大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體異養(yǎng)細菌組成的研究

王先平，李 杰，韓厚偉，胡佳平，趙麗麗，邵 偉，王振洋

( 山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺 264003 )

大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體異養(yǎng)細菌組成的研究

王先平，李 杰，韓厚偉，胡佳平，趙麗麗，邵 偉，王振洋

( 山東東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺 264003 )

采集養(yǎng)殖池水樣，選取Zobell 2216E瓊脂培養(yǎng)基、溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基6種常見固體培養(yǎng)基進行細菌分離培養(yǎng)，以平板菌落計數法和菌落外觀形態(tài)特征辨別及16S rRNA基因測序方法進行異養(yǎng)菌計數和種類組成分析。結果顯示:(1)養(yǎng)殖池水體異養(yǎng)菌可分為4大類，分別屬于變形菌門(包括α-、γ-變形菌綱)、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門，其中以γ-變形菌綱為優(yōu)勢菌群。按屬分類大多為假交替單胞菌屬和弧菌屬。(2)不同培養(yǎng)基分離菌落數量2216E培養(yǎng)基>溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基>胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基>腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基>營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基>硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，且2216E培養(yǎng)基菌落數極顯著高于其余5種培養(yǎng)基(P<0.01)；2216E培養(yǎng)基所分離細菌的種類最多，分屬于12個屬，假交替單胞菌屬為優(yōu)勢類群，占比50%，弧菌屬僅占3.13%；腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基所分離細菌均以弧菌屬為優(yōu)勢菌群，分別占33.33%、60%、25%；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基所分離細菌僅分屬于1個屬，即弧菌屬；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基無弧菌，但有假單胞菌分離出。

大西洋鮭；循環(huán)水養(yǎng)殖水體；異養(yǎng)細菌組成；不同培養(yǎng)基

大西洋鮭(Salmosalar)原產于大西洋北部和北美，是人工養(yǎng)殖產量最高的冷水性魚類[1]。傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式多為網箱、流水或水庫養(yǎng)殖，而隨著農業(yè)工業(yè)化的進程，循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)已經成為一個越來越常見的養(yǎng)殖大西洋鮭的工業(yè)模式。但循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)在病害預警機制與預防策略等方面存在較大問題與不足[2]。目前關于養(yǎng)殖水循環(huán)處理效果的研究多集中于水質理化指標檢測和硝化細菌研究方面[3-5]，而對循環(huán)水養(yǎng)殖處理系統(tǒng)中細菌的種群結構及動態(tài)變化研究較少。異養(yǎng)細菌數量的多寡可以反映水體中有機物的污染程度[6]，而對潛在病原菌的調查，對病害的發(fā)生有一定的預警指示作用[7]，因此對養(yǎng)殖水體異養(yǎng)細菌組成研究有一定的意義。

微生物的生長和代謝產物的積累受制于培養(yǎng)基的組分等多種因子的影響[8]，因此選擇適宜的培養(yǎng)基尤為重要。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法通常采用營養(yǎng)較為豐富的培養(yǎng)基，以使微生物能夠快速生長并達到最大的生物產量[9]，而自然界中除了少部分能夠利用高濃度營養(yǎng)物質的微生物種群外，其余大部分是以中低營養(yǎng)甚至寡營養(yǎng)的方式存活，如海洋環(huán)境中的微生物多為寡營養(yǎng)型[10]，而同時某些潛在病原菌一般都是偏愛豐富營養(yǎng)的種類，與環(huán)境水體菌的營養(yǎng)需求存在差異。本研究旨在以大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體為研究對象，利用6種營養(yǎng)成分不同的培養(yǎng)基，使用傳統(tǒng)的平板稀釋涂布法和現代分子測序技術相結合的手段，分析研究養(yǎng)殖水體異養(yǎng)菌種類組成的情況、調查潛在病原菌的存在情況，并比較不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基所能分離培養(yǎng)的異養(yǎng)菌種類的差異，為大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖的病害工作提供一定的數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗系統(tǒng)

試驗地點在山東東方海洋科技股份有限公司開發(fā)區(qū)分公司，選擇一套大西洋鮭成魚養(yǎng)殖系統(tǒng)進行水樣采集。該系統(tǒng)為循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(圖1)，養(yǎng)殖單元水體總體積為300 m3，共分為5口八角形池子，每池體積60 m3，水深2.5 m；水體鹽度28～30，深水井(深度約120 m)地下鹽水。養(yǎng)殖密度12.25 kg/m3，循環(huán)量450～500 m3/h，pH值7.0，水溫(15±0.2 ) ℃，溶解氧(2.94±1.70) mg/L。水樣采集期間養(yǎng)殖系統(tǒng)正常運行，紫外燈5組正常開啟，臭氧3.5 L/min。

圖1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)構造注：黑色箭頭示水流方向，虛線示備用管道.

1.1.2 培養(yǎng)基

所有培養(yǎng)基均是購自青島海博的商品化培養(yǎng)基成品，①Zobell 2216E瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨、酵母浸粉、檸檬酸鐵、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鈉、氯化鈣、氯化鉀、碳酸鈉、溴化鉀、氯化鍶、硼酸、硅酸鈉、氟化鈉、硝酸鈉、磷酸氫二鈉、瓊脂；②溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、瓊脂；③硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基成分：酵母粉、蛋白胨、硫代硫酸鈉、枸櫞酸鈉、牛膽酸鈉、蔗糖、氯化鈉、檸檬酸鐵、溴麝香草酚蘭、麝香草酚蘭、瓊脂；④腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鈉、葡萄糖、牛心浸出粉、瓊脂；⑤胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨、大豆胨、氯化鈉、瓊脂；⑥營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨、牛肉粉、氯化鈉、瓊脂。以上培養(yǎng)基均按指定方法配制后經121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻傾倒滅菌平板。

1.2 試驗方法

1.2.1 水樣采集

選擇系統(tǒng)某一養(yǎng)殖池為采樣點，分別用水樣采集器在池中心、進水口附近及池子另一端采集中層水樣3個(約水層下1.25 m處)。將水樣采集器內水樣引流至采樣瓶內，搖晃瓶體洗滌2次，再將瓶體注滿，擰緊瓶蓋后瓶體噴灑75%酒精消毒，帶回實驗室進行試驗。

1.2.2 水樣預處理

從采樣瓶中吸取一定體積的水樣以溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基按3∶1的體積比例稀釋后，170 r/min、28 ℃搖床活化1 h，根據預試驗結果選擇用無菌海水稀釋10倍，菌落數不影響計數。

1.2.3 細菌培養(yǎng)

從試管中吸取200 μL已活化稀釋好的水樣分別滴加于2216E培養(yǎng)基、溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基6種培養(yǎng)基平板上，靜置數秒后用灼燒充分并已冷卻的玻璃涂布棒涂布均勻，每個稀釋度設2個平行，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。

1.2.4 細菌數量統(tǒng)計和種類分析

分別于24、48、72、96 h，以計數器輔助統(tǒng)計平板菌落數，記錄成表。

在培養(yǎng)過程中，根據菌落的外部形態(tài)特征辨別菌落(菌落大小、顏色、透明度、邊緣是否規(guī)則、濕潤或干燥菌落突起、凹陷或平坦等)，做好記錄，同時挑取不同形態(tài)菌落，劃線純化3次，并統(tǒng)計菌落的種類數量；最終分離菌株于超低溫冰箱-80 ℃凍存。

采用酚-氯仿法提取純化的各菌株基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(電泳條件為100 V，30 min)。再以細菌16S rRNA基因通用引物27F-1492R[11](由上海生工生物工程股份有限公司合成)擴增16S rRNA基因序列，上游引物27F序列為：5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′，下游引物1492R序列為：5′-GGCTCCTTGTTACGACTT-3′。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并在253 nm波長下觀察。PCR產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行純化和序列測定，測序結果通過美國國立生物技術信息中心的BLAST檢索系統(tǒng)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進行同源序列比對。

1.3 數據處理

利用SPSS 18軟件對不同培養(yǎng)基在時間軸上的菌落數進行單因素方差分析比較，以P<0.05為差異顯著；同時對各培養(yǎng)基最終菌落數進行方差分析比較，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 試驗結果

2.1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)所得異養(yǎng)菌菌株數量的比較

所采集水樣涂布于不同培養(yǎng)基平板，分別于24、48、72、96 h,對生長菌落進行數量統(tǒng)計(圖2)，結果顯示,所分離平板菌落數量呈現2216E培養(yǎng)基>溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基>胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基>腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基>營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基>硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，其中2216E培養(yǎng)基分離的菌落數最高，為40～124 cfu，隨培養(yǎng)時間的增加而顯著增加(P<0.05)，且最終培養(yǎng)所得菌落數(96 h)極顯著高于其他5種培養(yǎng)基(P<0.01)。所分離菌落數溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基次之，為30～36 cfu，且隨時間增加變化不顯著(P>0.05)，其余4種培養(yǎng)基菌落數均較低，整體均處于20 cfu以下。

圖2 6種不同培養(yǎng)基于不同培養(yǎng)時間的平板菌落數注：數值為3個水樣平板菌落數的平均值，具有不同上標字母的平均值間差異顯著(P<0.05).

2.2 養(yǎng)殖水體異養(yǎng)菌種類組成

經外觀形態(tài)辨別后，挑選139株菌株經16S rRNA基因通用引物做PCR分析后送測序，共獲得118條有效序列。BLAST分析結果可分為4大類，分別屬于變形菌門(包括α-、γ-變形菌綱)，厚壁菌門(僅芽孢桿菌綱)，擬桿菌門(僅黃桿菌綱)，放線菌門(僅放線菌綱)。其中以γ-變形菌綱細菌為優(yōu)勢類群。所有菌株共分屬于24個屬，其中以假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)的菌株最多，為32株，弧菌屬(Vibrio)菌株次之，為29株。

不同培養(yǎng)基間比較發(fā)現(圖3，表1)，除營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基外，其余5種培養(yǎng)基均有弧菌屬細菌分離出，而假交替單胞菌僅2216E培養(yǎng)基分離出。其中：

① 2216E培養(yǎng)基所分離細菌送測80株，獲得64條有效序列，屬于變形菌門和擬桿菌門，分別占比93.75%和6.25%，屬于12個屬，假交替單胞菌屬為優(yōu)勢類群，占比50%，弧菌屬占比3.13%。

② 溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基所分離細菌送測16株，獲得15條有效序列，屬于變形菌門和擬桿菌門，分別占比80%和20%，屬于3個屬，弧菌屬為優(yōu)勢菌群，占比60%。

③ 腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基所分離細菌共送測18株，獲得18條有效序列，屬于變形菌門和厚壁菌門，分別占比66.67%和33.33%，屬于5個屬，弧菌屬為優(yōu)勢菌群，占比33.33%。

④ 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基所分離細菌送測4株菌，獲得4條有效序列，屬于變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，分別占比25%、50%、25%，屬于4個屬，弧菌數占25%。

⑤ 硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基所分離細菌送測13株，獲得11條有效序列，僅屬于1個屬，即變形菌門的弧菌屬。

⑥ 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基所分離細菌送測8株，獲得6條有效序列，屬于變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，各占比1/3，屬于3個屬，無弧菌分離出。

圖3 各培養(yǎng)基所分離菌株的種類組成左：按門劃分，右：按屬劃分

表1 6種不同培養(yǎng)基上可培養(yǎng)細菌的屬/種類型

3 討 論

水細菌是水域生態(tài)系統(tǒng)重要的礦化者, 同時也作為初級生產力成為部分微型浮游動物的餌料, 其活躍的代謝促進了系統(tǒng)中的物質循環(huán)和能量流動,維系著一個系統(tǒng)的正常運轉[12]。天然海水細菌種類多、分布廣，主要是弧菌科細菌、腸桿菌科細菌，其中尤以弧菌科數量最多[13-14]。而在養(yǎng)殖密集區(qū)水域，細菌類群種類比較豐富，它們多屬于假交替單胞菌屬和弧菌屬[15-16]，同時多數假單胞菌在工農業(yè)污水處理、消除環(huán)境污染中起重要作用[17-18]。本研究對大西洋鮭養(yǎng)殖水體異養(yǎng)細菌組成分析發(fā)現，假交替單胞菌屬和弧菌屬所屬細菌最多，可認為是大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體的兩類優(yōu)勢菌群。而變形菌門和厚壁菌門所占比最大，也與大菱鲆(Scophthalmusmaximus)養(yǎng)殖水體優(yōu)勢門組成一致[19]。

海水細菌與淡水或土壤細菌不同，大多數海水細菌為嗜鹽性菌，分解蛋白能力強，而分解糖能力較弱，能生長在低營養(yǎng)和低溫環(huán)境中。由于海水細菌的特殊性，分離培養(yǎng)海水細菌需要特殊培養(yǎng)基，且海水細菌在分離及傳代過程中易發(fā)生變異和死亡，給海水細菌研究工作帶來一定困難[13]。2216E培養(yǎng)基作為高鹽度寡營養(yǎng)的培養(yǎng)基，其營養(yǎng)特點適合海水環(huán)境菌的生長，所培養(yǎng)的異養(yǎng)菌菌落數極顯著高于其他5種培養(yǎng)基(P<0.01)，且隨培養(yǎng)時間的增加而顯著增加(P<0.05)，尤其假交替單胞菌在該環(huán)境下生長迅速，占50%，為養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌群。據文獻記載，培養(yǎng)基營養(yǎng)基質的含量最好與微生物自然生長環(huán)境相近[9]，且低含量基質的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細菌在數量和種類上均多于高含量基質的培養(yǎng)基[20]，本研究中，高營養(yǎng)培養(yǎng)基腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基平板中菌落數<20 cfu，分離細菌分屬于5個屬，低于2216E培養(yǎng)基所分離培養(yǎng)的菌落數和種類數，說明在寡營養(yǎng)的海水環(huán)境中的異養(yǎng)細菌不易在溶菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基上生長，但同時分離出3株芽孢桿菌屬細菌，均為對水體有機物有強烈分解能力的水體異養(yǎng)細菌。

養(yǎng)殖水體潛在病原菌情況的調查，對病害預警有一定的指示作用[7]。在除營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基外的5種培養(yǎng)基均有弧菌分離出，說明其在大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體中廣泛存在，為優(yōu)勢菌群。同時在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分離得到假單胞菌屬細菌，該種屬包括熒光假單胞菌(P.fluorescens)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)等致病性較強的水產動物病原菌[11]，因此作為潛在病原菌，其數量的監(jiān)測和控制措施的制定均值得重視。

本文研究了大西洋鮭循環(huán)水養(yǎng)殖水體的異養(yǎng)細菌的種類組成，為循環(huán)水養(yǎng)殖水質凈化和病害預警提供了一定的參考資料。后續(xù)研究應擴大調查取樣點，研究循環(huán)水不同水處理環(huán)節(jié)的異養(yǎng)細菌的數量和種類組成差異，為進一步豐富病害預警理論、評價循環(huán)水系統(tǒng)水處理效果提供數據支持。

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CompositionofHeterotrophicBacteriainaRecirculatingAquacultureSystemforAtlanticSalmon(Salmosalar)

WANG Xianping，LI Jie，HAN Houwei，HU Jiaping，ZHAO Lili，SHAO Wei, WANG Zhenyang

( Shandong Oriental Ocean Sci-Tech Co., Ltd，Yantai 264003，China )

The aim of this work was to study the composition of heterotrophic bacteria in a Recirculating Aquaculture System(RAS)for Atlantic salmon (Salmosalar) and to compare the difference in bacterial isolation and cultivation in different culture media. The bacteria in water samples collected from the tanks were cultured in 6 types of medium including 2216E, BHI, LB, NA, TSA, and TCBS, and composition and quantity of the bacteria were determined by a plate count method, bacterial morphological identification and 16S rRNA gene sequencing analysis method. It was found that the heterotrophic bacteria in the tank water were divided into 4 major groups: Proteobacteria (including the α-,γ-Proteobacteria)，Firmicutes, Bacteroidetes, and Actinobacteria, with the dominant γ-Proteobacteria, especially the generaPseudoalteromonasandVibrio. The plate colony numbers in different media were shown as the order of 2216E >LB >TSA>BHI>NA>TCBS，significantly higher in the 2216E than in the other 5 culture media (P<0.01). The bacteria isolated from 2216E culture medium belonged to 12 genera, the maximal becteria in genusPseudoalteromonasin accounting for 50% and genusVibriorepresenting only 3.13%. The genusVibriowas the dominant genus in various culture media, accounting for 33.33% in BHI, 60% in LB, 25% in TSA and 100% in TCBS (only one genusVibrio), but noVibriobutPseudomonaswas isolated from NA culture mediuma.

Atlantic salmon (Salmosalar); recirculating aquaculture system(RAS); composition of heterotrophic bacterium; different culture medium

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.003

S943

A

1003-1111(2016)03-0210-05

2015-07-08；

2015-10-08.

國家國際科技合作項目(2014DFA31030).

王先平(1987-)，男，助理工程師,碩士；研究方向：循環(huán)水養(yǎng)殖病害防控技術.E-mail：wxp_606@163．com.通訊作者：韓厚偉(1981-)，男，工程師，碩士；研究方向：循環(huán)水養(yǎng)殖技術.E-mail：hanhouwei@163.com.