小肝癌與不典型增生結(jié)節(jié)的差異糖蛋白篩選及其聚糖結(jié)構(gòu)鑒定

李 薇 張 舒 尚舒欣 金光植 秦 雪 叢文銘 劉銀坤

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所-教育部癌變與侵襲原理重點實驗室 上海 200032; 2 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032;3 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院病理科 上海 200438; 4 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床實驗室 南寧 530021)

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小肝癌與不典型增生結(jié)節(jié)的差異糖蛋白篩選及其聚糖結(jié)構(gòu)鑒定

李 薇1,2▲張 舒1▲尚舒欣4金光植3秦 雪4叢文銘3劉銀坤1,2△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所-教育部癌變與侵襲原理重點實驗室 上海 200032;2復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032;3第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院病理科 上海 200438;4廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床實驗室 南寧 530021)

目的 篩選不典型增生結(jié)節(jié)(dysplastic nodule,DN)和小肝癌(small hepatocellular carcinoma,sHCC)之間的差異糖蛋白,并分析其聚糖結(jié)構(gòu),為肝癌的早期診斷提供參考。方法 對DN和sHCC各15例的石蠟組織切片進行蛋白質(zhì)修復(fù)和提取;運用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定DN和sHCC中的差異糖蛋白;利用IPA分析差異糖蛋白功能與相關(guān)信號通路,篩選出與腫瘤相關(guān)的差異糖蛋白;純化目標(biāo)糖蛋白,優(yōu)化抗體輔助凝集素芯片技術(shù)(antibody overlay lectin microarray)分析其聚糖結(jié)構(gòu)。結(jié)果 本研究共鑒定到26個差異糖蛋白;IPA分析篩選得到腫瘤相關(guān)的重要差異糖蛋白為α-1 抗胰蛋白酶(α-1-antitrypsin,A1AT)和補體C3;相比于DN,sHCC中A1AT與凝集素CAL、GSL I、JAC、GSL II、PHA-L、GNL、WGA等親和的聚糖結(jié)構(gòu)增多,C3與CSL、LTL、WFL親和的聚糖結(jié)構(gòu)增多,此結(jié)果說明在sHCC中,A1AT的T/Tn抗原、三/四天線的N-聚糖結(jié)構(gòu)、高甘露糖和唾液酸等結(jié)構(gòu)的含量增加;而C3的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、Lewis X 抗原[Fucα3(Galβ4)GlcNAc]、H-type 2 抗原[Fucα2(Galβ4)]和半乳糖β(1,3/1,6) 連接N-乙酰半乳糖[Galβ3(-6)GalNAc]結(jié)構(gòu)增多。結(jié)論 在DN和sHCC中,A1AT、C3聚糖結(jié)構(gòu)的變化可能為肝癌早期診斷提供新的糖生物學(xué)標(biāo)志物。

不典型增生結(jié)節(jié); 小肝癌; 差異糖蛋白; 凝集素

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種多基因、多因素、病理機制復(fù)雜的常見惡性腫瘤。肝硬化到肝癌的階段可分為肝硬化、不典型增生結(jié)節(jié)(dysplasticnodule,DN)和小肝癌(small hepatocellular carcinoma,sHCC)的發(fā)展過程。不典型增生結(jié)節(jié)(dysplastic nodule,DN)發(fā)生在HBV、HCV感染的肝臟,繼而發(fā)展成為sHCC并進入進展期。硬化肝中的不典型增生結(jié)節(jié)DN被公認為是肝癌癌前病變的標(biāo)志物。理想的肝癌標(biāo)志物需有較高的特異性和敏感性,能夠在肝癌早期提示診斷。目前可利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)定性定量檢測差異蛋白質(zhì),篩選出具有臨床標(biāo)志意義的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子。

糖基化(glycosylation)是常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,在一系列糖基轉(zhuǎn)移酶作用下形成不同的糖鏈(glycan)。糖鏈在很多關(guān)鍵的生物學(xué)過程中起到重要作用,如細胞黏附、分子運輸和清除、受體激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及內(nèi)吞作用等。糖鏈的變化還與惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān),某些抗原決定簇,如sialyl Lewis X (sLex)、sialylated Tn (sTn)和Lewis Y (Ley),常出現(xiàn)于惡性腫瘤中。研究差異糖蛋白在肝病進程中的變化可從糖基化修飾的狀態(tài)著手,為肝病進展的動態(tài)監(jiān)測提供可能。

抗體輔助的凝集素芯片技術(shù)(圖1)是以凝集素芯片為基礎(chǔ),用于研究目標(biāo)糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)的新型技術(shù),它將凝集素芯片與樣品孵育后,繼續(xù)與目標(biāo)蛋白抗體反應(yīng),得到目標(biāo)糖蛋白的糖鏈結(jié)構(gòu)信息[1]。

本研究旨在通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合抗體輔助的凝集素芯片技術(shù),尋找區(qū)分sHCC與DN的差異糖蛋白,并解析關(guān)鍵糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)。以期為肝癌的早期診斷及進一步揭示肝癌致病機制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

試劑 FFPE組織蛋白提取緩沖液及TEAB(美國Sigma公司);Pierce Direct IP Kit、BCA蛋白定量試劑(美國Thermo公司);iTRAQ Reagent Kit(美國Applied Biosystems公司);乙腈(德國Merck公司);蛋白酶抑制劑(不含EDTA)和測序級胰蛋白酶(瑞士Roche公司);乙醇、乙酸、異丙醇均為國產(chǎn)分析純;考馬斯亮藍R350(美國GE公司);C-18脫鹽柱(美國Waters公司);抗A1AT抗體、抗C3抗體(英國Abcam公司); Lighting Link Rapid Conjugation System(英國Innova Biosciences公司);兔血清(上海鈺森生物技術(shù)有限公司);人血清多克隆IgG、Durapore PVDF表面濾膜(33 mm,0.45 μm,美國Millipore公司);Lowbind低吸附管(德國Eppendorf公司)。

儀器 Thermo Scientific Savant DNA SpeedVac離心濃縮系統(tǒng)(美國Thermo公司);色譜儀采用Prominence UFLC系統(tǒng)(日本SHIMAZU公司),強陽離子交換柱(Polysulfoethyla譜柱,2.1 mm×100 mm,5 μm,20 nm,美國Nest Group公司),反相色譜柱(ZORBAX 300SB-C18譜柱,5 μm,30 nm,0.1×15 mm,德國Microm公司),QSTAR XL LC/MS/MS(美國Applied Biosystems公司);熒光掃描儀LuxScan 10K-A(博奧生物集團有限公司)。

樣本篩選 DN和sHCC病灶各15例,蠟塊組織切成7 μm,載于玻片后,60 ℃烘干直至切片組織與載玻片之間無氣泡。切片置于二甲苯中進行1次脫蠟(20 min)。95%乙醇和75%乙醇各1 min使之水化,流水沖洗。熱風(fēng)烘干后對病灶部分進行精確切割。對蛋白進行修復(fù)和提取,異丙醇沉淀,采用BCA試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析 每組100 μg總蛋白進行還原烷基化,胰蛋白酶酶解過夜,進行標(biāo)記反應(yīng)。采用陽離子交換色譜和反相色譜分別進行分離后,通過在線連接的QSTAR XL MS/MS質(zhì)譜儀進行串聯(lián)質(zhì)譜分析,在信息依賴性獲取模式(information dependent acquisition mode,IDA)下進行。原始數(shù)據(jù)利用Applied Biosystems ProteinPilot software 3.1進行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的搜索和差異蛋白質(zhì)篩選。根據(jù)Swiss Prot(http://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫對iTRAQ篩選的差異蛋白質(zhì)進行糖基化修飾檢索,再根據(jù)NetNGlyc 1.0 Server、NetOGlyc 4.0 Server數(shù)據(jù)庫對篩選結(jié)果進行閾值檢驗,對最終結(jié)果進行IPA分析。

抗體輔助的凝集素芯片技術(shù) 使用Pierce Direct IP Kit 分離純化A1AT和C3,使用Lightning Link Rapid Conjugation System 標(biāo)記試劑盒,分別對兩種糖蛋白的蛋白質(zhì)抗體進行Cy5標(biāo)記。標(biāo)記后體系中A1AT抗體濃度為1.67 mg/mL,C3抗體濃度為0.89 mg/mL。選擇條件優(yōu)化后的最佳封閉劑、孵育液及抗體濃度。PBSTx稀釋蛋白質(zhì)樣品,取70 μL覆蓋點樣區(qū),20°C濕盒孵育12 h,PBSTx清洗芯片5 min,重復(fù)3次,甩干。取純兔血清70 μL覆蓋點樣區(qū),室溫濕盒孵育0.5 h,PBSTx清洗芯片5 min,重復(fù)3次,甩干。使用A1AT、C3 的Cy5標(biāo)記抗體按1∶100稀釋,PBSTx稀釋后各取70 μL覆蓋點樣區(qū),室溫濕盒孵育1 h,甩干孵育液,PBSTx清洗芯片5 min,重復(fù)3次,甩干。將芯片插入熒光掃描儀LuxScan 10K-A,打開掃描軟件LuxScan 3.0,設(shè)置掃描條件Power=20,PMT=650,分辨率為5 μm,掃描信號后提取相應(yīng)數(shù)據(jù),信噪比≥1.5為陽性點,取每6個重復(fù)點的信噪比數(shù)值計算均值。

結(jié) 果

差異糖蛋白篩選 通過3次生物學(xué)重復(fù)實驗,共鑒定得到:相對于DN,18個糖蛋白在sHCC中表達升高,8個則降低(表1)。

Function條形圖顯示這些差異糖蛋白可能與多種疾病相關(guān)聯(lián),并且富集于每種疾病的差異糖蛋白分布較均勻。這些相關(guān)的疾病與功能包括：癌癥、肝臟系統(tǒng)的發(fā)育與功能及相關(guān)肝臟疾病、細胞的生長增殖和生存死亡、細胞間的相互作用與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成等(圖2A)。Pathway條形圖分析發(fā)現(xiàn)較多差異糖蛋白集中在LXR/RXR的激活作用和急性應(yīng)答信號通路上(圖2B)。IPA的網(wǎng)絡(luò)分析圖提示,sHCC中表達升高的A1AT與ERK1/2、IL-1、VEGF、促炎因子和MMP相關(guān)。另一上調(diào)蛋白質(zhì)C3與ERK1/2、P38MAPK、IL-1、VEGF和促炎因子相關(guān)(圖2C)。

這些信號通路或細胞因子與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如與A1AT、C3關(guān)聯(lián)的ERK1/2是常在腫瘤中呈異常活化狀態(tài)的信號通路,VEGF/VEGFR-2介導(dǎo)的信號通路可以調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移,這些信號通路均有利于腫瘤細胞的擴散、轉(zhuǎn)移。這說明A1AT與C3是可以直接或間接參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性分子。

表1 在sHCC中表達上調(diào)和下調(diào)的糖蛋白(相對于DN)

抗體輔助的凝集素芯片技術(shù)的優(yōu)化 為精確檢測FFPE組織蛋白中目標(biāo)糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu),對抗體輔助的凝集素芯片技術(shù)中的封閉劑、孵育緩沖液和抗體濃度進行了優(yōu)化,并確定了樣品檢測限。

封閉劑的優(yōu)化 蛋白質(zhì)樣品孵育后將殘余的凝集素位點掩蓋,以防止Cy5標(biāo)記的抗體與之結(jié)合而導(dǎo)致假陽性。常用的封閉劑為人血清多克隆IgG、鼠或兔多克隆IgG[2-3]。本次實驗中使用純兔血清和人類血清多克隆IgG作為封閉劑,比較發(fā)現(xiàn)人血清多克隆IgG封閉后的芯片熒光背景值大于純兔血清,帶有熒光信號的凝集素樣品數(shù)也較多(圖3),說明封閉效果不及純兔血清,故選擇純兔血清作為封閉劑。

孵育緩沖液的優(yōu)化 為確定不同濃度的非離子型去垢劑調(diào)配的孵育液以及常用凝集素芯片孵育液中BSA的使用對孵育效果的影響,比較0.01%、0.1%、1% TritonX 100-PBS,0.01%、0.1%、1%及Tween 20-PBS,1% BSA+1% TritonX 100-PBS及1% BSA + 1% Tween 20-PBS這8種孵育緩沖液的孵育效果。選取熒光信號較佳的凝集素GNL、HHL、HAL、NML,發(fā)現(xiàn)信號主要隨非離子型去垢劑濃度提高而增強;在TritonX 100/Tween 20濃度較低時,Tween 20的孵育效果較好,而當(dāng)其濃度達到1%時,二者效果相當(dāng)。傳統(tǒng)凝集素芯片的孵育緩沖液使用BSA,而本實驗發(fā)現(xiàn)加入BSA的效果不及單一使用非離子型去垢劑的效果,說明BSA的使用可能導(dǎo)致過度封閉而減弱信號。本次實驗選擇使用效果較好的1% TritonX 100-PBS作為孵育緩沖液(圖4)。

A:Function analysis of differential glycoproteins between DN and sHCC.B:Pathway analysis of differential glycoproteins between DN and sHCC.The quantity of glycoproteins corresponding to pathway was positively related to the depth of color.C:Network of signaling pathways and differential glycoproteins.Red represented up-regulated expression,and green represented down-regulated expression.The level of regulation was positively related to the depth of color.

圖2 DN與sHCC中的差異糖蛋白IPA分析

Fig 2 IPA for differential glycoproteins between DN and sHCC

Detected by Cy5 labeled anti-C3 antibody (resolution:5 μm).

圖3 人類血清多克隆IgG和純兔血清的封閉效果

Fig 3 Blocking with human serum polyclonal IgG and pure rabbit serum

抗體濃度的優(yōu)化 以1∶400、1∶200、1∶100、1∶50、1∶25稀釋Cy5標(biāo)記的A1AT、C3抗體,平均熒光強度隨抗體濃度的改變發(fā)生變化。對于A1AT抗體,GNL、HHL的平均熒光強度隨抗體濃度升高而增強,在1∶100時,信號強度進入平臺期;而對于C3抗體,HAL、NML的熒光信號最初隨抗體濃度升高而增強,但并非抗體濃度越大其信號越強,而是在1∶200～1∶100間信號最佳。因此,選擇1∶100作為A1AT和C3的抗體稀釋倍數(shù)(圖5)。

樣品檢測限的確定 使用濃度為10、102、103、104、105ng/mL的蛋白質(zhì)樣品進行檢測,發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)濃度為10 ng/mL時即有檢測信號,并且熒光檢測信號隨樣品濃度的提高而增強(圖6),說明本實驗所用凝集素芯片及實驗方法具有較高的靈敏度。

分析比較A1AT和C3聚糖結(jié)構(gòu)的變化 本研究采用DN和sHCC石蠟組織切片各15例,每5例混合,生物學(xué)重復(fù)3次(第1次:5例DNvs.5例sHCC; 第2次:5例DNvs.5例sHCC;第3次:5例DNvs. 5例sHCC)。分別從DN、sHCC組織切片中提取蛋白質(zhì),再分別純化得到A1AT和C3,采用優(yōu)化后的抗體輔助的凝集素芯片技術(shù)進行聚糖結(jié)構(gòu)檢測,其中凝集素芯片為本實驗室自行點制,具有50種凝集素。圖7A為凝集素微陣列對照表;圖7B為2張凝集素芯片結(jié)合信號強度圖,左圖為DN中A1AT的聚糖結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果,右圖為sHCC中A1AT的聚糖結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果;圖7C顯示A1AT在DN、sHCC中結(jié)合的18種具有統(tǒng)計學(xué)差異的凝集素。表2則詳細顯示出這18種凝集素名稱及其識別的聚糖結(jié)構(gòu)。3次重復(fù)實驗結(jié)果顯示:相對于DN,在sHCC中,A1AT對凝集素CFL、RCAI、SJA、VVL的親和作用減弱;而對凝集素BPL、CAL、CSL、DBA、GNL、GSL Ⅰ、GSL Ⅱ、HPL、JAC、LPL、PHA-L、PTL2、VAL、WGA的親和作用增強。此結(jié)果提示在sHCC中,A1AT的半乳糖β1,4連接的N-乙酰半乳糖胺(Galβ1,4GlcNAc)、末端連接的N-乙酰半乳糖胺(α/β-linked terminal GalNAc)結(jié)構(gòu)減少;而半乳糖β1,3連接的N-乙酰半乳糖胺(Galβ1,3GalNAc)、黏蛋白T/Tn抗原(T/Tn antigen)、三/四天線復(fù)雜型N-聚糖(Tri/tetra-antennary complex-type N-glycan)、高甘露糖(High mannose)和唾液酸(NeuAc)結(jié)構(gòu)增多。

GNL (A) and HHL (B) were incubated with A1AT in 8 kinds of incubation buffer (S/N≥1.5).HAL (C) and NML (D) were incubated with C3 in 8 kinds of incubation buffer (S/N≥1.5).

圖4 優(yōu)化用于抗體輔助凝集素芯片技術(shù)的孵育緩沖液

Fig 4 Optimization of incubation buffer for antibody overlay lectin microarray

GNL (A) and HHL (B) were incubated with different concentrations of anti-A1AT antibody (S/N≥1.5).HAL (C) and NML (D) were incubated with different concentration of anti-C3 antibody (S/N≥1.5).

圖 5 優(yōu)化用于抗體輔助凝集素芯片技術(shù)的抗體濃度

Fig 5 Optimization of antibody concentration for antibody overlay lectin microarray

A: The limits of detection for A1AT was detected,and the mean fluorescence intensities were increased with elevated concentrations of sample (S/N≥1.5).B: The limits of detection for C3 was detected,and the mean fluorescence intensities were increased with elevated concentrations of sample (S/N≥1.5).

圖6 抗體輔助凝集素芯片技術(shù)的樣品檢測限

Fig 6 Limit of detection for antibody overlay lectin microarray

A:The lectin microarray contains 50 lectin spots with different binding specificities;B:Signals of A1AT in DN and sHCC;C:The altered glycan structures of A1AT were detected in sHCC compared with DN ((1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001).

圖7 A1AT在DN和sHCC中的聚糖結(jié)構(gòu)變化

Fig 7 Glycan structure analysis of A1AT in DN and sHCC

圖8B顯示C3在DN(左圖)和sHCC(右圖)中的聚糖結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果。圖8C顯示相對于DN,C3在sHCC中結(jié)合的5種具有統(tǒng)計學(xué)差異的凝集素,表3詳細列出了這5種凝集素名稱及其親和的聚糖結(jié)構(gòu)。分析結(jié)果顯示,相對于DN,在sHCC中,C3對凝集素SNA、VAL的親和作用減弱;對凝集素CSL、LTL、WFL的親和作用增強。說明在sHCC中,C3的Sialyl-Tn(Siaα2-6GalNAc),β連接的N-乙酰半乳糖胺(βGalNAc)結(jié)構(gòu)減少;而N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、Lewis X 抗原[Fucα3(Galβ4)GlcNAc]、H-type 2 抗原[Fucα2(Galβ4)GlcNAc]、半乳糖β(1,3/1,6)連接的N-乙酰半乳糖胺[Galβ3(-6)GalNAc]結(jié)構(gòu)增多。

討 論

糖基化修飾調(diào)控多種細胞功能,與多種病理生理過程(如細胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移)相聯(lián)系[4]。糖蛋白/糖標(biāo)志物是可靠的預(yù)測標(biāo)志物[5],可以彌補AFP在早診中的不足(敏感性41%～65%)[6-7]。目前用于區(qū)分診斷肝癌和DN的分子標(biāo)記物(如HSP70、GPC3、CD34等)的特異性和靈敏度均不夠理想。另有研究報道血清中的某些miRNA可作為診斷DN和早期肝癌的指標(biāo)[8],但尋找差異糖蛋白及聚糖結(jié)構(gòu)的改變作為區(qū)分診斷sHCC和DN的分子標(biāo)記物的研究尚不多見。

表2 與A1AT反應(yīng)的18種凝集素及其特異性結(jié)合的聚糖結(jié)構(gòu)

表3 與C3反應(yīng)的5種凝集素及其特異性結(jié)合的聚糖結(jié)構(gòu)

本研究的IPA分析結(jié)果顯示,A1AT、C3與多種信號通路相關(guān),包括ERK1/2、IL-1、VEGF、P38MAPK等常在腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)過程中被激活的通路,其中ERK1/2、P38MAPK與細胞周期、生存、分化、衰老、凋亡密切相關(guān)[9-10];IL-1與慢性炎癥有關(guān),增加了致瘤突變導(dǎo)致腫瘤的風(fēng)險[11];VEGF與腫瘤的病理性生長有關(guān),能促進細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[12]。

在DN演化至sHCC的過程中,A1AT的T/Tn抗原增多,而T/Tn抗原是腫瘤特異性的O-聚糖結(jié)構(gòu),常出現(xiàn)在腫瘤晚期[13],在結(jié)腸癌[14]、胃癌[15]、胰腺癌[16]中表達上調(diào),可促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Niang等[17]發(fā)現(xiàn)在人類乳腺癌細胞中,用VVL識別到α/β-linked terminal GalNAc即O-GalNAc(Tn)抗原,Tn抗原修飾關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子FOXA1從而促使雌激素應(yīng)答基因的表達,利于癌發(fā)展,說明其與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。而本次實驗中卻發(fā)現(xiàn)在惡性程度較高的sHCC中,此結(jié)構(gòu)含量較DN減少,可能與不同癌種在發(fā)展進程中存在差異有關(guān)。

唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST6GalNAc I將唾液酸添加到Tn上形成Sialyl-Tn,改變了癌細胞之間、癌細胞與胞外基質(zhì)間的相互作用,從而促進侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。除此之外,sialyl Lewis X/sialyl Lewis A也是作為細胞黏附分子的配體,其過表達促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[19]。

A:The lectin microarray contains 50 lectin spots with different binding specificities; B:Signals of C3 in DN and sHCC;C:The altered glycan structures of C3 were detected in sHCC compared with DN.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖8 C3在DN和sHCC中的聚糖結(jié)構(gòu)變化

Fig 8 Glycan structure analysis of C3 in DN and sHCC

這些說明唾液酸的增加與細胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。此外,N-聚糖三、四天線的增加利于腫瘤轉(zhuǎn)移,已有報道顯示人和鼠的肝癌中高甘露糖增多。

與凝集素RCAⅠ親和的聚糖結(jié)構(gòu)是Galβ4GlcNAc, A1AT的此聚糖結(jié)構(gòu)在sHCC中含量減少。Zhou等[20]研究中發(fā)現(xiàn)其在三陰性乳腺癌中表達并與轉(zhuǎn)移能力呈負相關(guān),它的表達能夠抑制癌細胞的侵襲、運動、黏附和識別膜蛋白的能力。說明與RCAⅠ親和的聚糖結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的作用。這與我們的實驗結(jié)果相符,惡性程度更高的sHCC中Galβ4GlcNAc的表達降低。

在C3的聚糖結(jié)構(gòu)變化中,H-type 2抗原和Lewis X抗原的含量在sHCC中升高。H-抗原與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān),含量增加會導(dǎo)致腫瘤惡化,家族成員H-type 2抗原在腫瘤組織中過表達;Lewis X則在多種癌中表達上升,以上說明它們的表達與腫瘤發(fā)展相關(guān)[21]。

在sHCC中,C3上的α2,6唾液酸(Siaα2-6GalNAc)結(jié)構(gòu)較DN減少。研究發(fā)現(xiàn)α2,6唾液酸在轉(zhuǎn)移性肝癌中表達下調(diào)[22];而Li等[23]也指出α2,6唾液酸在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移的EMT細胞中表達減少。這說明α2,6唾液酸結(jié)構(gòu)的表達并非完全與肝癌的惡性程度呈正相關(guān)。

本研究通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定了DN和sHCC的26個差異糖蛋白。利用IPA分析,發(fā)現(xiàn)差異糖蛋白A1AT和C3參與的信號通路ERK1/2、IL-1、VEGF、P38MAPK均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。進而比較分析了A1AT和C3的聚糖結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)多種與腫瘤發(fā)展相關(guān)的糖型含量在sHCC中增多,同時發(fā)現(xiàn)sHCC中C3的α2,6唾液酸結(jié)構(gòu)相對DN減少。這些差異聚糖結(jié)構(gòu)可作為區(qū)分診斷DN和sHCC的潛在標(biāo)志物,從而使肝癌的早期診斷更具針對性和特異性。

致謝 晏國全老師在定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析上給予指導(dǎo)與幫助;張揚老師在IPA生物信息學(xué)分析上給予指導(dǎo)與幫助;李巖老師在石蠟組織的蛋白質(zhì)修復(fù)與提取的實驗技術(shù)上給予指導(dǎo)和幫助。

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Glycan structure analyses of differential glycoproteins for distinguishing small hepatocellular carcinoma from dysplastic nodules

LI Wei1,2▲, ZHANG Shu1▲, SHANG Shu-xin4, JIN Guang-zhi3, QIN Xue4,CONG Wen-ming3, LIU Yin-kun1,2△

(1KeyLaboratoryofCarcinogenesisandCancerInvasion,MinistryofEducation-LiverCancerInstitute,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2InstitutesofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China;3DepartmentofPathology,EasternHepatobiliarySurgeryHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200438,China;4DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,GuangxiProvince,China)

Objective To screen differential glycoproteins between dysplastic nodule (DN) and small hepatocellular carcinoma (sHCC) and to analyze glycan structures for early diagnosis of hepatocellular carcinoma (HCC). Methods Tissue proteins were repaired and extracted from 15 cases of paraffin embedded tissues of DN and sHCC,respectively.Quantitative proteomics technology was used to identify differential glycoproteins between DN and sHCC.The function and related signaling pathways of differential glycoproteins were analyzed with ingenuity pathway analysis (IPA) to find target glycoproteins associated with tumorigenesis and tumor progression.Optimized antibody overlay lectin microarray was applied to analyze glycan structures of target glycoproteins which were purified from paraffin embedded tissues. Results Twenty-six differential glycoproteins were identified by quantitative proteomics technology.Alpha-1-antitrypsin (A1AT) and complement C3 were found to be associated with tumorigenesis and tumor progression using IPA.Compared with DN,lectins CAL,GSL Ⅰ,JAC,GSL Ⅱ,PHA-L,GNL and WGA showed increasing trend in A1AT of sHCC.This implied that glycans containing T/Tn antigen,tri- or tetra-antennary N-glycan,high mannose structure and NeuAc were increased in A1AT of sHCC.Meanwhile,the binding abilities of CSL,LTL and WFL were increased in C3 of sHCC,which showed that the GalNAc,Lewis X,H-type 2 antigen and Galβ3(-6)GalNAc were increased in C3 of sHCC. Conclusions Glycan structures variation of A1AT and C3 between DN and sHCC may contribute to establishment of novel glycobiomarkers for early diagnosis of HCC.

dysplastic nodule; small hepatocellular carcinoma; differential glycoproteins; lectin

國家自然科學(xué)基金(21505022)

R44, R73

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.001

2016-03-08;編輯:段佳)

▲LI Wei and ZHANG Shu contributed equally to this work

△Corresponding author E-mail:liu.yinkun@zs-hospital.sh.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (21505022).