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    引起鱘魚暴發(fā)性死亡病因分析

    2016-12-20 02:44:43王靜波徐立蒲王小亮
    中國水產(chǎn) 2016年12期
    關(guān)鍵詞:鱘魚海豚鏈球菌

    文/王靜波 賈 麗 曹 歡 徐立蒲 王小亮 張 文 王 姝

    引起鱘魚暴發(fā)性死亡病因分析

    文/王靜波賈麗曹歡徐立蒲王小亮張文王姝

    北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專欄

    2016年8月,河北省淶源縣一家鱘魚養(yǎng)殖場突發(fā)疾病,且出現(xiàn)大量死亡。為確定病原,從具有典型癥狀的患病魚的肝、腎和脾中進(jìn)行病原菌分離鑒定。經(jīng)28℃培養(yǎng)后,上述三個組織中均分離獲得大量形態(tài)一致菌落。肝、腎和脾分離的病原菌分別編號為LY160816L、LY160816K、LY160816S,經(jīng)形態(tài)特征、生理生化鑒定以及16SrDNA基因序列比對,鑒定結(jié)果為海豚鏈球菌。結(jié)合臨床癥狀,綜合判斷,導(dǎo)致該場鱘魚暴發(fā)性死亡的病因是感染了海豚鏈球菌。

    近年來,中國的鱘魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加。隨之而來的是養(yǎng)殖鱘魚的疾病爆發(fā)更加頻繁,嚴(yán)重制約鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。目前,已報(bào)道的鱘魚致病菌有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas carvia)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)、停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)和海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)。2016年8月,河北省淶源縣一家鱘魚養(yǎng)殖場鱘魚出現(xiàn)大量死亡,且持續(xù)時間長,累計(jì)死亡率達(dá)40%以上。其外觀癥狀主要表現(xiàn)為口周圍、腹部兩側(cè)骨板、肛門出血,疑似細(xì)菌感染。為了搞清病因,作者對具典型癥狀患病鱘魚進(jìn)行病原菌分離、生理生化鑒定以及16SrDNA基因序列比對。

    一、材料方法

    1.材料

    患病鱘魚來自河北省淶源縣鱘魚養(yǎng)殖場。鱘魚規(guī)格20cm~30cm。

    2.主要試劑

    腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基購于北京陸橋生物技術(shù)有限公司。革蘭氏染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基和API 20 STREP鑒定試劑條購于北京威泰科生物技術(shù)有限公司。UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒及PCR相關(guān)試劑購于上海生物工程有限公司。

    3.病原菌分離、純化

    取具典型癥狀的患病鱘魚,無菌操作從肝、脾和腎劃線分離于腦心浸液瓊脂(BHIA)平板和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基,于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20小時。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落于BHIA平板進(jìn)行純化。菌株編號為編號LY160816L、LY160816K、LY160816S。

    4.分離株的形態(tài)觀察和生理生化特征

    純化菌劃線分離于BHIA,28℃培養(yǎng)20小時觀察菌落形態(tài),進(jìn)行氧化酶、觸酶實(shí)驗(yàn)、革蘭氏染色和API 20 STREP細(xì)菌鑒定試劑條鑒定生化特征。

    5.分離株的PCR鑒定、16SrDNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

    病原菌的DNA模板制備采用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取,置于-20℃保存?zhèn)溆?。?xì)菌16SrDNA序列擴(kuò)增通用引物For:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',Rev:5'-TACGGCTACCTTGTTACGCTT-3'(退火溫度55℃),引物均由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50μ L,包括10×PCR緩沖液5μ L,25 mmol/L氯化鎂5μ L,5U/μ L Taq酶0.25μ L,10 mmol/L dNTP 1μL,模板DNA 2μL,20 pmol/μL上下游引物各2μL,DEPC水補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5分鐘,94℃變性1分鐘,退火溫度退火1分鐘,72℃延伸1分鐘,32個循環(huán)后72℃延伸10分鐘,4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后,由上海生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行基因序列測定。

    將分離菌的16SrDNA基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析,從中選取與所獲序列同源性較高的同種菌株的16SrDNA 基因序列,并從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得同屬相關(guān)種的16SrDNA序列,利用MEGA 4.0采用鄰位連接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,通過自舉分析進(jìn)行置信度檢測,自舉數(shù)集1000次。

    圖1 口周圍出血

    圖2 肝、性腺出血,脾腫大

    二、結(jié)果

    1.臨床癥狀

    患病魚外觀主要癥狀為口周圍、腹部兩側(cè)骨板、肛門出血,解剖后發(fā)現(xiàn)肝、性腺和腹腔內(nèi)膜有出血點(diǎn),脾腫大。

    2.分離株的形態(tài)特征與生化特征

    分離菌在BHIA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24小時的菌落特征為:白色、圓形、邊緣齊整、扁平、直徑約0.3mm~0.5mm。在血瓊脂平板上28℃培養(yǎng)24小時,菌落為圓形,中心白色,周邊半透明,形成β溶血環(huán)。氧化酶陰性,觸酶反應(yīng)陰性,革蘭氏染色陽性,卵圓形,呈鏈狀或雙排鏈狀(見圖3)。

    圖3 鱘腎臟分離菌的革蘭氏染色形態(tài)

    采用API 20 STREP 系統(tǒng)鑒定,菌株編號為LY160816L、LY160816K、LY160816S的三個樣品與Buller等報(bào)道的國外分離株的生化特征在β-葡萄糖醛酸酶、核糖和甘露醇項(xiàng)不同,而與Zhou等報(bào)道的中國分離株的生化特征完全一致。具體見表1。

    表1 分離菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

    3.16SrDNA 基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

    PCR擴(kuò)增分離株LY160816K的16SrDNA 基因片段約1500bp。PCR經(jīng)Blast同源性檢索,發(fā)現(xiàn)其與海豚鏈球菌的同源性最高,在99.2%以上;與副乳房鏈球菌的同源性為97.6%,與停乳鏈球菌的同源性為97.2%,與無乳鏈球菌的同源性為97.0%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,顯示其與海豚鏈球菌聚為一支。

    圖4 菌株LY160816K的16s DNA系統(tǒng)發(fā)育樹

    三、討論

    通過對具有典型臨床癥狀的發(fā)病鱘進(jìn)行病原菌初次分離,獲得大量形態(tài)一致的菌落。純化菌株的生化特征與從中國其它魚類分離的海豚鏈球菌一致,其16SrDNA基因序列與海豚鏈球菌的同源性在99.2%以上,綜合確定分離株為海豚鏈球菌。

    海豚鏈球菌自1976年從亞馬遜河豚(Inia geoffrensis)皮膚膿腫處分離,目前在全世界范圍內(nèi)流行,可感染海水、半咸水和淡水的二十多種養(yǎng)殖或野生魚類,每年對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失超過100億美元。但鏈球菌感染鱘魚的相關(guān)報(bào)道非常少。1993年,Kitao等暗示鱘魚也是鏈球菌感染的敏感對象。2006年,Roy和Ruth發(fā)現(xiàn)鏈球菌感染鱘魚病例,未確認(rèn)鏈球菌種類。2009年,潘厚軍等和楊五名等證實(shí)停乳鏈球菌分別是西伯利亞鱘和施氏鱘的致病菌。2013年,王小亮等在北京懷柔某漁場鱘魚體內(nèi)分離到海豚鏈球菌。但至今還未見鱘魚因感染海豚鏈球菌出現(xiàn)暴發(fā)性死亡病例的報(bào)道。

    鏈球菌在水體中普遍存在,屬于條件致病菌。當(dāng)養(yǎng)殖密度大,水質(zhì)環(huán)境差,水溫高時會引起養(yǎng)殖魚類感染。本漁場使用河道水進(jìn)行鱘魚養(yǎng)殖,在本次病害發(fā)生前,河道上游曾下暴雨,造成河道水出現(xiàn)渾濁,此水未經(jīng)沉淀直接進(jìn)入養(yǎng)殖池,隨后養(yǎng)殖鱘魚出現(xiàn)死亡,而且越發(fā)嚴(yán)重,累計(jì)死亡率達(dá)40%以上。同時,在發(fā)病后轉(zhuǎn)移到虹鱒魚養(yǎng)殖池的鱘魚體內(nèi)也分離到海豚鏈球菌,但是鱘魚未出現(xiàn)死亡。因此,根據(jù)檢測結(jié)果和結(jié)合臨床癥狀綜合分析,引起此漁場鱘魚暴發(fā)死亡原因?yàn)楦腥竞k噫溓蚓?,同時水質(zhì)環(huán)境變差,最終導(dǎo)致鱘魚出現(xiàn)大量死亡。

    作者單位:北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站

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