紫外分光光度法測定細葉亞菊總黃酮方法的建立

李廣彬，馬關(guān)田，楊相成，海福成，牛海榮

（西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州730124）

紫外分光光度法測定細葉亞菊總黃酮方法的建立

李廣彬，馬關(guān)田，楊相成，海福成，牛海榮

（西北民族大學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州730124）

目的：建立紫外分光光度法測定細葉亞菊總黃酮含量的方法.方法：對蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品和細葉亞菊提取液用4種顯色方法進行全波長掃描，每種顯色方法分別確定一個或兩個波長.在確定的各波長下，以蘆丁對照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測定細葉亞菊總黃酮含量.結(jié)果：確定了細葉亞菊總黃酮的含量測定方法，以蘆丁為對照品，檢測波長為362.0 nm，顯色劑為AlCl3－CH3OH.在此條件下測得的精密度RSD為1.11%，重復(fù)性RSD為1.08%，穩(wěn)定性RSD為0.84%，加樣回收率為98.70%.結(jié)論：該顯色方法操作簡便、精密度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強、回收率好.

細葉亞菊；總黃酮；蘆??；顯色方法

細葉亞菊（Ajania tenuifolia）為菊科（Asteraceae）亞菊屬（Ajania Poljak）植物.分布于中國大陸的西藏東部、青海、甘肅中部、四川西北部以及印度西北部等地區(qū)，生長于海拔2 000m至4 580m的地區(qū)，常生于山坡草地，是藏醫(yī)常用草藥［1］.味苦、性溫而平、具有止血、消腫等功效，尤其對瘡傷、腎病有益.細葉亞菊中含有綠原酸、揮發(fā)油和黃酮類化合物等活性物質(zhì)［2－4］，其中黃酮類化合物具有鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗輻射、利膽、強心、鎮(zhèn)痛、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用［5］.本文考察了紫外分光光度法測定細葉亞菊總黃酮的顯色劑和檢測波長，確立了含量檢測方法，以期為細葉亞菊總黃酮的開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細葉亞菊，2016年6月采自甘肅蘭州城關(guān)區(qū)，經(jīng)鑒定為亞菊屬植物細葉亞菊Ajania tenuifolia，干燥粉碎過80目篩.

蘆丁為純度≥99%的標(biāo)準(zhǔn)對照品（中國藥品生物制品檢定所），其他試劑均為上海士鋒生物科技有限公司生產(chǎn)的分析純，水為蒸餾水.

1.2 儀器與設(shè)備

AHK-4A型手提式粉碎機（廣州市旭朗有限公司），標(biāo)準(zhǔn)藥典篩（浙江五四儀器公司），DHG-9075A型干燥箱（上海恒儀公司），AB204-S型萬分之一分析天平（瑞士），SK82002H型超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器公司），Analytlk jena specord 50紫外可見分光光度儀（美國熱電公司）.

1.3 方法

1.3.1 細葉亞菊總黃酮提取液的制備［6］

精確稱取細葉亞菊粉末50 000g，加入30mL 95%乙醇溶液，在常溫下超聲提取，提取功率為500 W，提取時間為60min，用布氏漏斗抽濾并收集濾液于50mL容量瓶中.

1.3.2 顯色方法

直接顯色法：準(zhǔn)確移取提取液0.2mL于10mL容量瓶中，加入95%乙醇并定容至刻度線，靜置5 min后測吸光度.A1Cl3–CH3OH顯色法［7］：準(zhǔn)確移取提取液0.2mL于10mL容量瓶中，加入0.01 mol／mL的A1Cl3–CH3OH溶液并定容至刻度線，靜置10min后測吸光度.KOH顯色法［8］：準(zhǔn)確移取提取液0.2mL于10mL容量瓶中，加入1mL 95%乙醇搖勻，加入0.5mL 10%氫氧化鉀，充分搖勻.靜置5min后用95%乙醇定容至刻度線，靜置5min，測吸光度.NaNO2–A1（NO3）3顯色法［9］：準(zhǔn)確移取0.2mL提取液于l0mL容量瓶中，加入1mL蒸餾水，混勻后加入0.5mL5%NaNO2溶液.靜置5min后，加入0.5mL10%A1（NO3）3溶液.靜置5min后，加入2.5mL5%NaOH溶液，搖勻后用蒸餾水定容至刻度線，靜置10min，測吸光度.

1.3.3 波長掃描

將細葉亞菊乙醇提取液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品分別按1.3.2的顯色方法進行顯色反應(yīng)，在200nm～700nm波長范圍內(nèi)掃描最大吸收波長，最后每種顯色劑選取1至2個較為合適的波長.

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在1.3.3中確定的各波長下，用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在加入對應(yīng)的顯色劑顯色后，分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.5 精密度

準(zhǔn)確移取5份0.2mL提取液，按1.3.2所述四種顯色方法進行顯色，在確定的各波長下測吸光度，計算RSD值.

1.3.6 重復(fù)性

準(zhǔn)確稱取5份細葉亞菊粉末，質(zhì)量為5g，按1.3.1所述方法制備細葉亞菊總黃酮提取液，分別移取0.2mL提取液按1.3.2所述四種顯色方法進行顯色，在確定的各波長下測吸光度，計算RSD值.

1.3.7 穩(wěn)定性

準(zhǔn)確移取0.2mL提取液，按1.3.2所述四種顯色方法進行顯色，在確定的各波長下測吸光度，每隔5min測1次，測5次，計算RSD值.

1.3.8 回收率

以95%乙醇配制0.3mg／mL蘆丁對照品溶液，取0.1mL細葉亞菊乙醇提取液和0.1mL蘆丁對照品溶液分別按1.3.2所述四種顯色方法進行顯色，在確定的各波長下測吸光度，計算回收率.

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

細葉亞菊總黃酮提取液在四種顯色劑的作用下進行掃描，掃描結(jié)果如圖1、圖2、圖3、圖4所示.由于在各顯色劑的作用下，細葉亞菊總黃酮的吸光度在200nm～220nm時波動幅度較大.因此，根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，確定直接顯色法、A1Cl3–CH3OH顯色法、KOH顯色法、NaNO2–Al（NO3）3顯色法分別在250nm～700nm范圍內(nèi)選擇波長，所選的波長分別為259nm、362nm、398nm、275.0nm、402nm、351 nm.

2.2 四種顯色法下兩種對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在四種顯色劑作用及對應(yīng)掃描各波長下，共做出6條標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)性系數(shù)R2≥0.99，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系.因此，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程能較準(zhǔn)確地算出所測物質(zhì)的濃度，具體方程如表1所示，方法學(xué)驗證結(jié)果見表2.

由表2可知，NaNO2－Al（NO3）3顯色法在351.0nm處精密度和重復(fù)性偏大，回收率差，故此法不適用.KOH顯色法在275.0nm和402.0nm處精密度和重復(fù)性差（RSD＞3.5%）.用此法測出的結(jié)果波動幅度比較大.因此，此法也不適用.直接顯色法在336.0nm處重復(fù)性差，回收率偏大，故也不適用.AlCl3－CH3OH顯色法在398.0nm處重復(fù)性和回收率差，但在362.0nm處精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好（RSD＜2.5%），回收率也較好.因此細葉亞菊總黃酮較佳的測定方法為：檢測波長為362.0nm，顯色劑為AlCl3－CH3OH.

圖1 直接顯色法

圖2 AlCl3–CH3OH顯色法

圖3 KOH顯色法

圖4 NaNO2–A1（NO3）3顯色法

表1 四種顯色方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 方法學(xué)驗證結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用紫外可見分光光度法建立了一種快速簡便的測定細葉亞菊總黃酮含量的方法，即以蘆丁為對照品，在362.0nm處用AlCl3－CH3OH顯色檢測.在此條件下精密度RSD值為1.11%，重復(fù)性RSD值為1.08%，穩(wěn)定性RSD值為0.84%，回收率為98.70%，這些數(shù)據(jù)為細葉亞菊的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù).

［1］甄潤德，張樹源，白雪芳，等.細葉亞菊揮發(fā)油中抑制垂穗披堿草的化合物的分離與鑒定［J］.植物生理學(xué)報，1996，03：311-314.

［2］張占欣.三種菊科植物和一種玄參科植物化學(xué)成分及其生物活性研究［D］.蘭州大學(xué)，2008.12：263.

［3］張畢陽.高山寒漠帶黃花蒿和細葉亞菊揮發(fā)油成分的提取和研究［D］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.04：44.

［4］薛敬，盧永昌，薛楠.HPLC測定細葉亞菊中的綠原酸［J］.華西藥學(xué)雜志，2010，01：74-75.

［5］吳聰華，程華，李琳玲，姜德志，袁紅慧，程水源.藥用植物黃酮類化合物的提取方法［J］.武漢工程大學(xué)學(xué)報，2011，09：34-38.

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TQ9；Q939.9

A

1009-2102（2016）03-0007-04

2016-08-02

西北民族大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目（201610742061）.

李廣彬（1994—），男，河北衡水人.