雜色蛤中ACE抑制肽的分離鑒定與分子對(duì)接研究

吳體智,盛乃娟,楊 麗,毛麗娟,王 川,吳 皓,劉 睿

(南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023)

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雜色蛤中ACE抑制肽的分離鑒定與分子對(duì)接研究

吳體智,盛乃娟,楊 麗,毛麗娟,王 川,吳 皓,劉 睿*

(南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023)

目的:建立一種快速、準(zhǔn)確篩選雜色蛤酶解物中活性多肽的方法。方法:在ACE抑制活性導(dǎo)向下,以超濾技術(shù)與離子交換法對(duì)雜色蛤酶解物進(jìn)行分離,確定ACE抑制活性多肽,通過質(zhì)譜分析與已有序列比對(duì)的方法,確定活性多肽的氨基酸序列;通過計(jì)算機(jī)模擬將多肽與ACE蛋白對(duì)接,篩選活性多肽,并確定其與ACE蛋白的作用位點(diǎn)。結(jié)果:共鑒定67個(gè)多肽,其中QIIVQDLTKR、LDYRPGDKFKGT、NTQIIVQDLTKR和LLFDRAPVNFGNYR這四個(gè)多肽能與ACE穩(wěn)定結(jié)合,ACE的Glu403為一重要的結(jié)合位點(diǎn),且Ala356和Arg522對(duì)多肽與ACE的穩(wěn)定結(jié)合也產(chǎn)生了重要影響。結(jié)論:基于串聯(lián)質(zhì)譜與分子對(duì)接技術(shù),建立從混合多肽中快速篩選、鑒定活性多肽的方法,明確活性多肽與ACE可能的結(jié)合位點(diǎn),為后續(xù)的深入研究提供了依據(jù)和參考。

雜色蛤,ACE抑制肽,分子對(duì)接

雜色蛤(Ruditapesphilippinarum)是廣泛分布于江蘇沿海的一種重要雙殼經(jīng)濟(jì)貝類[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為其貝殼和軟體部份均可入藥,蛤蜊肉咸、冷、無毒,歸胃、肝、膀胱經(jīng),宋代《嘉祐本草》中關(guān)于蛤蜊有記載:“潤(rùn)五臟,止消渴,開胃,解酒毒。主老癖能為寒熱者,及婦人血塊,宜煮食之”?，F(xiàn)代研究表明蛤蜊酶解肽具有抗腫瘤、抗氧化、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)活性抑制等多種生物活性[2-4]。然而現(xiàn)階段對(duì)蛤蜊酶解肽這類生物活性肽進(jìn)行分離、鑒定與評(píng)價(jià)的思路和方法較為缺乏[5]。基于此點(diǎn),本論文以中醫(yī)藥理論為依據(jù),結(jié)合超濾技術(shù),離子交換法及串聯(lián)質(zhì)譜等現(xiàn)代技術(shù)方法來探尋和建立一種快速、準(zhǔn)確地篩選雜色蛤酶解肽的方法,為中國(guó)沿海地區(qū)貝類中酶解肽活性的評(píng)價(jià)與研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與理論依據(jù),為優(yōu)化生物活性肽的分離鑒定及其活性評(píng)價(jià)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雜色蛤軟體 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所提供,批號(hào):201409;胰蛋白酶 北京索萊寶公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ACE，馬尿酰-組氨酰-亮氨酸HHL 美國(guó)西格瑪奧德里奇公司;乙腈 色譜級(jí) Tedia company;甲酸 國(guó)產(chǎn)分析純 13020110155;超純水(實(shí)驗(yàn)室自制),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BP 211D電子天平，BT1250D電子天平 德國(guó)Sartorious公司;JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇省金壇市榮光儀器制造公司;3-16PK高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;Mini Pellicon超濾系統(tǒng) 美國(guó)Merck Millipore公司;RotavaporR-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)BUCHI公司;Free zone 4.5 plus冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司;pHs-3C型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;Waters e2695 高效液相色譜儀 美國(guó)沃特斯公司;AKTA 900 蛋白質(zhì)純化儀 瑞典AKTA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ACE抑制活性測(cè)定方法 活性測(cè)定方法參照賈夢(mèng)蛟等人的方法[6]。ACE與HHL溶液的配制:取適量ACE用0.1 mol/L含0.3 mol/L NaCl硼酸緩沖液(pH8.3)配成濃度為100 mU/mL 的ACE 溶液;取適量HHL用0.1 mol/L硼酸緩沖液(含0.3 mol/L NaCl pH8.3)配成濃度為5 mmol/L的HHL溶液;反應(yīng)過程:將30 μL HHL和10 μL 樣品(或緩沖溶液)混勻后,于37 ℃環(huán)境下預(yù)熱5 min(37 ℃水浴),再加入20 μL的ACE 啟動(dòng)反應(yīng),混勻后繼續(xù)于37 ℃環(huán)境下反應(yīng)1 h(37 ℃水浴),然后迅速加入70 μL HCl(1 mol/L)終止反應(yīng),用高效液相色譜分析結(jié)果。用硼酸緩沖液代替樣品溶液做空白對(duì)照。

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱:SunFire-C18柱(2.1 mm×100 mm,3.5 μm,美國(guó) Waters 公司);流動(dòng)相:乙腈-0.5%甲酸水溶液,流速:0.5 mL/min;雙波長(zhǎng)檢測(cè):220 nm、254 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。梯度洗脫條件:0～5 min,2%乙腈;5～25 min,2%～40%乙腈;25～30 min,40%乙腈。

ACE抑制率(%)=(1-樣品組的馬尿酸峰面積/空白組的馬尿酸峰面積)×100

1.2.2 IC50的計(jì)算 IC50即半數(shù)抑制濃度,表示抑制率為一半時(shí)樣品液的濃度,配置不同濃度的雜色蛤酶解物(μg/mL),測(cè)定ACE 抑制率,以 log(酶解物的濃度)為橫坐標(biāo),ACE抑制率(%)的概率單位為縱坐標(biāo),進(jìn)行回歸分析得出回歸方程,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。很明顯,IC50的值越小,其抑制作用越強(qiáng)。

1.2.3 雜色蛤酶解物的制備 將雜色蛤軟體洗凈泥沙,加入3倍量水煎煮2次,每次1 h,過濾,棄上清液,保留肉渣并瀝干稱重。取適量肉渣加3倍量水勻漿,加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解,加酶量為肉渣量的0.60%,溫度48 ℃、pH8.50,反應(yīng)時(shí)間2 h。酶解結(jié)束后于沸水浴滅活15 min,然后于10000 r/min,4 ℃離心20 min,取上清液,備用。

1.2.4 雜色蛤活性酶解物的分離 將制備得的酶解液先經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜抽濾,然后順序透過截流分子質(zhì)量為3 ku和1 ku的平板膜,分別得到分子量>3 ku、1～3 ku和<1 ku的酶解產(chǎn)物。然后將酶解產(chǎn)物凍干,配成不同濃度的溶液,測(cè)定ACE抑制活性。然后將ACE抑制活性最好的一部分酶解產(chǎn)物過0.45 μm濾膜后經(jīng)AKTA 900 蛋白質(zhì)純化儀純化分段。對(duì)離子交換分離得到的各部位進(jìn)行ACE抑制活性測(cè)定,篩選活性部位。

離子分段色譜條件:離子交換注:色譜填料,DEAE Sepharose Fast Flow;流動(dòng)相:0.6 mol/L氯化鈉——水:流速:3 mL/min;進(jìn)樣量:50 mL;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm,梯度洗脫條件:1 mol/L氯化鈉溶液0%(0～40 min),1 mol/L氯化鈉溶液0%～100%(40～140 min)。

1.2.5 活性多肽的鑒定——質(zhì)譜測(cè)序 將離子分段后所得活性最高的部分進(jìn)行質(zhì)譜掃描,并結(jié)合de novo sequencing從頭測(cè)序軟件測(cè)定其中所含多肽的氨基酸序列。

數(shù)據(jù)庫(kù)比:串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer1.3 軟件,SEQUEST 搜庫(kù),選擇軟體動(dòng)物數(shù)據(jù)庫(kù)(Mollusca 2015年3月下載于www.uniprot.org)檢索參數(shù)設(shè)置為:前體離子誤差 10 ppm;子離子誤差 1 u;半胱氨酸殘基固定修飾(氨甲酰甲基化 57.021 5 u);甲硫氨酸殘基可變修飾(氧化+15.994 9 u);允許 2 個(gè)位點(diǎn)誤切,假陽(yáng)性率(FDR)≤1%;酶切方式選擇胰蛋白酶酶切(trypsin);其他參數(shù)為默認(rèn)參數(shù),在上述檢索條件下所得分值有顯著性意義(p<0.05)被認(rèn)定為有效的鑒定結(jié)果。

1.2.6 分子對(duì)接 受體蛋白的準(zhǔn)備:從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(www.rcsb.org)中下載ACE-lisinopril 復(fù)合物(1O86.pdb)X 衍射三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(PDB code:1O86),依據(jù)此復(fù)合物確定抑制肽與ACE相互作用的結(jié)合位點(diǎn),并利用Discovery Studio3.0 軟件處理該蛋白質(zhì):去除所有水分子,為蛋白加氫,去除Lisinopril配體,保留Zn2+和Cl-并優(yōu)化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

1.2.6.1 小分子配體的準(zhǔn)備 用ChemBioDraw Ultra 13.0軟件繪制多肽的分子結(jié)構(gòu)式,用DS中Clean Geometry工具對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,然后再利用CHARMm工具對(duì)其進(jìn)行能量?jī)?yōu)化,準(zhǔn)備好對(duì)接配體。

1.2.6.2 分子對(duì)接 將ACE蛋白定義為受體,準(zhǔn)備好的多肽分子設(shè)為配體,按照對(duì)接程序,使用CDDOCK程序?qū)⑴潴w對(duì)接到受體中去。根據(jù)所得結(jié)果中-CDOCKER_ENERGY值判定最優(yōu)構(gòu)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACE抑制活性部位的分離

首先通過超濾分離將雜色蛤酶解物分為三段。如圖1所示,分離所得的三段酶解物均表現(xiàn)出一定的ACE抑制作用,其中以分子量小于1 ku部分的抑制效果最好,抑制率為37.44%,這與很多研究結(jié)果相一致[7-8],所以對(duì)分子量小于1 ku部分的酶解物進(jìn)一步進(jìn)行離子交換分離,共分離得到三段物質(zhì)(圖2)。如圖3所示,三段離子交換部位除D3段外,另外兩段均有明顯的ACE活性抑制作用,抑制率分別為:D1:77.01%,D2:61.65%。與未進(jìn)行離子分段的酶解物的抑制率相比較,分段后所獲得的酶解物的抑制率顯著提高,這說明通過離子分段,雜色蛤活性酶解物的ACE抑制活性大大增強(qiáng)了。

圖1 雜色蛤酶解物超濾分離所得各段的ACE抑制曲線圖Fig.1 ACE inhibitory of clams hydrolysate separated by ultrafiltration

圖2 雜色蛤酶解物離子交換分段部位Fig.2 Parts of Clams hydrolysate supernatant separated by ion-exchange

圖3 雜色蛤酶解物離子交換所得各部分的ACE活性抑制曲線Fig.3 ACE inhibitory of clams hydrolysate separated by ion-exchange

經(jīng)計(jì)算知,D1段的IC50值為17.60 μg/mL遠(yuǎn)小于D2段IC50值541.71 μg/mL,可知第一段的ACE抑制作用要比第二段的強(qiáng)很多(表1)。故選取離子分段后的第一段進(jìn)行下一步的篩選研究。

表1 雜色蛤酶解物離子交換所得各部分的ACE活性抑制IC50值比較

Table 1 IC50of clams hydrolysate separated by ion-exchange

組別D1D2D3IC501760μg/mL54171μg/mL-

2.2 活性部位多肽的鑒定

通過質(zhì)譜分析,并結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)與de novo sequencing從頭測(cè)序軟件分析,我們共得到1000多種多肽序列。我們選取-10lgP值≥40的多肽,de novo sequencing軟件分析獲得的多肽,選取ALC(%)值≥98的多肽,認(rèn)為這些多肽的序列可信度更高,共得到67個(gè)多肽序列(見附件)。

2.3 活性多肽與ACE的分子對(duì)接

計(jì)算機(jī)分子對(duì)接技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于模擬分析生物活性物質(zhì)與藥物作用靶點(diǎn)的分子作用機(jī)制[9-12]。本實(shí)驗(yàn)通過分子對(duì)接來進(jìn)一步研究從雜色蛤活性酶解物中分離得到的具有高活性的ACE抑制肽對(duì)ACE酶抑制作用的分子機(jī)制。

ACE酶是一種含鋅的二羧肽酶,而鋅原子正處于一個(gè)包含多個(gè)氨基酸殘基的活性位點(diǎn)中。據(jù)文獻(xiàn)查閱可知[13],初步可確定的氨基酸殘基共有16種,分別為Arg522,His353,Ala354,Ser355,Ala356,Val380,His383,Glu384,His387,Glu411,Lys511,Phe512,His513,Val518,Tyr520,Tyr523。我們將鑒定所得的67個(gè)多肽序列全部進(jìn)行分子對(duì)接,最終根據(jù)-CDOCKER_ENERGY值大小,共得到四個(gè)較優(yōu)的多肽序列,分別為QIIVQDLTKR,其-CDOCKER_ENERGY值為140.842;LDYRPGDKFKGT,其-CDOCKER_ENERGY值為150.135;NTQIIVQDLTKR,其-CDOCKER_ENERGY值為172.892;LLFDRAPVNFGNYR,其-CDOCKER_ENERGY值為183.785。在圖4中ABCD 四張圖分別顯示了這四個(gè)多肽與ACE相互作用的整體視圖,從圖中可以明顯看出,四個(gè)多肽均處于ACE蛋白的空腔中,周圍被氨基酸殘基緊緊包圍著,形成一個(gè)較穩(wěn)定的復(fù)合體。

圖4 多肽與ACE相互作用的整體視圖Fig.4 The overall view of interaction schemes between polypeptides and ACE(說明:1. 圖4、圖5、圖6中A代表多肽QIIVQDLTKR(分子量為1195.69 u),B代表多肽LDYRPGDKFKGT(分子量為1395.71 u),C代表多肽NTQIIVQDLTKR(分子量為1427.81 u),D代表多肽LLFDRAPVNFGNYR(分子量為1680.87 u);2. 圖6中親水氨基酸殘基用綠色表示,疏水氨基酸殘基用藍(lán)色表示)。

圖5中是四個(gè)多肽分別與ACE蛋白之間的氫鍵作用,多肽QIIVQDLTKR—共與ACE蛋白形成7個(gè)氫鍵,參與氫鍵形成的氨基酸殘基有Asn66,His353,Ala356,Asn374,Tyr360,Glu384,Glu403;多肽LDYRPGDKFKGT共與ACE蛋白形成14個(gè)氫鍵,參與氫鍵形成的氨基酸殘基分別是Glu403,Ala356,Glu384,Asn70,Ser517,Arg522,Ala354,His353,Glu162,Ala170,Asn285,Thr302,其中氨基酸殘基Arg522和Glu162均形成兩個(gè)氫鍵;多肽NTQIIVQDLTKR共與ACE蛋白形成13個(gè)氫鍵,參與氫鍵形成的氨基酸殘基分別是Glu123,Glu403,Ser517,Thr166,Glu376,Tyr520,Ala356,Ala354,Arg522,Lys511,其中,Arg522形成3個(gè)氫鍵,Lys511形成2個(gè)氫鍵;多肽LLFDRAPVNFGNYR共形成7個(gè)氫鍵,參與氫鍵形成的氨基酸殘基分別是Asn285,Asn374,Asp377,His353,Lys511,Glu403,其中氨基酸殘基Glu403形成兩個(gè)氫鍵。氫鍵作用是分子間較強(qiáng)的作用力,對(duì)兩分子間的相互作用有著極其重要的影響[14-15]。從以上參與氫鍵作用產(chǎn)生的氨基酸殘基分布來看,Glu403與四個(gè)多肽之間均產(chǎn)生了氫鍵作用,這說明Glu403對(duì)于形成的復(fù)合物的穩(wěn)定存在給予了極大的貢獻(xiàn)。而Glu403與多肽LLFDRAPVNFGNYR 之間產(chǎn)生了2個(gè)氫鍵作用,這也可能解釋了為什么多肽LLFDRAPVNFGNYR 與ACE蛋白之間只形成了7個(gè)氫鍵但其-CDOCKER_ENERGY值最高。同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn),Ala356與四個(gè)多肽中的3個(gè)產(chǎn)生了氫鍵作用,Arg522雖只與其中的2個(gè)多肽產(chǎn)生氫鍵作用,但是它分別與多肽11和多肽5產(chǎn)生了3個(gè)、2個(gè)氫鍵作用,并且管驍?shù)热说难芯縖15]發(fā)現(xiàn)Arg522是ACE活性位點(diǎn)中起重要作用的氨基酸殘基,郭慧青等人的研究[16]認(rèn)為Ala356 與Arg522均對(duì)抑制肽與ACE之間相互作用產(chǎn)生重要影響,故我們推測(cè)Ala356 和Arg522也是導(dǎo)致多肽與ACE蛋白穩(wěn)定結(jié)合的兩個(gè)重要氨基酸殘基。

圖5 多肽與ACE間的氫鍵作用Fig.5 Hydrogen bonding interaction between polypeptides and ACE

圖6顯示的是四個(gè)多肽周圍的親水氨基酸與疏水氨基酸的分布,其中多肽QIIVQDLTKR與18個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生親水作用,與8個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生疏水作用,多肽LDYRPGDKFKGT與18個(gè)氨基酸產(chǎn)生親水作用,與6個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生親水作用,多肽NTQIIVQDLTKR與19個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生親水作用,7個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生疏水作用,多肽LLFDRAPVNFGNYR與18個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生親水作用,與4個(gè)氨基酸殘基產(chǎn)生疏水作用(見附件)。同時(shí)多肽自身含有大量的親水性基團(tuán)(-COOH、-NH3、-CO-NH-、-CO-)也參與了分子間親水作用的形成,這些親水和疏水作用共同將多肽包裹在ACE蛋白空腔內(nèi),使得形成的復(fù)合物變得更加穩(wěn)定。此外,據(jù)前期文獻(xiàn)報(bào)道可知,活性肽的氨基酸序列對(duì)其活性有著重要影響[6,17]。當(dāng)多肽N端含有較多的亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)等氨基酸,C端含有一些如精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)等與ACE活性位點(diǎn)親和力較強(qiáng)的氨基酸時(shí),能夠促進(jìn)多肽與ACE的位點(diǎn)結(jié)合,是ACE抑制肽發(fā)揮活性的主要因素。而我們篩選得到的四個(gè)活性較高的多肽,其中有兩個(gè)在N端含有亮氨酸,三個(gè)在C端含有精氨酸,并且其中-CDOCKER_ENERGY值最高的多肽(LLFDRAPVNFGNYR)在N端連續(xù)含有兩個(gè)亮氨酸。這也再一次證明篩選得到的四個(gè)多肽可能有很強(qiáng)的ACE抑制活性。

圖6 多肽與ACE蛋白間的疏水作用和親水作用Fig.6 Hydrophobic and hydrophilic interaction between polypeptides and ACE

3 結(jié)論

本文研究通過超濾技術(shù)與離子交換法對(duì)雜色蛤活性酶解物進(jìn)行分離純化,LC-MS/MS對(duì)純化后的活性部位鑒定,通過分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步研究篩選活性多肽,及多肽與ACE可能的作用位點(diǎn)。本文方法快速、準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)混合多肽中活性多肽的尋找、評(píng)價(jià)與作用方式,建立了一種快速篩選活性多肽的方法。結(jié)果表明,分離鑒定得到的多肽能夠與ACE中Glu403,Ala356,Arg522等主要活性位點(diǎn)的氨基酸殘基結(jié)合,對(duì)于促進(jìn)活性多肽與ACE蛋白形成的復(fù)合物穩(wěn)定性有著重要影響。本文的方法為后續(xù)已知靶點(diǎn)的活性多肽的尋找與評(píng)價(jià)提供參考與借鑒。

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Separation and identification of ACE inhibitory peptides fromRuditapesphilippinarumand molecular docking

WU Ti-zhi,SHENG Nai-juan,YANG Li,MAO Li-juan,WANG Chuan,WU Hao,LIU Rui*

(Jiangsu key laboratory of research and development on marine bio-resource pharmaceutics, Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China)

Objective:ToselectthebioactivepeptidesquicklyandaccuratelyfromRuditapes philippinarumhydrolysate.Methods:PeptidesfromRuditapes philippinarumhydrolysatecouldbeseparatedbyultrafiltrationandionexchangechromatographybasedontheACEinhibitoryassay-directfractionation.ThenaminoacidssequencesofpeptideswereidentifiedaccordingtotheMS/MSspectraandproteindatabase.InteractionmechanismbetweenthepeptidesandACEwasinvestigatedbymoleculardocking.Results:67peptideswereidentified,amongwhichfourpeptides,QIIVQDLTKR,LDYRPGDKFKGT,NTQIIVQDLTKRandLLFDRAPVNFGNYR,canbindtoACEstably.OurdockingresultsalsosuggestedthattheACEinhibitorypeptidesbindtoACEviainteractionswithGlu403,Ala356andArg522residuesandtheresidueGlu403mightbeasignificantbindingsite.Conclusions:thisstudycanquicklyselect,identifyandevaluatethebioactivepeptideswhilefindingpotentialbindingsitesbetweenbioactivepeptidesandACE,whichprovidesthebasisandreferenceforfurtherresearch.

Ruditapes philippinarum;ACEinhibitorypeptide;moleculardocking

2016-02-01

吳體智(1993-)，男，本科生，研究方向：藥物制劑，E-mail：2465724882@qq.com。

*通訊作者:劉睿(1982-)，男，博士，副研究員，研究方向：海洋藥物研究與開發(fā)，E-mail：liurui@njucm.edu.cn。

2013，2014國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201305007, 201405017) ；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程(PAPD)；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃；江蘇省青藍(lán)工程；江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心資助。

TS254.9

A

1002-0306(2016)19-0153-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.021