龜致病性維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌雙重PCR檢測方法的建立

丁 利，代小梅，方振華，汪繼超，史海濤

( 1. 海南師范大學 生命科學學院，海南 海口 571158；2. 海南職業(yè)技術(shù)學院 生物工程學院，海南 ?？?570216 )

龜致病性維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌雙重PCR檢測方法的建立

丁 利1，代小梅1，方振華2，汪繼超1，史海濤1

( 1. 海南師范大學 生命科學學院，海南 ?？?571158；2. 海南職業(yè)技術(shù)學院 生物工程學院，海南 ?？?570216 )

應用2對特異性引物，通過對反應條件和體系的優(yōu)化，成功建立了能快速檢測維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌兩種病原的雙重PCR方法。研究結(jié)果表明，該方法特異性強，僅對龜鱉維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌有擴增，而對其他龜鱉常見病原無擴增；該方法對維氏氣單胞菌最低檢測核酸質(zhì)量濃度為1.75×10-3ng/μL，對鮑曼不動桿菌最低檢測核酸質(zhì)量濃度為3.96×10-3ng/μL，檢出率較傳統(tǒng)檢測方法高。該研究所建立的雙重PCR方法靈敏度高、特異性好，可為臨床龜鱉維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌感染的診斷和流行病學調(diào)查等提供幫助。

維氏氣單胞菌；鮑曼不動桿菌；雙重PCR

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)屬于弧菌科、氣單胞菌屬中近年來發(fā)現(xiàn)的新種，可以引起人的胃腸炎、腦膜炎、腹瀉、菌血癥等疾病[1-2]。近年來，越來越多的報道表明，其可感染水生動物并引發(fā)疾病，國內(nèi)學者已從框鏡鯉(Cyprinuscarpio)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)等水生動物體內(nèi)分離到具有較強致病性的維氏氣單胞菌[3-7]。鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是奈瑟氏球菌科、不動桿菌屬中的一種革蘭陰性球桿菌，該菌能通過多種方式感染人和其他動物[8-9]，目前研究發(fā)現(xiàn)，不動桿菌也存在于患病的水生動物體內(nèi)[10-13]。筆者自患病龜體內(nèi)同時分離出維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌，通過動物回歸試驗證實這兩種菌對龜鱉有較強的致病性。兩種病原菌在龜鱉發(fā)病癥狀、剖檢變化等方面有較多的共同點，表現(xiàn)為腹甲和背甲有明顯的潰爛，頸部和四肢有大小不一的白點；剖檢腹腔有惡臭，肝脾腫大，有瘀血，質(zhì)脆易碎，呈紫黑色[14]。該病原常呈混合感染，傳統(tǒng)的檢測技術(shù)很難準確、快速地作出判斷。因此建立一種鑒別維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌及兩種病原混合感染的PCR檢測方法十分必要。該研究選擇維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動桿菌rpoB基因保守序列為靶基因設計了2對特異性引物，建立了快速鑒別診斷維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌及其混合感染的雙重PCR診斷方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

龜源維氏氣單胞菌、鮑曼不動桿菌、松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)、假單胞菌(Pseudomonadaceae)均為實驗室分離、鑒定并保存。

1.2 主要試劑

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒；ExTaq酶(5 U/μL)、pMD18-T載體為Promega公司產(chǎn)品；感受態(tài)細胞購自上海潤成生物科技有限公司；dNTP、DL2000 DNA Marker等購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 引物設計

根據(jù)GenBank中登錄的維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動桿菌rpoB基因保守序列設計兩對特異性引物(表1)，由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

表1 PCR引物的核苷酸序列、擴增長度及登錄號

1. 4 DNA模板的制備

將維氏氣單胞菌、鮑曼不動桿菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，取單個菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，取菌液2 mL按照細菌DNA 提取試劑盒的說明書提取DNA，待檢病料組織DNA的提取步驟按照說明書進行。

1. 5 PCR擴增及雙重反應條件的優(yōu)化

分別針對維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動桿菌rpoB基因2對特異性引物進行PCR反應，反應條件與體系參照ExTaq酶試劑推薦，1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的片段進行凝膠回收與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化，挑取單個陽性菌落并進行重組質(zhì)粒(pMD-gryB和pMD-rpoB)的提取，質(zhì)粒經(jīng)PCR 鑒定后由上海生物工程技術(shù)服務有限公司進行序列測定。采用2對特異性引物，對反應的退火溫度、dNTP濃度、Mg2+濃度、引物濃度等條件進行優(yōu)化，以確定最佳反應體系。按25 μL反應體系：退火溫度分別為54、55、56、57、58、59、60 ℃和61 ℃，dNTP(2.5 mmol/L)分別為1、1.5、2、2.5 μL，Mg2 +(25 mmol/L)分別為1、1.5、2 μL和2.5 μL，引物(10 pmol/L)分別為0.5、1.0、1.5 μL和2.0 μL進行雙重PCR反應條件的優(yōu)化，優(yōu)化一項時保持其他項參數(shù)不變。

1. 6 特異性試驗

分別用龜源維氏氣單胞菌、鮑曼不動桿菌、松鼠葡萄球菌、摩氏摩根菌、假單胞菌基因組DNA 作為模板，按優(yōu)化好的反應體系和反應條件進行PCR 擴增，10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析特異性結(jié)果。

1.7 敏感性試驗

提取維氏氣單胞菌、鮑曼不動桿菌的DNA，經(jīng)核酸蛋白定量儀測定質(zhì)量濃度。將2種菌的DNA等量混勻作為模板，并做10 倍比稀釋，用建立的雙重PCR方法進行擴增，以獲得雙重PCR 反應的敏感性。

1.8 PCR檢測方法的應用

采集來自海南省?？?、東方市等地區(qū)不同養(yǎng)龜場發(fā)病龜?shù)母闻K組織參照1.4方法進行DNA模板的制備并進行雙重和單重PCR檢測，并與傳統(tǒng)方法的鑒定結(jié)果進行比較。

1.9 臨床病料的常規(guī)檢測方法

無菌采取疑似病料，低溫條件下研磨后，用無菌生理鹽水進行稀釋，無菌接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，再挑取單個菌落在無菌條件下進行劃線分離、培養(yǎng)，重復以上步驟，直至菌落特征相同時，再挑取單個菌落涂片，進行革蘭氏染色并鏡檢，觀察菌落形態(tài)及染色特點，并將分離菌純培養(yǎng)物進行生化試驗鑒定。

2 結(jié) 果

2. 1 PCR擴增及雙重PCR反應條件的優(yōu)化結(jié)果

通過用2對特異性引物分別擴增維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動桿菌rpoB基因，出現(xiàn)379、752 bp 大小的片段，與預期結(jié)果一致(圖1)。目的片段測序結(jié)果進行比對分析，結(jié)果顯示，測序結(jié)果與NCBI 中維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動桿菌rpoB基因序列的同源性分別為96%和95% 。

分別對gryB基因和rpoB基因的引物濃度、Mg2+濃度、dNTP濃度、退火溫度進行優(yōu)化，結(jié)果為：10xPCR緩沖液2.5 μL，25 mmol/L的Mg2+2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 2 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.25 μL，gryB基因上、下游引物(10 pmol/L)各0.75 μL，rpoB基因上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 補至25 μL。反應條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共34個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現(xiàn)2條清晰的條帶，大小分別約379 bp 和752 bp(圖1)。

圖1 gyrB、rpoB基因單獨和雙重PCR 擴增結(jié)果

2.2 特異性試驗

特異性試驗結(jié)果顯示，維氏氣單胞菌gryB基因及鮑曼不動桿菌rpoB基因出現(xiàn)2 條清晰條帶，大小分別約379 bp 和752 bp，而龜源假單胞菌、摩氏摩根菌、松鼠葡萄球菌及陰性對照均未擴增出目的片段(圖2)。

圖2 雙重PCR 的特異性試驗結(jié)果注：M,DL2000 DNA Marker; 1,鮑曼不動桿菌; 2,維氏氣單胞菌; 3,鮑曼不動桿菌和維氏氣單胞菌; 4,假單胞菌; 5,摩氏摩根菌; 6,松鼠葡萄球菌; 7,陰性對照.

2.3 敏感性試驗

分別對維氏氣單胞菌DNA(17.5 ng/μL)和鮑曼不動桿菌的DNA(39.6 ng/μL)進行100～106倍比稀釋作為擴增模板，模板混合物雙重PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析表明，雙重PCR對維氏氣單胞菌最低檢測核酸質(zhì)量濃度為1.75×10-3ng/μL，鮑曼不動桿菌最低檢測核酸質(zhì)量濃度為3.96×10-3ng/μL(圖3)。

圖3 雙重PCR的敏感性試驗注：M，DNA標準DL2000; 1～7，模板DNA依次稀釋100～106倍.

2.4 臨床樣本檢測結(jié)果

對臨床疑似病料進行常規(guī)細菌分離培養(yǎng)和PCR方法檢測，36份病料，采用常規(guī)細菌分離培養(yǎng)方法檢出維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌分別為11份和14份，檢出率分別為30.5%和38.9%；雙重PCR方法檢測到維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌感染樣品分別為13份和15份，陽性檢出率分別為36.1%和41.7%，混合感染陽性樣品6 份，陽性檢出率為16.7%(表2)。這與單一PCR的陽性檢出率一致，且敏感度高于常規(guī)檢測方法。

表2 送檢樣品的檢測結(jié)果

3 討 論

鮑曼不動桿菌作為重要條件致病菌可引發(fā)多種動物感染[9]，也有發(fā)現(xiàn)不動桿菌存在于患病的水生動物體內(nèi)[10-12]。目前研究發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌除感染人外，還可引起多種水生動物患病[3-5]，本研究發(fā)現(xiàn)龜維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌是嚴重危害我國龜鱉養(yǎng)殖業(yè)的兩種細菌性傳染病，在臨床上癥狀接近且經(jīng)常呈現(xiàn)混合感染，給我國龜鱉養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。

維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌傳統(tǒng)的檢驗方法包括形態(tài)學檢測、生理生化特征檢測和血清學鑒定等，這些檢測手段不僅工作量大，且耗時較長。目前也有針對維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌建立的雙重PCR檢測方法[15-16]，但建立的方法均是針對單一菌的檢測。維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌引發(fā)龜鱉發(fā)病的研究幾乎未見，對疾病的快速診斷增加了難度，并且作為主要病原菌往往混合感染，導致龜鱉發(fā)病。傳統(tǒng)的檢測方法已不能滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上的診斷要求[17]。研究特異性強、靈敏度高的快速診斷技術(shù)和方法應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖已十分必要。與傳統(tǒng)檢測方法相比，該研究針對龜維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌所建立的雙重PCR檢測方法操作簡單，具有較好的特異性、穩(wěn)定性和較高的敏感性和準確性，能夠?qū)崿F(xiàn)對上述兩種病原的同步快速檢測和區(qū)分診斷，為臨床診斷提供參考。

本次研究檢測引物是參照維氏氣單胞菌的gyrB 和鮑曼不動桿菌rpoB基因序列設計的。近年來，gyrB基因和rpoB基因常分別被應用于氣單胞菌屬和不動桿菌屬菌種分類鑒定[18-19]。該研究所設計的2對特異性引物在優(yōu)化的試驗條件下分別能從維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌中擴增出379 bp 和752 bp的2個DNA片段，而龜源松鼠葡萄球菌、摩氏摩根菌、假單胞菌及陰性對照均未擴增出目的條帶，說明建立的雙重PCR方法具有較高的種特異性。

本次研究對建立的雙重PCR診斷方法的敏感性、臨床實用性進行了分析。結(jié)果顯示，所建立的雙重PCR對維氏氣單胞菌最低檢測核酸質(zhì)量濃度為1.75×10-3ng/μL，鮑曼不動桿菌最低檢測核酸質(zhì)量濃度為3.96×10-3ng/μL。相較于傳統(tǒng)檢測方法，本試驗建立的檢測方法對兩種菌的檢出率高。這說明本試驗所建立的雙重PCR檢測方法可為龜鱉維氏氣單胞菌和鮑曼不動桿菌感染的臨床診斷和流行病學調(diào)查提供幫助。

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EstablishmentofDuplexPCRforDetectionofAeromonasveroniiandAcinetobacterbaumanniifromTurtles

DING Li1, DAI Xiaomei1, FANG Zhenhua2, WANG Jichao1, SHI Haitao1

( 1. College of Life Sciences, Hainan Normal University, Haikou 571158, China;2. School of Biological Engineering, Hainan College of Vocation and Technique, Haikou 570216, China )

In this study, a duplex PCR (dPCR) was established and optimized to detect pathogenic bacteriaAeromonasveroniiandAcinetobacterbaumanniisimultaneously in turtles, and two sets of specific primers were designed for development of the duplex PCR. After optimization of PCR components and reaction profile, a duplex PCR method was established. The results showed that the assay is highly specific toA.veroniiandA.baumannii, and no-target pathogens were detected with the minimum detectable nucleic acid concentration of 1.75×10-3ng/μL inA.veroniiand 3.96×10-3ng/μL inA.baumannii, more sensitive than conventional methods. The duplex PCR established in this study is specific and sensitive, and will be useful for clinical detection and identification ofA.veroniiandA.baumannii.

Aeromonasveronii;Acinetobacterbaumannii; duplex PCR

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.05.023

S947

A

1003-1111(2016)05-0587-04

2016-02-16；

2016-05-03.

國家自然科學基金資助項目(31502036, 31372228)；海南省自然科學基金資助項目(314076, 20153086)；海南省高等學校研究項目(Hnky2016-15).

丁利(1982—)，女，副教授，博士；研究方向：動物疾病. E-mail: dingli705@163.com.通訊作者：史海濤(1963—)，男，教授，博士生導師；研究方向：龜鱉生態(tài)學及保護生物學. E-mail: haitao-shi@263.net.