蔞蒿乙酸乙酯部位體外抗乙型肝炎病毒的實驗研究*

羅文艷　段和祥

（1南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥劑科　江西　南昌　330003；2江西省藥品檢驗檢測研究院　南昌　330029）

蔞蒿乙酸乙酯部位體外抗乙型肝炎病毒的實驗研究*

羅文艷1段和祥2#

（1南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院藥劑科江西南昌330003；2江西省藥品檢驗檢測研究院南昌330029）

目的：研究蔞蒿乙酸乙酯部位體外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。方法：蔞蒿藥材用95%乙醇提取后，用乙酸乙酯萃取獲得有效部位，作用于HBV-DNA轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細胞上。采用MTT法檢測乙酸乙酯部位對HepG2.2.15細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），用ELISA法觀察乙酸乙酯部位對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg表達的抑制作用。結(jié)果：蔞蒿乙酸乙酯部位對HepG2.2.15細胞有一定的細胞抑制作用，對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg表達有不同程度的抗原抑制作用。結(jié)論：蔞蒿乙酸乙酯部位有較強的抗乙型肝炎病毒作用。

乙型肝炎病毒；蔞蒿乙酸乙酯部位；乙型肝炎病毒表面抗原；乙型肝炎病毒e抗原

1　儀器與材料

1.1儀器設(shè)備Forma3131三氣細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fishier公司），ST-360酶標儀（上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司），ST16R低溫離心機（Thermo Fishier公司），Synergguv超純水儀（Millipore公司），凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2材料蔞蒿藥材采自鄱陽湖畔草灘，經(jīng)江西省藥品檢驗檢測研究院袁桂平主任中藥師鑒定為菊科蒿屬植物蔞蒿的全草。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國GIBCO公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑藍（MTT）均購于Sigma公司；青霉素、鏈霉素（上海先鋒藥業(yè)有限公司）；HBsAg檢測試劑盒、HBeAg檢測試劑盒（美國BD公司）；其余試劑均為分析純。

1.3細胞株及細胞培養(yǎng)HepG2.2.15是HBV-DNA細胞轉(zhuǎn)染HepG2而建立的HepG2.2.15細胞株，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與醫(yī)學(xué)輻射學(xué)研究所提供，培養(yǎng)基為DMEM高糖型培養(yǎng)基，含10% FBS，0.2 mg/ml的G418，用前加入100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素。

2　方法

2.1樣品的制備稱取鮮蔞蒿1.0 kg，切碎，晾干，用95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并回流液，回收乙醇，濃縮至干浸膏，加適量的水使溶解，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，棄去石油醚與三氯甲烷萃取液，取乙酸乙酯萃取液，濃縮蒸干，即得蔞蒿的乙酸乙酯部位。

2.2細胞培養(yǎng)在長滿HepG2.2.15細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.25%胰蛋白酶消化、傳代、保種。取對數(shù)生長期的細胞用DMEM高糖型培養(yǎng)基制備成1×105個/ml的混懸液，按每孔100 μl接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞長成單層后，每孔加入含有不同濃度的藥物（蔞蒿乙酸乙酯部位用培養(yǎng)基系列倍比稀釋，制備成0.004、0.02、0.1、0.5、2.5、12.5、62.5 mg/ml等7個不同濃度），每個濃度平行4個孔。同時設(shè)細胞對照組（不含藥液的細胞培養(yǎng)液）及空白對照組（僅含培養(yǎng)液）。將96孔細胞培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天更換1次新鮮的培養(yǎng)液，10 d后，取上清液，用ELISA法計算抗原抑制率，余下細胞用MTT法測定半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3細胞培養(yǎng)結(jié)果測定取“2.2”項下的上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，采用酶標儀于450 nm的波長處測定OD值。余下細胞，每孔加0.2 ml新鮮配制的含有0.2 ml MTT的無血清培養(yǎng)基，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，以3 000 r/min的速度離心5 min，倒出上清液，加0.2 ml DMSO溶解MTT甲臜沉淀，超聲5 min后，用酶標儀于570 nm下測定OD值。按（1-OD給藥組/OD對照組）×100%計算抑制率。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，試驗數(shù)據(jù)均以（±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

藥液對HepG2.2.15細胞的IC50值為2.55 mg/ml，對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg的IC50值分別為48.52 mg/ml和1.86 mg/ml。見表1。

表1　蔞蒿提取物乙酸乙酯部位對HepG2.2.15細胞及其分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用（±s）

表1　蔞蒿提取物乙酸乙酯部位對HepG2.2.15細胞及其分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

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4　討論

由表1的結(jié)果可見，蔞蒿提取物乙酸乙酯部位對HepG2.2.15細胞及其分泌HBsAg、HBeAg具有明顯的抑制作用，并且抑制率的大小與濃度成正比。這為進一步分離、純化、鑒定乙酸乙酯部位抗乙型肝炎病毒的活性成分提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。本課題組前期研究了蔞蒿乙酸乙酯部位的化學(xué)成分，并首次從蔞蒿藥材中分離鑒定出反式白藜蘆醇等11種化學(xué)成分[8]。白藜蘆醇是一種生物活性很強的天然多酚類物質(zhì)，查閱相關(guān)文獻[9]，也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇及其衍生物有一定的抗乙型肝炎病毒的作用。

乙型肝炎是一種損害肝臟的病毒感染，可造成急性或慢性疾病。從中國疾病預(yù)防控制中心獲悉，我國現(xiàn)有約9000萬慢性乙肝病毒感染者，其中約2800萬為慢性乙肝患者，每年約有90萬發(fā)展為肝硬化，約30萬發(fā)展為原發(fā)性肝癌。在全球肝癌發(fā)病和死亡人數(shù)最多的20個國家中，我國排在首位。我國人口約占全球人口的20%，但肝癌發(fā)生及死亡人數(shù)占全球的50%以上。雖然我國中藥資源非常豐富，但從廣闊的中藥資源庫中研究并開發(fā)出一種高效低毒的抗HBV的藥物，還有很長一段路要走。

目前，通常是利用活性指導(dǎo)下的靶向追蹤分離技術(shù)，把目標藥物作用于HBV-DNA轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細胞，用MTT法檢測目標藥物對HepG2.2.15細胞的IC50，用ELISA法觀察目標藥物對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg表達的抑制作用。本研究結(jié)果為進一步研究抗乙型肝炎病毒的活性化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，得到一系列抗乙型肝炎病毒的活性成分，研究和開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高效低毒的抗腫瘤藥物奠定了基礎(chǔ)。

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Experimental study on Ethyl Acetate Fraction from Artemisia selengensis anti-HBV in vitro

LUO Wen-yan1,DUAN He-xiang2#
(1Department of Pharmacy,The Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang330003; 2Jiangxi Institute for Drug Control,Nanchang330029)

Objective:To study the effect of ethyl acetate from Artemisia selengensis anti-HBV in vitro.Methods:After the Artemisia selengensis were extracted with 95%ethanol,extracted with ethyl acetate.Then the effective part was acted on HBV-DNA transfected HepG2.2.15 cells.MTT assay was used to detect ethyl acetate fraction inhibitory concentration 50%of HepG2.2.15 cells. ELISA method was used to investigate the suppressor effect on HBsAg and HBeAg in the cultured HepG2.2.15 cells which were gene transferred with HBV.Results:Ethyl acetate fration from Artemisia selengensis have a certain cell inhibitory effect on HepG2.2.15 cells. HepG2.2.15 cells the secretion of HBsAg and HBeAg express different degrees of antigen inhibition.Conclusion:The ethyl acetate from Artemisia has strong anti HBV effect.

HBV;Ethyl Acetate Fraction from Artemisia selengensis;HBsAg;HBeAg

R285.5[1]。全草入藥，性平味甘，有止血消炎、鎮(zhèn)咳化痰、開胃健脾、散寒除濕等功效[2]。目前，針對蔞蒿的研究主要集中在抗菌、抗氧化、降壓、抗腫瘤等活性物質(zhì)及其藥理活性方面[3～7]，而蔞蒿抗乙型肝炎的功效，尚未引起人們的重視。本試驗采用MTT法和酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA），研究了蔞蒿乙酸乙酯部位對體外乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的抑制作用?，F(xiàn)報告如下：

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.09.045蔞蒿（Artemisia selengensis Turcz.ex Bess.）為菊科（Compositae）蒿屬（Artemisia Linn.）植物，俗名藜蒿，在我國各地均有分布，但以生長在長江中下游的鄱陽湖、洞庭湖和太湖等地區(qū)的品質(zhì)為佳

江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)指導(dǎo)性計劃（編號：2013B014）；

江西省科技廳青年科學(xué)基金資助項目（編號：20122BAB215044）

段和祥，E-mail：duanhx_007@163.com

（2016-06-02）