復(fù)合酶水解法從羅非魚血液中提取血紅素及其性質(zhì)研究

岑劍偉,胡慶蓉,魏 涯,楊賢慶,黃 卉,李來好,*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室, 國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300; 2.汕頭市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所,廣東汕頭 515063)

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復(fù)合酶水解法從羅非魚血液中提取血紅素及其性質(zhì)研究

岑劍偉1,胡慶蓉2,魏 涯1,楊賢慶1,黃 卉1,李來好1,*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室, 國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300; 2.汕頭市質(zhì)量計量監(jiān)督檢測所,廣東汕頭 515063)

為更加科學(xué)有效地利用中國豐富的羅非魚血液資源,本文建立了一套經(jīng)復(fù)合酶水解、再通過酸沉淀和真空冷凍干燥等步驟,從羅非魚血液中提取血紅素的新工藝。在此條件下,血紅素提取率達到80.9%,產(chǎn)品純度為28.2%,同時對所得產(chǎn)品的光譜特征、分子量大小、鐵離子價態(tài)和外觀性狀等物理性質(zhì)進行了研究。結(jié)果分析表明:產(chǎn)品特征波長為385 nm,特征成分為血紅素,產(chǎn)品中約20%的血紅素以與大分子肽鏈結(jié)合的形式存在,相對分子量在5～10 ku范圍內(nèi),而約75%的血紅素則可能以單體或者與小分子肽鏈結(jié)合的形式存在,相對分子量小于5 ku;產(chǎn)品中二價鐵殘留率為37%,在提取過程中應(yīng)加強二價鐵的保護,相關(guān)研究結(jié)果可以為羅非魚血液中血紅素的開發(fā)應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

羅非魚血,血紅素,復(fù)合酶,提取,性質(zhì)研究

中國是世界上最大的羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)國家,2014年我國羅非魚產(chǎn)量達到155萬t,其中約有50%的產(chǎn)品用于加工生產(chǎn),然而被工廠當(dāng)作廢水排放的羅非魚血達1.6×104t[1-2],造成資源的巨大浪費和引發(fā)嚴重的環(huán)境污染問題。血紅蛋白(hemoglobin,Hb)是羅非魚血液中含量最高的一類蛋白(約占血液總蛋白的80%),它由血紅素與珠蛋白結(jié)合成四聚體(兩條α鏈和兩條β鏈)的形式存在,相對分子質(zhì)量約為65000,其中珠蛋白約占96%,血紅素占4%[3]。血紅素(Heme)是由1個原卟啉環(huán)中鑲嵌1個亞鐵離子(Fe2+)構(gòu)成的化合物,分子式為C34H32FeN4O4,相對分子量為616.49。它參與機體的多項代謝活動,發(fā)揮著重要的生理功能[4],因此,在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用:如添加到糖果、面食、醬油和肉制品等食品中,能夠在不影響食品原有品質(zhì)的同時有效地起到補鐵的作用,改善肉制品的外觀和口感[5-7];血紅素作為制備膽紅素的前體,可作為制備抗癌特效藥-血卟啉衍生物的主要原料等[8]。

因此,本文以羅非魚血為原料,在對酶種類、酶濃度、底物濃度、酶解時間等酶解工藝條件進行研究的基礎(chǔ)上,采用復(fù)合酶水解法的最佳工藝條件處理血紅蛋白[9],再經(jīng)過酸沉淀和離心等操作提取血紅素,并通過紫外-可見光譜掃描圖譜分析、高效液相色譜定性分析、超濾技術(shù)定性分析、Fe2+/Fe3+組成分析和外觀性狀觀察等實驗,對產(chǎn)品的光譜特征、分子量大小、含量和外觀性狀等性質(zhì)進行研究。旨在為羅非魚血液資源綜合利用研究提供可靠的理論和技術(shù)支撐,具有重要的理論研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚 廣州華潤萬家超市新港西路店,鮮活,約500 g/尾;血紅素標準品 Sigma公司,生物試劑;氫氧化鈉、冰醋酸 廣州化學(xué)試劑廠,分析純;1%乙酸、四氫呋喃 美國TEDIA公司,色譜純;鄰菲羅啉試劑 廣州康龍生物技術(shù)有限公司,分析純;復(fù)合蛋白酶 廣州齊云生物技術(shù)有限公司,生物試劑。

Agilent 1100高效液相色譜工作站 Agilent公司;AA-6300C型原子吸收分光光度計 島津(SHIMADZU)公司;UV-2450/2550型紫外-可見分光光度計 島津(SHIMADZU)公司;Milipore Labscale超濾超濾系統(tǒng) Milipore公司;ALPHA 1-4 LSC 冷凍干燥機 德國Christ公司;XSP-2C雙目型顯微鏡 上海蔡康光學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 血紅素含量測定 紫外-可見分光光度法(UV)[10]。

相關(guān)計算:

提取率(%)=產(chǎn)品中血紅素含量(g)×100/血樣中血紅素含量(g);

純度(%)=血紅素含量(g)×100/所得產(chǎn)品重量(g)。

1.2.2 樣品準備 將收集到的羅非魚血紅細胞經(jīng)2～3次生理鹽水洗滌后,用2倍體積的蒸餾水稀釋紅細胞,經(jīng)600 W、20 min超聲波輔助細胞破膜處理后,5000×g離心15 min,收集上層潔凈血紅細胞液備用。

1.2.3 復(fù)合酶水解法提取血紅素 參考文獻[8]的方法,將制備的血紅細胞液樣品加pH8.0的磷酸緩沖液調(diào)節(jié)至血紅蛋白濃度為6%,量取300 mL該血樣,按酶底比8000 U/g將復(fù)合酶添加到血樣中,調(diào)節(jié)pH至8.0,40 ℃條件下勻速攪拌水解2 h。酶解結(jié)束后,將酶解液進行沸水浴處理15 min左右,迅速冷卻后離心(3000×g,10 min),去除沉淀。

1.2.4 酸沉淀純化血紅素 用冰醋酸調(diào)節(jié)樣液pH6.0,充分攪拌后靜置20 min,離心(3000×g,10 min),收集血紅素沉淀,經(jīng)真空冷凍干燥得終產(chǎn)品。

1.2.5 血紅素產(chǎn)品物理性質(zhì)測定

1.2.5.1 紫外-可見光譜掃描 在190～800 nm的波長范圍內(nèi),以溶劑0.1 mol/L NaOH作空白,以16 mg/L血紅素標準溶液為對照,對80 mg/L的樣品溶液掃描光譜,進行圖譜特征分析。

1.2.5.2 高效液相色譜(HPLC)定性研究 將樣品(以含血紅素28.2%計)配制成血紅素含量與血紅素標準溶液(16 mg/L)接近的濃度,經(jīng)0.45 μm膜過濾,濾液上機檢測。色譜條件為色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm/5 μm);流動相:1%乙酸∶四氫呋喃=65∶35;進樣量:10 μL;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:405 nm[11]。

1.2.5.3 超濾實驗 精確稱取產(chǎn)品80 mg,用0.1 mol/L NaOH溶液將其溶解并定容至500 mL。量取400 mL樣品溶液先后經(jīng)50、10、5 ku孔徑大小的膜超濾處理,分別測定每次過膜后的血紅素含量,定性分析產(chǎn)品的分子量分布情況及成分組成情況。

1.2.5.4 Fe2+和Fe3+含量測定 總鐵含量測定:原子吸收光譜法(AAS)。樣品作如下預(yù)處理:量取10 mL 160 mg/L的樣品溶液,加入15 mL濃硝酸,微波消解15 min,定容至100 mL。上機檢測標樣溶液和樣品溶液,由回歸方程計算樣品中的總鐵含量。

Fe2+含量測定:鄰菲羅啉分光光度法[12]。

Fe3+含量測定:Fe3+含量=總鐵含量-Fe2+含量

1.2.5.5 外觀性狀觀察 用顯微鏡觀察干燥后的樣品和血紅素標準品的外觀性狀。

2 結(jié)果與討論

2.1 血紅素提取工藝分析

通過堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶提取血紅素效果對照實驗表明,復(fù)合酶的提取率最高。因此,本實驗選用復(fù)合酶酶解提取血紅素,其最適反應(yīng)pH為8.0,最適反應(yīng)溫度為40 ℃[9]。通過對酶解底物濃度、酶底比和酶解時間三個主要影響因子進行單因素實驗和L9(34)正交實驗,確定的最佳酶解工藝條件為底物濃度6%、酶底比8000 U/g,酶解時間2 h[9]。

血紅蛋白經(jīng)水解后,所得水解液中含有多種成分,包括血紅素、血紅素肽結(jié)合體和各種肽片段等。酶解反應(yīng)結(jié)束后進行沸水浴處理,可以使酶變性失活,終止酶解反應(yīng),又可以使熱不穩(wěn)定性物質(zhì)(如血紅蛋白)變性沉淀。因此,通過沸水浴處理后離心可以起到較好的除雜作用。根據(jù)文獻報道,血紅素不溶于酸性溶液中,在酸性條件下會發(fā)生沉淀[13];同時,珠蛋白在等電點pH3.0附近時會與血紅素發(fā)生解離,從而使血紅素肽的結(jié)構(gòu)遭到破壞;同時血紅蛋白水解液中肽片段的等電點約為4.7[14]。調(diào)節(jié)pH6.0不僅可以使血紅素單體和血紅素肽充分沉淀,而盡量減少其他肽鏈沉淀,有效的提高血紅素的得率;同時因為遠離了珠蛋白等電點,又不會使血紅素肽因解離而失去功能活性。按照上述工藝條件操作,通過測定各步驟中血紅素含量和干物質(zhì)重量,可計算相關(guān)評價指標變化情況如表1。

表2 超濾中的血紅素含量測定結(jié)果

Table 2 Content determination results of heme during utrafiltration

膜孔徑(ku)50105血紅素含量(mg/L)4453±014337±013398±01血紅素通過率(%)987961753

表1 血紅素提取過程中各指標變化情況

Table 1 The variation of indexes during extraction of heme

評價指標樣品準備復(fù)合酶水解酸沉淀血紅素含量(g)067505690546干物質(zhì)重量(g)18000133291934血紅素提取率(%)100843809純度(%)3843282

由表1可知,血紅細胞液經(jīng)復(fù)合酶水解和酸沉淀后,血紅素提取率為80.9%,樣品純度為28.2%。張亞娟[14]等報道的血紅素提取率為57.5%,純度為24.47%。吳保承[15]等報道的血紅素提取率為77.2%。與現(xiàn)有文獻報道相比,本文中血紅素提取率、純度均達到較高水平。

2.2 血紅素產(chǎn)品物理性質(zhì)分析

酶法制備的產(chǎn)品中血紅素含量為28.2%,其可能包含幾種成分:(1)血紅素肽結(jié)合體;(2)血紅素單體;(3)難分離的肽鏈等。為了進一步明確產(chǎn)品的組成成分和有關(guān)物理特征,實驗通過紫外-可見光譜掃描圖譜分析、高效液相色譜定性分析、超濾技術(shù)定性分析、Fe2+/Fe3+組成分析和外觀性狀分析等對產(chǎn)品的物理性質(zhì)做相關(guān)研究。

2.2.1 紫外-可見光譜掃描圖譜分析 由圖1可見,樣品的光譜掃描圖譜與血紅素標準品的圖譜峰型基本一致,且其特征吸收波長為385 nm,與文獻[10,14-15]報道的血紅素特征波長一致,表明樣品中的特征性成分為血紅素;樣品峰面積稍大于標準品,而兩者的濃度比為5∶1,可大致推斷出樣品中血紅素含量大于且接近20%,與測定值28.2%相吻合,證實了上述結(jié)果的準確有效性。

圖1 血紅素樣品與標準品的紫外-可見光譜Fig.1 UV-Vis curve of heme product and the standard

2.2.2 高效液相色譜定性分析 流動相的性質(zhì)和組成是影響色譜柱效、分離選擇性的重要因素。目前文獻報道的HPLC法測定血紅素時,流動相多采用乙腈、甲醇和水等[14]?？紤]到血紅素與色譜柱產(chǎn)生較強作用導(dǎo)致拖尾,直接影響測定結(jié)果的準確性,因此,本實驗采用1%乙酸和四氫呋喃為流動相,可有效克服圖譜的拖尾現(xiàn)象。用高效液相色譜法測定血紅素,檢測波長在385 nm處時色譜峰的分離不如405 nm,因此將此法檢測波長定為405 nm。

由圖2可知，峰形良好,且只有一個峰;血紅素標準品的保留時間為7.074 min,峰面積為1030 mAU·mL;樣品的保留時間為7.160 min,峰面積為987 mAU·mL,由此可知,樣品的保留時間和峰面積均與血紅素標準品一致,表明樣品中的特征性成分為血紅素,且含量與紫外-可見分光光度法測定結(jié)果一致,為28.2%。

圖2 血紅素標準品(a)和樣品(b)的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of heme standard(a)and the product(b)

2.2.3 超濾定性分析 超濾前的血紅素含量為45.12 mg/L,由表2可知,經(jīng)過50 ku和10 ku的膜處理后,血紅素含量變化不明顯,只有很小的一部分被截留,表明絕大多數(shù)的血紅蛋白被水解成了多肽鏈;經(jīng)過5 ku的膜處理后,血紅素含量為超濾前的75.3%。表明產(chǎn)品的分子量主要集中分布在兩個范圍:一是5～10 ku,這部分約占血紅素總量的20%,主要是血紅素與大分子肽鏈的結(jié)合物;二是小于5 ku,這部分約占血紅素總量的75%,可能含有血紅素單體或者血紅素和小分子肽鏈的結(jié)合物。

2.2.4 Fe2+和Fe3+含量分析 鐵原子在血紅蛋白中與血紅素以Fe2+的形式結(jié)合,酶解和分離純化過程中,血紅蛋白原有的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被破壞,使Fe2+更容易與氧氣接觸而氧化成Fe3+等高價鐵[4]。由表3可知,樣品中60%的鐵被氧化成Fe3+,由于Fe2+比Fe3+對人體的作用更為關(guān)鍵,因此,在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中應(yīng)該加強二價鐵的保護。

表3 樣品中Fe2+和Fe3+含量

Table 3 The content of Fe2+and Fe3+in the sample

鐵元素類型總鐵Fe2+Fe3+濃度(mg/L)0392±0010147±00050235±0005比例(%)1003760

2.2.5 外觀性狀分析 在顯微鏡下觀察,血紅素標準品為紫色針狀晶體,樣品呈紫色針狀晶體或藍紫色粉末狀,證實產(chǎn)品中不止含有血紅素單體一種物質(zhì),可能還含有血紅素肽等其他物質(zhì)。

3 結(jié)論

采用最佳的復(fù)合酶水解工藝條件從羅非魚血液中提取血紅素,經(jīng)過酶解、熱處理、離心和酸沉淀等技術(shù)處理后,血紅素提取率達到80.9%,純度為28.2%。與現(xiàn)有文獻報道相比,本文中血紅素提取率、純度均達到較高水平。

紫外-可見光譜掃描和HPLC定性分析發(fā)現(xiàn),產(chǎn)品特征波長為385 nm,產(chǎn)品中的特征成分為血紅素,且含量與28.2%一致;超濾定性分析發(fā)現(xiàn),所得產(chǎn)品中約20%的血紅素以與大分子肽鏈結(jié)合的形式存在,相對分子量在5～10 ku范圍內(nèi),而約75%的血紅素則可能以單體或者與小分子肽鏈結(jié)合的形式存在,相對分子量小于5 ku;Fe2+和Fe3+含量分析可知,樣品中二價鐵殘留率為37%,因此,在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中應(yīng)該加強二價鐵的保護;外觀性狀觀察發(fā)現(xiàn),樣品呈紫色針狀晶體和藍紫色粉末狀兩種形態(tài),證實產(chǎn)

品中不止含有血紅素單體一種物質(zhì),可能還含有血紅素肽等其他物質(zhì)。相關(guān)研究結(jié)果為探明產(chǎn)品的功能特性提供了一定的數(shù)據(jù)支持,具有重要的參考價值。

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Characterization of heme from tilapias blood extracted by protamex hydrolysis

CEN Jian-wei1,HU Qing-rong2,WEI Ya1,YANG Xian-qing1,HUANG Hui1,LI Lai-hao1,*

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences;Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;National R&D Center for Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,China； 2.Guangdong Shantou Quality and Measuring Supervision Testing Institute,Shantou 515063,China)

Inordertomakethescientificlyandeffectivelyuseoftilapiasbloodresources,aninnovativemethodtoextracthemefromtilapiasbloodwasestablished.Theprocedureconsistsofprotamexhydrolysis,acidprecipitation,vacuumfreezedrying,etc.Theresultsshowedthattheyieldofextractedhemewas80.9%,andthepuritywas28.2%.Thecharacterizationanalysisincludedspectralcharacteristics,molecularweight,Fe2+residualrateandmicroscopicexamination,whichdemonstratedthesample’scharacteristicwavelengthwas385nmandtheprincipalcomponentwasheme. 20%ofthehemewasthecombinationofhemeandmacromolecularpeptidesandthemolecularweightwas5～10ku,but75%ofthehemeprobablywasthemonomerorcombinedwithsmallmolecularpeptides,themolecularweightwaslessthan5ku.TheFe2+residualrateofsamplewas37%,indicatedthatprotectingmeasurewasnecessarywhileextraction.Therelatedresearchresultscouldprovideimportanttheoreticalbasisandtechnicalsupportsforthedevelopmentandapplicationofhemoglobinoftilapiabloodinthefuture.

tilapiasblood;heme;protamex;extraction;characterization

2016-04-01

岑劍偉(1976-)，男，博士，副研究員，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail:genvex@163.com。

*通訊作者:李來好(1963-)，男，博士，二級研究員，研究方向：水產(chǎn)品加工、水產(chǎn)品質(zhì)量安全與水產(chǎn)標準化等，E-mail:laihaoli@163.com。

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費專項(2015B06YQ01)；中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(2014YD06)；國家支撐計劃項目(2012BAD28B06)；羅非魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家專項經(jīng)費(CARS-49)；“揚帆計劃”引進創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團隊專項資助(2015YT02H109 )；國家支撐計劃項(2015BAD17B03)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)19-0058-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.003