苜蓿高頻再生組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化

秦 楚，李 昱，張喜斌，麻冬梅，許 興

（1.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)辦公室，寧夏 銀川 750021；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

苜蓿高頻再生組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化

秦 楚1，李 昱2，張喜斌1，麻冬梅3，許 興3

（1.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)辦公室，寧夏 銀川 750021；3.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

以3個品種紫花苜蓿7日齡無菌苗的下胚軸為外植體，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究不同濃度激素配比對紫花苜蓿離體再生體系中愈傷組織的形成、不定芽誘導(dǎo)以及生根的影響。結(jié)果表明：金皇后、甘農(nóng)1號、阿爾岡金愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基分別為MS+2，4-D 2.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L、MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L、MS+2，4-D 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L；不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基分別為MS+6-BA 2.0 mg/L+CH 0.5 g/L、MS+NAA 0.3 mg/L+KT 0.5 mg/L、MS+KT 1.2 mg/L；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 1.0 mg/L。

苜蓿；激素；愈傷組織；再生體系

苜蓿（Medicaho sativa L.）是世界上分布最廣的一種豆科牧草［1］，享有“牧草之王”的美譽［2］，其本身具有一定的耐鹽能力，可在低濃度的鹽堿地中良好生長［3］。苜蓿不僅抗逆性強、適應(yīng)范圍廣，還能為土壤提供大量有機質(zhì)，改良土壤酸堿度。近年來，隨著我國土壤鹽堿化程度的加劇，迫切需要培育出抗逆性苜蓿品種［4］。由于傳統(tǒng)育種手段見效緩慢，而通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可更加快速有效地獲得目標(biāo)品種。為了提高轉(zhuǎn)基因效率，建立最佳的植物再生體系尤為重要，早在1972年，Saunder等就從未成熟的苜?；ㄋ?、子房、子葉愈傷組織分化再生苜蓿植株獲得成功，標(biāo)志著苜蓿組織培養(yǎng)研究的開始，自此大量苜蓿組織培養(yǎng)方面的研究得以開展［5-9］。然而，紫花苜蓿作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體，存在轉(zhuǎn)化效率低、分化率低、生根困難和再生周期長等缺點，因此，本試驗通過研究不同激素的配比繼而有效提高苜蓿的再生組織培養(yǎng)體系，以期為苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年在寧夏大學(xué)科技樓實驗室進行，供試苜蓿品種為中國草業(yè)公司提供的金皇后、甘農(nóng)1號、阿爾岡金。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子消毒 挑選健康飽滿的苜蓿種子，置于100 mL錐形瓶中，用流水沖洗4～5次，去除漂浮于水面上的種子和雜質(zhì)，移至超凈工作臺中。

1.2.2 無菌苗培養(yǎng) 先用75%酒精振蕩滅菌30 s，用滅菌的蒸餾水沖洗3次；再用0.1%HgCl2振蕩滅菌8 min后，蒸餾水沖洗4～5次；最后將處理后的苜蓿種子接種于MS培養(yǎng)基（附加瓊脂8 g/L、蔗糖20 g/L，121℃下高壓滅菌20 min，下同）上。培養(yǎng)條件為：溫度25℃，光照強度3 000～4 000 lx，光照12 h/d，連續(xù)光照7 d。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo) 切取種子萌發(fā)培養(yǎng)基上生長7 d的無菌苗下胚軸（3～5 mm）為外植體，接種至分別添加不同濃度激素配比2，4-D、6-BA、NAA的MS培養(yǎng)基中（表1～表2），每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接種25個外植體，置于25℃黑暗培養(yǎng)。形成愈傷組織后20 d統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100。

1.2.4 愈傷組織分化 愈傷組織形成后，每隔15 d繼代培養(yǎng)1次，愈傷組織繼代3次后，挑選組織結(jié)構(gòu)致密的淡黃色愈傷組織，接種至添加不同濃度激素配比的MS培養(yǎng)基（表3～表5）中，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接種20個愈傷組織，每隔15 d繼代培養(yǎng)1次。培養(yǎng)條件為：溫度25℃，光照強度3 000～4 000 lx，光照12 h/d。形成分化的小苗，60 d后統(tǒng)計分化率，分化率（%）=分化出芽的愈傷組織個數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)×100。

1.2.5 生根培養(yǎng) 將出現(xiàn)1 cm左右不定芽的愈傷組織接種至添加不同濃度IBA（0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/L）的1/2MS培養(yǎng)基（大量元素是MS培養(yǎng)基的50%，微量、維生素、鐵鹽含量保持不變，pH為5.8～6.2）中。培養(yǎng)條件為25℃、光照強度3 000～4 000 lx、光照12 h/d。培養(yǎng)約4周，發(fā)育成正常的植株。

1.2.6 煉苗移栽 去掉培養(yǎng)瓶的蓋子，向培養(yǎng)瓶中加入少量蒸餾水，在室內(nèi)煉苗72 h，取出培養(yǎng)基中的幼苗，用蒸餾水洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于混有滅菌的營養(yǎng)土∶蛭石（1∶1）的小花盆中，最初1周蓋上保鮮膜，每天通風(fēng)3～5次，當(dāng)幼苗長出莖葉時移入大棚。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在誘導(dǎo)苜蓿愈傷組織過程中，培養(yǎng)基中加入不同濃度激素時，愈傷組織誘導(dǎo)率不同（表1～表2）。當(dāng)2，4-D濃度逐漸升高時，金皇后和阿爾岡金愈傷組織誘導(dǎo)率呈上升趨勢，2，4-D濃度為2.5 mg/L時誘導(dǎo)率最高，說明此濃度是誘導(dǎo)金皇后和阿爾岡金愈傷組織的最適濃度。甘農(nóng)1號在2，4-D濃度從2.0 mg/L提高至2.5 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率降低，說明高濃度抑制了甘農(nóng)1號愈傷的形成，2.0 mg/L 2，4-D是其最佳的愈傷形成濃度。在相同2，4-D濃度下，隨著6-BA濃度的提高，金皇后愈傷組織誘導(dǎo)率大致呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，說明過高濃度的6-BA會對金皇后愈傷的形成起到抑制作用。由表1可知，金皇后愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D2.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。隨著NAA和KT濃度的提高，甘農(nóng)1號和阿爾岡金愈傷形成率大致呈上升趨勢，表2顯示，當(dāng)NAA濃度為1.0 mg/L時，甘農(nóng)1號愈傷誘導(dǎo)率達最大值，其最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；當(dāng)2，4-D濃度為2.5 mg/L時愈傷形成率均達90%以上，說明低濃度2，4-D不利于阿爾岡金愈傷的形成，其最佳愈傷形成的培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.5 mg/L+KT 1.0 mg/L。三者比較可知，甘農(nóng)1號在2，4-D與NAA誘導(dǎo)下愈傷形成率較高，均達到80%以上。

表1 不同激素配比對金皇后苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表2 不同激素配比對甘農(nóng)1號、阿爾岡金苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表3 不同激素配比對金皇后苜蓿愈傷組織分化的影響

2.2 不同激素配比對苜蓿愈傷組織分化的影響

分化過程中，愈傷組織會膨大、變綠、出現(xiàn)綠點和長芽，MS培養(yǎng)基中添加不同濃度激素時，愈傷分化率差別較大，通常情況下，愈傷分化率都較低，當(dāng)用同種激素來篩選時，不同濃度對愈傷組織分化誘導(dǎo)效果的差別也很大。表3顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中加入6-BA 2.0 mg/L+CH 0.5 mg/L時，金皇后的誘導(dǎo)率最大達11.67%，而在培養(yǎng)基中不加入任何激素誘導(dǎo)率也較高。由表4可知，甘農(nóng)1號愈傷分化的誘導(dǎo)率相對高于金皇后，培養(yǎng)基中加入2.0 mg/L 6-BA時誘導(dǎo)率也較高，當(dāng)培養(yǎng)基中加入NAA 0.3 mg/L+KT 0.5 mg/L時誘導(dǎo)率最高可達13.33%，說明適量配比的生長素和細胞分裂素有助于甘農(nóng)1號的分化。從表5可以看出，3種苜蓿相比，阿爾岡金愈傷分化誘導(dǎo)率最高、達20%以上，當(dāng)培養(yǎng)基中加入2.0 mg/L 6-BA或NAA 0.3 mg/L+KT 0.5 mg/L時，阿爾岡金分化率均達10%以上，當(dāng)加入相同濃度的激素時，若加入0.5 mg/L CH均可提高誘導(dǎo)率。說明適量CH有助于愈傷組織的分化，阿爾岡金的最佳分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+KT 1.2 mg/L+CH 0.5 mg/L。

表4 不同激素配比對甘農(nóng)1號苜蓿愈傷組織分化的影響

表5 不同激素配比對阿爾岡金苜蓿愈傷組織分化的影響

2.3 不同濃度IBA對苜蓿生根移栽的影響

IBA對不定芽生根有一定的促進作用，在培養(yǎng)基中加入適量IBA有助于苜蓿的生根。由表6可知，在未添加IBA的培養(yǎng)基中，3個品種苜蓿的生根率均較低，隨著IBA濃度的增加，3個品種苜蓿的生根率均呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)IBA濃度為1.0 mg/L時生根率均達到最大。苜蓿的再生體系見圖1（封三）。

表6 不同濃度IBA對苜蓿生根率（%）的影響

3 結(jié)論與討論

植物的不同基因型和不同外植體均會對愈傷組織的形成產(chǎn)生一定影響［10］。David等［11］、楊廣東等［12］研究認為，下胚軸是誘導(dǎo)苜蓿愈傷組織的最佳外植體，因此，本試驗采用2，4-D與6-BA、NAA、KT配比對外植體進行愈傷組織的誘導(dǎo)，2，4-D在單獨使用或與其他激素配合使用時均能誘導(dǎo)出愈傷組織，李聰?shù)龋?3］認為誘導(dǎo)苜蓿愈傷組織時，2，4-D是不可缺少的且最適濃度為2 mg/L。本試驗也證實當(dāng)2，4-D濃度達到2 mg/L時，甘農(nóng)1號的愈傷形成效果較好且比較致密，但在此濃度下金皇后和阿爾岡金的水浸化較嚴(yán)重，不便于下一步進行基因轉(zhuǎn)化試驗，適當(dāng)提高2，4-D濃度可以使愈傷變得更致密，更有利于下一步試驗。另外，舒文華等［14］認為高濃度的2，4-D容易使愈傷組織褐化，本試驗也表明當(dāng)2，4-D濃度超過甘農(nóng)1號愈傷生長的最適濃度達到2.5 mg/L時，甘農(nóng)1號的愈傷組織誘導(dǎo)率降低且易發(fā)生褐化現(xiàn)象。苜蓿再生體系的建立過程中，提高愈傷組織的分化效率是最主要問題。植物的外源激素對愈傷組織不定芽的分化起著重要作用［15-16］，不同激素對不同基因型苜蓿產(chǎn)生的影響也略有不同，3個品種苜蓿相比，當(dāng)培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L 6-BA時，阿爾岡金的分化率最高。多數(shù)植物組織培養(yǎng)過程中，2，4-D阻礙愈傷組織的分化［17］，本試驗也顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中加入2，4-D后，金皇后的分化誘導(dǎo)率降低；聶王星等［18］研究在培養(yǎng)基中添加適量的6-BA和TDZ對大豆的子葉節(jié)叢生芽的誘導(dǎo)有一定促進作用，而在本次試驗中，二者的配比并不能提高苜蓿愈傷的分化能力，可能是不同品種植物對激素的響應(yīng)不同。呂東霞等［19］指出生長素和細胞分裂素結(jié)合使用比單一使用更有利于植物愈傷組織的分化，本試驗中，當(dāng)培養(yǎng)基中添加NAA和KT時，甘農(nóng)1號的分化率最高。李忠光等［20］報道了水解酪蛋白對煙草愈傷組織有促進作用，本試驗培養(yǎng)基中添加同種激素，當(dāng)加入0.5 mg/L的水解酪蛋白時，阿爾岡金的分化率均提高。本研究結(jié)果表明，當(dāng)1/2MS培養(yǎng)基中加入1.0 mg/LIBA時，3個品種苜蓿的生根率均最高，這與葛軍［21］的研究結(jié)果一致。

苜蓿再生體系存在再生周期長、植株再生率低等問題。一般從外植體誘導(dǎo)愈傷到得到再生植株需要3～5個月，在此過程中，愈傷分化出的綠苗數(shù)量較少，還會有出現(xiàn)白化苗現(xiàn)象，雖然本研究通過篩選激素濃度縮短了再生體系建立的時間，但仍存在重復(fù)性差、分化率低等問題，希望能夠進一步改良再生體系，建立更加高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為轉(zhuǎn)基因工作奠定基礎(chǔ)。

［1］從學(xué)滋，秦孟根，王書安. 苜?？傇磉暗奶崛∨c分析［J］. 中藥通報，1998，13（9）：19-20.

［2］黃文惠，劉自學(xué). 概論苜蓿的分布和發(fā)展［A］.耿華珠. 中國苜蓿［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995.

［3］閻旭東，朱志明，李桂榮，等. 六個苜蓿品種特性分析［J］. 草地學(xué)報，2011，9（4）：302-306.

［4］黃遠新. 南方紫花苜蓿不同外植體離體培養(yǎng)的研究［J］. 中國草地，2003，25（3）：42-47.

［5］Saunder J M，Bingham B T. Production of alfalfa plants ：from callus tissue ［J］. Crop Sci，1972（12）：804-808.

［6］王家傳，張利莉. GsPPCK1和GsPPCK3基因轉(zhuǎn)化苜蓿及其耐堿性分析［J］. 塔里木大學(xué)學(xué)報，2014，26（2）：20-31

［7］徐博，任偉. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的朝鮮堿茅PuP5CS基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的研究［J］. 草業(yè)科學(xué)，2015，32（6）：895-901.

［8］薛曉鋒，周巖，陳亞東，等. 超聲波輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)SeNHX1基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的研究［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2014（18）：264-270.

［9］楊權(quán)，王月月，劉炎光，等. 豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化及抗逆基因AtNHX5的轉(zhuǎn)化研究［J］.大豆科學(xué)，2015（2）：205-211.

［10］楊青川. 苜蓿生產(chǎn)與管理指南［M］. 北京：中國林業(yè)出版社，2003.

［11］David A，Stuart，Carol M. McCall Induction of somatic embryogenesis using side chain and ring modified forms of phenoxy acid growth regulators［J］. Plant Physiol，1992，99：111-118.

［12］楊廣東，朱禎，李燕娥，等. 大白菜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2002，10（2）：127-132.

［13］李聰，熊德邵，耿華珠. 苜蓿愈傷組織再生植株研究［J］. 中國草地，1989（3）：51-55.

［14］舒文華，耿華珠，閻倫興，等. 紫花苜蓿胚軸愈傷組織培養(yǎng)與植株再生［J］. 草業(yè)科學(xué)，1993，10（3）：65-67.

［15］王曉春，師尚禮，梁慧敏，等. 2，4-D和6-BA組合配比對金達苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)與分化的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2010，18（2）：119-222.

［16］張元新. 2，4-D濃度對苜蓿愈傷組織分化和再生的研究［J］. 吉林化工學(xué)院學(xué)報，2007，24（4）：14-16.

［17］崔凱榮，戴若蘭. 植物體細胞胚發(fā)生的分子生物學(xué)［M］. 北京：科學(xué)出版社，2000.

［18］聶王星，於丙軍. TDZ和6-BA對大豆子葉節(jié)再生體系中叢生芽誘導(dǎo)的效應(yīng)［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35（4）：130-134.

［19］呂冬霞，曲長福. 植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織培養(yǎng)的影響［J］. 北方園藝，2004（5）：68-72.

［20］李忠光，龔明. 水解酪蛋白對煙草愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細胞生長的促進作用［J］. 云南師范大學(xué)學(xué)報，2006（4）：60-61.

［21］葛軍. 紫花苜蓿組織培養(yǎng)再生體系的研究［D］.北京：北京林業(yè)大學(xué)，2004.

（責(zé)任編輯 張輝玲）

Optimization of high-frequncy regeneration system of Alfalfa

QIN Chu1，LI Yu2，ZHANG Xi-bin1，MA Dong-mei3，XU Xing3
（1.School of Life Science，Ningxia University，Yinchuan 750021，China；2. Agricultural Comprehensive Development Office of Ningxia，Yinchuan 750021，China；3. School of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Hypocotyls of 3 varieties of Alfalfa in 7 days old seedlings were used as explants，Ms medium was used as basic medium，the effects of different concentrations of auxins on Alfalfa callus regeneration system，adventitious bud induction and rooting were studied. The results indicated that， for Golden Empress，Gan-nong No.3 and Algonquin，the best mediums for callus induction were MS+2，4-D 2.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，MS+2，4-D 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L；the best differentiation mediums were MS+6-BA 2.0 mg/L+CH 0.5 g/L，MS+NAA 0.3 mg/L+KT 0.5 mg/L，MS+KT 1.2 mg/L；the best rooting medium for plant development were 1/2MS+IBA 1.0 mg/L.

Medicaho sativa L.；hormones；callus；regeneration system

S541+.1

A

1004-874X（2016）11-0022-05

2016-07-17

項目來源：寧夏自然科學(xué)基金（NZ15002）

秦楚（1992-），女，在讀碩士生，E-mail：932505357@qq.com

許興（1959-），男，博士，教授，E-mail：495323582@qq.com

秦楚，李昱 ，張喜斌，等. 苜蓿高頻再生組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（11）：22-26.