiàng)。在該選項(xiàng)中點(diǎn)擊相應(yīng)圖標(biāo)，可存儲(chǔ)或刪除某位置，設(shè)置完畢，點(diǎn)擊Start，儀器會(huì)按照設(shè)定的位置逐一采圖；還可實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)延時(shí)采圖，此時(shí)需開(kāi)啟AFC+HighSpeed 模式，如前1.3述。

(3) 多通道采圖。點(diǎn)擊“+”“-”設(shè)置通道(FCr)數(shù)量，通過(guò)色表(LUT selection)為通道設(shè)定偽彩；在光路設(shè)置(Light Path Settings)中，通過(guò)Contrast Method選擇觀察方式如，明場(chǎng)BF、微分干涉DIC、熒光FLUO。

3.2 熒光采圖

在激發(fā)光濾片(Excitation Filter)中選擇合適的濾光片，如，A、I3、N2.1，見(jiàn)前述1.1。

將激發(fā)光強(qiáng)度(Intensity)調(diào)至4或5，若熒光染料抗淬滅性差可調(diào)至3；曝光時(shí)間(Exposure)200 ms左右最佳，最長(zhǎng)不超過(guò)1 s；攝像頭信號(hào)的電子增益(Gain)不宜過(guò)高，建議調(diào)至2。

3.3 拼接掃描

激活“Tile Scan”選項(xiàng)，點(diǎn)擊鼠標(biāo)定義某區(qū)域的兩個(gè)對(duì)角位置，可拼接多個(gè)相鄰視野，獲得大視野圖像。樣本較厚且要進(jìn)行熒光拼接掃描時(shí)，需同時(shí)啟動(dòng)z軸掃描，設(shè)定采圖上、下限，以獲得最清晰圖像(見(jiàn)圖5)。

3.4 z軸序列采圖

激活z選項(xiàng)，z-position代表焦平面當(dāng)前位置。調(diào)節(jié)好樣本焦平面后，點(diǎn)擊并挪動(dòng)立方體兩側(cè)箭頭設(shè)置z軸掃描上限(Begin)和下限(End)，點(diǎn)擊Start，儀器會(huì)采集該樣本不同層面的圖像。

4 活細(xì)胞工作站主要功能及在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

4.1 明場(chǎng)條件下的延時(shí)拍攝

明場(chǎng)條件下的延時(shí)拍攝通過(guò)時(shí)間序列掃描，對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)及觀察，實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果既可導(dǎo)出隨時(shí)間改變的序列組圖，也可導(dǎo)出Movie。具體應(yīng)用如，單細(xì)胞示蹤、實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞遷移[1]、侵襲[2]、凋亡[3]、增殖(見(jiàn)圖3)、內(nèi)吞[4]、融合[14]等生物學(xué)過(guò)程。

圖3 明場(chǎng)延時(shí)拍攝卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖過(guò)程(100×)

細(xì)胞在傳代后4 h貼壁，19 h左右展現(xiàn)出完整形態(tài)，21 h變球形準(zhǔn)備分裂，22 h第一次分裂完成；51 h其中一個(gè)子代細(xì)胞變球形準(zhǔn)備分裂，51.5 h分裂完成；59 h另一個(gè)子代細(xì)胞變球形準(zhǔn)備分裂，60 h分裂完成。最終由一個(gè)細(xì)胞生成4個(gè)細(xì)胞。

4.2 多通道圖像采集與熒光示蹤

多通道圖像采集可同時(shí)進(jìn)行明場(chǎng)與熒光延時(shí)拍攝，并進(jìn)行后期不同通道圖像疊加，可實(shí)現(xiàn)熒光示蹤等功能。用于觀察記錄細(xì)胞內(nèi)外某特定成分的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。如，熒光示蹤細(xì)胞周期中核的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程(熒光標(biāo)記細(xì)胞核)[10]、老鼠胚胎干細(xì)胞體外發(fā)育過(guò)程(胞質(zhì)表達(dá)熒光融合蛋白)[15]、小鼠卵母細(xì)胞后期成熟與極體排放過(guò)程(熒光標(biāo)記DNA)[11]、腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程(GFP標(biāo)記細(xì)胞核)[16]、成釉細(xì)胞內(nèi)吞熒光標(biāo)記蛋白的過(guò)程[17]、熒光標(biāo)記的siRNA片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞過(guò)程(見(jiàn)圖4)等。

每張圖像右上角表示拍攝時(shí)間(時(shí)：分：秒：毫秒)。組圖依次為轉(zhuǎn)染后0，1，2 h直至8 h的明場(chǎng)與熒光疊加圖像。隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光增多，說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的siRNA片段增多。

4.3 拼接掃描

拼接掃描可用于拍攝明場(chǎng)或熒光條件下的組織全景圖、細(xì)胞或組織大視野圖(見(jiàn)圖5)。

4.4 z軸掃描

用于觀測(cè)樣品空間結(jié)構(gòu)和空間定位。

4.5 缺氧培養(yǎng)

4.1及4.2所述功能也可在缺氧條件下進(jìn)行，大大拓寬了該儀器的應(yīng)用范圍。

圖4 雙通道延時(shí)拍攝FAM標(biāo)記的siRNA片段轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞過(guò)程(200×)

圖5 銀杏樹(shù)枝橫截面 熒光拼接掃描局部圖(200×)

5 活細(xì)胞工作站維護(hù)與管理

5.1 日常維護(hù)

(1) 嚴(yán)格遵守儀器操作流程，避免因操作不當(dāng)造成儀器損壞。

(2) 整個(gè)操作過(guò)程不要有液體流入系統(tǒng)，保持系統(tǒng)干燥和清潔，以防真菌生長(zhǎng)。

(3) 使用完畢，切斷電源，清潔物鏡目鏡。鏡頭表面用擦鏡紙蘸取少量無(wú)水酒精，從中心往外周螺旋式擦拭。擦拭時(shí)勿對(duì)鏡頭表面施加壓力。鏡頭表面浸油可先用擦鏡紙抹去，再蘸取酒精擦拭。

(4) 顯微鏡表面和任何塑料部件只可用清水擦拭，不可使用有機(jī)溶劑。光學(xué)部件表面灰塵可用吸耳球吹去。

(5) 房間最適溫度15～25 ℃，濕度60%；系統(tǒng)工作溫度15～40 ℃(顯微鏡切勿超過(guò)40 ℃)。

5.2 使用過(guò)程注意事項(xiàng)

(1) 載物臺(tái)初始化：打開(kāi)顯微鏡前，務(wù)必先將密閉小室從通氣與出氣管上取下，放在合適位置。否則開(kāi)啟顯微鏡，載物臺(tái)自動(dòng)初始化會(huì)使小室發(fā)生劇烈震動(dòng)，損害儀器；

(2) 啟動(dòng)多位點(diǎn)拍攝前載物臺(tái)初始化：開(kāi)啟軟件時(shí)再做一次初始化。

(3) CTI控制器預(yù)熱30 min后再輸入CO2。若做缺氧培養(yǎng)，先輸入CO2，再輸入氮?dú)狻?/p>

(4) 加濕器內(nèi)最多加入350 mL水。

(5) 使用63×油鏡時(shí)，需使用顯微鏡DRY/IMM按鈕完成切換。

(6) 圖像和數(shù)據(jù)資料必須用光盤(pán)刻錄，嚴(yán)禁使用U盤(pán)。

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摘要的分類(lèi)

按摘要的不同功能來(lái)劃分，大致有如下3種類(lèi)型：報(bào)道性摘要、指示性摘要、報(bào)道—指示性摘要。

本刊要求科技論文寫(xiě)成報(bào)道性摘要，而對(duì)綜述性、資料性或評(píng)論性文章可寫(xiě)成另兩種摘要形式，下面著重介紹報(bào)道性摘要。

報(bào)道性摘要是指明一次文獻(xiàn)的主要范圍及內(nèi)容梗概的簡(jiǎn)明摘要，相當(dāng)于簡(jiǎn)介。報(bào)道性摘要一般用來(lái)反映科技論文的目的，方法及主要結(jié)果與結(jié)論，在有限的字?jǐn)?shù)內(nèi)向讀者提供盡可能多的定性或定量的信息，充分反映該研究的創(chuàng)新之處?？萍颊撐娜绻麤](méi)有創(chuàng)新內(nèi)容，如果沒(méi)有經(jīng)得起檢驗(yàn)的與眾不同的方法或結(jié)論，是不會(huì)引起讀者的閱讀興趣的，所以本刊選用報(bào)道性摘要，以比其他類(lèi)摘要字?jǐn)?shù)稍多的篇幅，向讀者介紹論文的主要內(nèi)容，以“摘錄要點(diǎn)”的形式報(bào)道出作者的主要研究成果和比較完善的定量及定性的信息。篇幅以300字左右為宜。

(本編輯部摘編)

Configuration and Application of Live Cell Application Leica DMI6000 B

LIJing,YOUYuan-yi,SHIQing-xi,LIXu

(The First Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

This paper introduces the configuration and function of Leica DMI6000 B Live Cell Application. It aims to expand applications of LCA in the field of biomedical research. The configuration and technical parameters, sample preparation requirements, parameter setting principles of image acquisition etc are comprehensively introduced, examples of applications of LCA in biomedical research are given. DMI 6000 B is equipped with incubating system as well as image acquiring system, the latter acquires real-time cell images when the former incubates cells in normoxia or hypoxia. In order to capture successive clear images in time-lapse imaging, adaptive focus control of image acquiring system is needed. The bright and fluorescence field help to realize living cell fluorescence trace, and multi-position image acquisition helps to get real-time cell images of several fields meanwhile. Tile scan supplies overview image of a sample; z-menu scans samples in three-dimensional. Therefore, LCA can be used for observing the dynamic changes of the cultured living cells since it integrates the function of inverted fluorescence microscope with cell culture incubator, furthermore, DMI6000 B can accomplish functions mentioned above in hypoxia.

live cell application; Leica DMI6000 B; time-lapse imaging; configuration and application

2015-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81372151)

李 婧(1984-)，女，陜西西安人，碩士，助理研究員，主要從事科研儀器設(shè)備與實(shí)驗(yàn)室管理。

Tel.: 029-85323528, 18291420181; E-mail: li-jing-smile@163.com

李 旭(1956-)，男，陜西西安人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤學(xué)方面的研究。

Tel.: 029-85323528; E-mail: lixu56@mail.xjtu.edu.cn

Q 334

A

1006-7167(2016)02-0273-04