馬身豬和大白豬背最長(zhǎng)肌Rac1基因發(fā)育性表達(dá)研究

王澤藝，石建中，劉鄭煜，高鵬飛，浦忠得，楊青春，郭曉紅，李步高，曹果清*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.大同市種豬場(chǎng)，山西 大同 037000)

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馬身豬和大白豬背最長(zhǎng)肌Rac1基因發(fā)育性表達(dá)研究

王澤藝1，石建中2，劉鄭煜1，高鵬飛1，浦忠得1，楊青春1，郭曉紅1，李步高1，曹果清1*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.大同市種豬場(chǎng)，山西 大同 037000)

[目的]探究Rac1基因mRNA和蛋白質(zhì)在馬身豬和大白豬背最長(zhǎng)肌組織中的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律，揭示Rac1基因與豬肌肉發(fā)育之間的關(guān)系。[方法]采用qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)馬身豬和大白豬從1日齡到180日齡(1、30、60、90、120、150和180日齡)階段背最長(zhǎng)肌中Rac1基因的表達(dá)規(guī)律。[結(jié)果]Rac1基因mRNA在大白豬1日齡、120日齡和180日齡時(shí)表達(dá)量較高，與其他日齡相比差異極顯著(P<0.01)，其他日齡表達(dá)量均維持在較低水平；馬身豬60日齡時(shí)Rac1 mRNA表達(dá)量最高，極顯著地高于其他日齡(P<0.01)，90日齡次之，其他日齡表達(dá)水平較低，且日齡間表達(dá)量無(wú)顯著差異。在蛋白質(zhì)水平上，從1日齡到180日齡，大白豬Rac1表達(dá)量整體呈先降低后升高的趨勢(shì)，在1日齡時(shí)表達(dá)量最高，120日齡表達(dá)量最低；馬身豬整體呈先升高后降低的趨勢(shì)，60日齡時(shí)表達(dá)量最高，極顯著高于其他日齡(P<0.01)，隨后幾個(gè)月齡的表達(dá)量處于較低水平，顯著低于1日齡和30日齡(P<0.05)。品種間比較，馬身豬Rac1蛋白表達(dá)量始終高于大白豬，且在1日齡和60日齡，差異極顯著(P<0.01)，在120日齡和150日齡，差異顯著(P<0.05)。[結(jié)論]豬背最長(zhǎng)肌中Rac1基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量與豬的年齡及遺傳背景有關(guān)。

豬；Rac1基因； 發(fā)育性表達(dá)

Ras 相關(guān)的C3 肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)是Rho家族Rac亞家族成員，該亞家族具有Rac1、Rac2、Rac3以及Rac1的剪切突變體Rac1b等4種同工酶形式。Ras超家族是一個(gè)能編碼GTP酶的超家族，該超家族成員眾多，能編碼100多種酶類[1]。該家族成員編碼的小G蛋白有共同的G結(jié)構(gòu)域核心，提供GTP酶與GTP/GDP交換活性[2]。Rac1基因生物學(xué)功能的發(fā)揮依賴于GTP酶在有活性GTP結(jié)合形式和無(wú)活性的GDP結(jié)合形式之間循環(huán)[3,4]。Rac1作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)換器，在細(xì)胞的增殖分化與凋亡、肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)、胞內(nèi)吞噬作用以及細(xì)胞物質(zhì)交換等方面發(fā)揮重要作用[5,6]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，Rac1基因在小鼠的四肢肌肉、膈肌、舌肌以及軀干肌中均有表達(dá)[7]。Nobuyuki等[8]研究表明，在小鼠腓腸肌中Rac1基因表達(dá)于肌細(xì)胞膜的外圍。Rac1基因在調(diào)控成肌細(xì)胞融合中具有重要作用，能夠調(diào)控成肌細(xì)胞細(xì)胞周期，抑制肌前體細(xì)胞的產(chǎn)生促進(jìn)成肌細(xì)胞融合[9,10]。Sophie等[11]在體外有增殖能力的C2C12細(xì)胞中添加了Rac1的化學(xué)抑制劑NSC23766，2 d后使用Western blot技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Rac1的活性顯著下降，6 d后發(fā)現(xiàn)沒有肌管形成。

馬身豬是山西省地方優(yōu)良品種，適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖力高，抗病力和抗逆性強(qiáng)，肉質(zhì)細(xì)嫩，肌肉大理石紋適中，肉香味濃，但生長(zhǎng)速度較慢，產(chǎn)肉率相對(duì)較低，脂肪沉積相對(duì)較多。大白豬是國(guó)外引進(jìn)品種，相對(duì)于馬身豬，生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)肉率相對(duì)較高。目前，有關(guān)家畜Rac1基因的研究相對(duì)較少。本文采用qRT-PCR和western blot技術(shù)檢測(cè)馬身豬和大白豬從1日齡到180日齡階段背最長(zhǎng)肌中Rac1基因的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律，探討該基因的表達(dá)特性及與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

大白豬和馬身豬在相同的環(huán)境下飼養(yǎng)(大同市種豬場(chǎng)提供)，分別在1日齡、30日齡、60日齡、90日齡、120日齡、150日齡和180日齡時(shí)稱重并屠宰，每日齡各取4頭(公母各半，公豬斷奶時(shí)去勢(shì))。屠宰后，取其背最長(zhǎng)肌組織，鋁箔包裹后放于離心管中，置于液氮罐中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器及試劑

Stratagene Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Stratagene)，ND-1000微量核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Nanodrop)，Centrifuge 5415R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf)，紫外凝膠成象系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))， Mini-PROTEAN?Tetrasystem(BIO-RAD，美國(guó))，MiniTrans-Blot?CellModule(BIO-RAD，美國(guó))；Trizol?Reagent(Invitrogen，美國(guó))，SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)，PrimeScript?RT Master Mix Perfect Real Time(TaKaRa)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成

Trizol法提取總RNA，電泳采用的是非變性瓊脂糖凝膠電泳，用來檢測(cè)所抽提的RNA的完整性，ND-1000微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA的濃度和純度。根據(jù)Prime Script?RT Master Mix Perfect Real Time反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。第一步： 5×gDNA Erase Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA 2 μL (500 mg·L-1)， ddH2O補(bǔ)充至10 μL體系，42 ℃ 2 min的程序進(jìn)行PCR；第二步：上一步變性、退火后反應(yīng)液10 μL，5×PrimeScript Buffer2(for Real Time)4 μL，RNaseFree dH2O 4 μL，RT Primer Mix 1 μL，PrimeScript RT Enzyme 1 μL，再以37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s的程序進(jìn)行PCR。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA于-20 ℃保存。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中豬Rac1基因mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：NM_001243585.1)，運(yùn)用NCBI網(wǎng)站Primerblast設(shè)計(jì)Rac1引物，由華大基因合成，內(nèi)參18SrRNA引物為實(shí)驗(yàn)室保存，引物序列信息見表1。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)

第一步反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA保持其原始濃度，不做任何處理，作為其初始濃度保留，隨后取出10 μL 原始濃度cDNA，2倍梯度依次往下稀釋8個(gè)濃度梯度，稀釋過程中注意操作的規(guī)范性。最終建立Rac1基因和18SrRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以上全部完成后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，設(shè)定PCR反應(yīng)總體系為20 μL，即SYBR?Premix Ex TaqⅡ10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1) 各0.8 μL，ROX 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL，反應(yīng)溶液充分混合均勻。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性20 s，63 ℃退火及延伸34 s，45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，1個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出后，采用2-△△CT法對(duì)基因mRNA的表達(dá)量進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1Rac1和18SrRNA引物信息

Table 1 Primer sequences ofRac1 and 18SrRNAgenes

基因GenesGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionNo.引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')退火溫度/℃Annealingtemperature產(chǎn)物大小/bpproductsizeRac1NM_N001243585.1F:CAGTTACACGACCAATGCCTR:CCAGCCGTATCCCATAAGCC6011718SrRNANR_046261.1F:CCCACGGAATCGAGAAAGAGR:TTGACGGAAGGGCACCA60122

1.2.4 蛋白印跡反應(yīng)

取適量液氮研磨組織，組織充分研磨后取0.1 g置于2 mL的離心管中，按照博士德公司總蛋白抽提試劑盒使用說明書提取總蛋白。樣品抽提好后使用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)蛋白質(zhì)的純度，BCA蛋白濃度測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。待樣本檢測(cè)沒有問題后，取2 μL 6×的蛋白變性上樣緩沖液與30 μg總蛋白震蕩混勻后加到PCR管中，用10%的SDS溶液補(bǔ)充所有樣本至10 μL，使用金屬浴95 ℃變性5 min后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳條件如下：80 V跑5%濃縮膠30 min，120 V跑12%分離膠60 min，至溴酚藍(lán)到玻璃板底部時(shí)停止電泳。電泳結(jié)束后，切膠，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓120 V濕轉(zhuǎn)90 min于NC膜(0.22 μm)上。以上步驟完成后使用封閉液進(jìn)行封閉，封閉液使用的是5%的脫脂奶粉，封閉時(shí)間是90 min。隨后進(jìn)行一抗孵育(一抗稀釋比例為 Rac1 1∶1 500、GAPDH 1∶3 000)，4 ℃搖床孵育過夜。第二天使用TBST洗膜，每次10 min，共洗3次，每次洗膜更換新的TBST；二抗室溫?fù)u床孵育90 min，同樣TBST洗膜，每次10 min，共洗3次。ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色反應(yīng)，凝膠成像系統(tǒng)成像，使用Image labTMsoftware version 4.0分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件的GLM對(duì)Rac1基因mRNA和蛋白在馬身豬和大白豬背最長(zhǎng)肌中的發(fā)育性表達(dá)差異進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，模型中包括品種、日齡等固定效應(yīng)及互相之間的互作效應(yīng)，配合的統(tǒng)計(jì)模型為：

yijk=μ+Bi+Dj+BMij+eijk

其中，μ為總體均值；yijk為Rac1基因mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量；Bi為品種效應(yīng)(i=1, 2)；Dj為日齡效應(yīng)(j=1-7)；BMij為品種與日齡的互作效應(yīng)；eijk為隨機(jī)殘差。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA純度鑒定

本研究提取的總RNA經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)，OD260/OD280在1.8～2.0之間，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28S和18SrRNA條帶清晰、無(wú)拖尾、完整性好(圖1)，符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。

圖1 部分樣本總RNA提取結(jié)果Fig.1 Total RNA extracted from longissimus dorsi of partial samples

2.2 大白豬和馬身豬背最長(zhǎng)肌Rac1 mRNA的發(fā)育性表達(dá)

Rac1基因mRNA在兩品種豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)模式如圖2所示。其中，大白豬初生1日齡、120日齡和180日齡時(shí)表達(dá)量較高，與其他日齡相比差異極顯著(P<0.01)。30日齡、60日齡、90日齡、150日齡表達(dá)量均較低，且日齡間無(wú)顯著差異。與大白豬的表達(dá)規(guī)律相反，馬身豬60日齡時(shí)表達(dá)量最高，與其他日齡相比差異極顯著(P<0.01)；90日齡時(shí)表達(dá)量顯著下降，之后，隨日齡增加呈下降趨勢(shì)并維持較低表達(dá)水平，150日齡時(shí)表達(dá)量最低。同一發(fā)育階段兩品種間進(jìn)行比較，30日齡時(shí)，大白豬和馬身豬的表達(dá)量無(wú)明顯差異，其余各階段，差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，在1日齡、120日齡、150日齡、180日齡，大白豬的表達(dá)量極顯著高于馬身豬(P<0.01)，而在60日齡和90日齡，馬身豬的表達(dá)量極顯著高于大白豬(P<0.01)。

圖2 Rac1 mRNA在馬身豬和大白豬背最長(zhǎng)肌中的發(fā)育性表達(dá)Fig.2 The developmental expression of Rac1 mRNA in longissimus dorsi of Mashen and Large White pigs 注：(1)上標(biāo)字母相同表示同品種不同日齡間差異不顯著，字母不同表示差異顯著或極顯著。(2)*表示同日齡品種間差異顯著(P<0.05)，**表示同日齡品種間差異極顯著(P<0.01)。下同。Note：(1)The same superscript letter indicates no significant difference among seven stages of same breed,the different letters means that difference is significant at the levelof 0.05 and 0.01, respectively.(2)* means significant difference betweentwo breeds of same stages at 0.05 level, **means significant difference at 0.01 level. The same as below.

2.3 大白豬和馬身豬背最長(zhǎng)肌Rac1蛋白的發(fā)育性表達(dá)

Rac1蛋白在大白豬和馬身豬背最長(zhǎng)肌的蛋白印跡圖和發(fā)育性表達(dá)比較見圖3和圖4。就大白豬而言，Rac1蛋白在1日齡時(shí)表達(dá)量最高，120日齡表達(dá)量最低，30日齡至120日齡表達(dá)量成呈下降趨勢(shì)，后又呈上升趨勢(shì)；馬身豬各日齡間表達(dá)量均維持在較高水平，其中60日齡表達(dá)量最高，與其他日齡相比差異極顯著(P<0.01)，90日齡表達(dá)量最低。兩豬種間比較發(fā)現(xiàn)，Rac1蛋白每個(gè)階段的表達(dá)量均高于大白豬，其中1日齡和60日齡與大白豬相比差異極顯著(P<0.01)，120日齡和150日齡差異顯著(P<0.05)。

圖3 馬身豬和大白豬背最長(zhǎng)肌Rac1蛋白免疫印跡圖Fig.3 Immunoblotting of Rac1 protein in longissimus dorsi of Mashen and Large White pigs

圖4 Rac1蛋白在馬身豬和大白豬背最長(zhǎng)肌組織中的發(fā)育性表達(dá)Fig.4 The developmental expression of Rac1 protein in longissimus dorsi of Mashen and Large White pigs

3 討 論

本研究中，在大白豬中，從初生到180日齡，Rac1基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量均呈現(xiàn)出先降低又升高的趨勢(shì)，在1日齡時(shí)較高，隨后降低，在mRNA水平上降低速度很快，在60日齡時(shí)降到最低值，隨后逐漸升高；而在蛋白水平上，降低幅度較慢，到120日齡時(shí)降到最低值，此后逐漸升高。這種規(guī)律與大白豬的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律基本一致。研究發(fā)現(xiàn)Rac1基因在胚胎干細(xì)胞時(shí)期調(diào)控肌源細(xì)胞的遷移，大白豬在1日齡時(shí)表達(dá)量高的原因可能是在初生時(shí)期成肌細(xì)胞融合較快，肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育較早；隨后表達(dá)量下降，到150日齡時(shí)表達(dá)量又上升，此時(shí)正是大白豬快速生長(zhǎng)時(shí)期，肌肉、脂肪等組織均在快速生長(zhǎng)，可能Rac1的高表達(dá)促進(jìn)了大白豬150日齡到180日齡階段的快速生長(zhǎng)。馬身豬60日齡時(shí)Rac1基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量均最高，極顯著高于其他日齡。Zhao 等[12]研究表明，馬身豬30～60日齡的日增重為410.33 g，顯著高于30日齡之前和60～90日齡的日增重(180.33 g)，這可能與馬身豬60日齡階段Rac1的高表達(dá)有關(guān)，研究表明Rac1是細(xì)胞內(nèi)重要的“分子開關(guān)”，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的作用。

大白豬為引進(jìn)豬種，各個(gè)時(shí)期的生長(zhǎng)速度均顯著高于馬身豬。而本研究中，馬身豬各生長(zhǎng)階段背最長(zhǎng)肌中Rac1蛋白的表達(dá)量始終高于大白豬，這與馬身豬和大白豬的生長(zhǎng)特點(diǎn)及Rac1促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能不相符，原因可能是Rac1發(fā)揮作用時(shí)需要其他因子將其活化，雖然馬身豬各階段背最長(zhǎng)肌中Rac1的表達(dá)量均高于大白豬，但兩豬種背最長(zhǎng)肌中活化的Rac1量未測(cè)定。此外，Rac1在機(jī)體免疫調(diào)控中起重要作用。Hu等[13]研究表明，Rac1參與了草魚免疫系統(tǒng)的功能調(diào)控，經(jīng)嗜水氣單胞菌和細(xì)菌PAMPs誘導(dǎo)后，Rac1的過表達(dá)能調(diào)高gcPAK1,gcIL1-β,gcTNF-α和gcIFN等基因的表達(dá)；而Rac1敲除后，再用嗜水氣單胞菌攻擊后，這些基因的表達(dá)下降。馬身豬為地方豬種，抗病力強(qiáng)，其各階段Rac1表達(dá)量高于大白豬是否與Rac1在先天免疫中的作用有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

大白豬背最長(zhǎng)肌中Rac1基因的mRNA和蛋白均在初生時(shí)表達(dá)量最高，馬身豬中背最長(zhǎng)肌中Rac1基因的mRNA和蛋白在60日齡表達(dá)量最高。馬身豬Rac1蛋白每個(gè)階段的表達(dá)量均高于大白豬。Rac1基因的發(fā)育性表達(dá)規(guī)律與豬的生長(zhǎng)發(fā)育階段和品種的遺傳背景有關(guān)。

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(編輯：武英耀)

Developmental expression ofRac1 gene in longissimus dorsi in mashen and large white pigs

Wang Zeyi1, Shi Jianzhong2, Liu Zhengyu1, Gao pengfei1, Pu zhongde1, Yang qingchun1, Guo Xiaohong1, Li Bugao1, Cao Guoqing1*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu,Shanxi030801,China， 2.Datongpigbreedingfarm,Datong,Shanxi037000，China)

[Objective]The aim of this study was to investigate the developmental patterns ofRac1 gene inlongissimusdorsiand its influence on muscle growth and development in Mashen and Large White pigs. [Methods]The relative expressions at the levels of mRNA and protein ofRac1 gene inlongissimusdorsiat the ages of 1, 30, 60, 90, 120, 150, and 180 days old in Mashen and Large White pigs were detected by quantitative real-time PCR and western blot. [Results]The main results showed that the mRNA relative expression ofRac1 gene inlongissimusdorsiat the ages of 1, 120, and 180 days old in Large White pig was greater than those at other ages (P<0.01), whose relative expression was low. In Mashen pig, the highest relative expression ofRac1 mRNA was at 60 day-old (P<0.01), then at 90 day-old. The expressions at other ages were kept low and stable levels and no significant difference was found among them. Concerning to the relative expression ofRac1 protein, the changing trend in Large White pig was decreasing and increasing from one day-old to 180 day-old, and the greatest peak was at one day-old, the lowest point was at 120 day-old. The developmental expression trend ofRac1 in Mashen pig was the opposite with that in Large White, and followed the trend of increasing and decreasing. The greatest relative expression was at 60 day-old, and significantly greater than those at other ages (P<0.01). The relative expression amount was became low and stable since 60 day-old, and lower than those at one day-old and 30 day-old (P<0.05). [Conclusion]The relative expression ofRac1 gene at the levels of mRNA and protein was associated with age and genetic background of pigs.

Pig，Rac1 gene， Developmental expression

2016-06-19

2016-07-12

王澤藝(1989-)，女(漢)，山東煙臺(tái)人，碩士生，研究方向：遺傳學(xué)與動(dòng)物育種

*通訊作者：曹果清，博士，教授。Tel:13403665105；E-mail：anniecao710502@aliyun.com

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140311020-5)；山西省研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目(2015SY25)

S828

A

1671-8151(2016)11-0827-05