凍融輔助超聲波法提取金針菇菇根蛋白的工藝研究

朱廣成，魏書信，路風(fēng)銀

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南鄭州 450002）

凍融輔助超聲波法提取金針菇菇根蛋白的工藝研究

朱廣成，魏書信，路風(fēng)銀

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南鄭州 450002）

為了實(shí)現(xiàn)金針菇采后完全利用、提升金針菇采后價(jià)值，以金針菇菇根為試材，采用凍融輔助超聲波法提取金針菇菇根中的蛋白質(zhì)。在單因素試驗(yàn)和組合試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取凍融次數(shù)、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間為提取工藝因素，以蛋白提取得率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳提取工藝參數(shù)為凍融次數(shù)3次，料液比1∶8，超聲功率700 W，超聲時(shí)間11 min，在此最佳工藝條件下的蛋白提取得率為1.31%。凍融輔助超聲波提取為純物理提取方法，整個(gè)提取中無(wú)任何化學(xué)添加，提取工藝安全環(huán)保，具有良好的實(shí)際推廣價(jià)值。

金針菇根；凍融；超聲；蛋白；提取

金針菇是我國(guó)少數(shù)幾個(gè)實(shí)現(xiàn)大范圍工業(yè)化栽培、能全年提供鮮菇供應(yīng)的食用菌品種之一，其富含蛋白質(zhì)、維生素、鐵、鈣、鎂等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有核糖體失活蛋白、金針菇毒素、免疫調(diào)節(jié)蛋白、金針菇多糖等活性成分[1-2]，常食具有提高免疫、抗過(guò)敏等食療功效[3]，故深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。床栽金針菇在采收后商品化出售之前，必須做切根處理，因此每年產(chǎn)生大量的金針菇根。目前，金針菇菇根主要作為飼料或被直接廢棄，產(chǎn)生資源嚴(yán)重浪費(fèi)的同時(shí)還造成環(huán)境污染，而關(guān)于金針菇菇根的研究極少。蛋白質(zhì)是金針菇菇根中的主要成分之一，研究表明，鮮金針菇菇根中的總蛋白質(zhì)含量達(dá)4.07%[4]。以對(duì)金針菇菇根中的蛋白質(zhì)資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，不僅可提高金針菇的采后價(jià)值，還可以減少資源的浪費(fèi)和對(duì)環(huán)境的污染。

蛋白質(zhì)的提取工藝目前應(yīng)用最多的主要有熱水浸提法[5]、堿法[6]、酶法[7]、微波法[8]等。超聲波輔助提取技術(shù)因其具有快速破壁、加速細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出、能耗低、效率高等優(yōu)點(diǎn)而成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。凍融法是利用凍結(jié)解凍過(guò)程中的冰晶作用破壁[9]。凍融和超聲波處理都屬物理破壁技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、不破壞有效成分等共同優(yōu)點(diǎn)。本研究針對(duì)金針菇生產(chǎn)的四季可均衡供應(yīng)特點(diǎn)，以廉價(jià)易得的金針菇鮮根為原料，采用凍融輔助超聲波法提取金針菇根中的蛋白質(zhì)，為金針菇菇根蛋白資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇菇根，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院加工所食用菌基地提供；牛血清白蛋白，購(gòu)于上海艾研生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250、無(wú)水乙醇、磷酸等，均為國(guó)產(chǎn)分析純；試驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV 2802S型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；H2050R型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；DS-1型組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本磨具廠產(chǎn)品；BC/BD-519HAN型冰柜，青島海爾特種電冰柜有限公司產(chǎn)品；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G250法[10-11]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法如下：精確稱取牛血清白蛋白0.100 g，用蒸餾水制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確吸取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL置于具塞試管中，加蒸餾水至1.0 mL，然后加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G250試劑，搖勻，放置2 min后于波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定吸光度。以牛血清蛋白含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=8.986 3X+0.007 6，R2=0.998 4。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取工藝單因素試驗(yàn)

（1） 提取工藝流程。鮮金針菇菇根→清洗→打漿→漿體稱量分組→單因素處理→以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min→二次提取后合并上清液→G250法檢測(cè)并依據(jù)1.3.1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算可溶蛋白含量。

（2）反復(fù)凍融單因素試驗(yàn)。稱取50 g漿體，分成7組并于-18℃冰柜中冷凍至完全凍結(jié)，然后取出在常溫下解凍，如此反復(fù)凍融1，2，3，4，5，6次，以凍融0次為空白對(duì)照組，凍融結(jié)束后的漿體按1∶6的料液比加蒸餾水?dāng)嚢?0 min抽提，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，二次提取后合并上清液，采用G250法檢測(cè)并計(jì)算蛋白提取得率。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算平均值。

（3）超聲波提取單因素試驗(yàn)。稱取50 g漿體，按不同料液比（1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9）、不同超聲功率（300，400，500，600，700，800 W）、不同超聲時(shí)間（3，6，9，12，15，18 min），以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min得上清提取液，采用G250法檢測(cè)計(jì)算蛋白提取得率。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，并計(jì)算平均值。其中，每次做1個(gè)單因素變量試驗(yàn)，上次單因素試驗(yàn)得出的最佳參數(shù)作為下次單因素試驗(yàn)的定量參數(shù)。

1.3.3 工藝組合試驗(yàn)

將凍融和超聲組合成凍融輔助超聲波法應(yīng)用于金針菇菇根蛋白的提取，提取工藝流程如下：

金針菇菇根→清洗→打漿→凍融→超聲波提取→固液分離→可溶蛋白提取液。

提取參數(shù)按照單因素最佳水平，每組樣品量為漿體50 g，采用G250法檢測(cè)并計(jì)算蛋白提取得率。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值為試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.4 工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

為進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取凍融次數(shù)、料液比、超聲功率、超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平組合正交試驗(yàn)，按L9（34）正交表安排試驗(yàn)，試驗(yàn)采用1.3.2中的工藝流程，每組樣品量為漿體50 g，采用G250法檢測(cè)計(jì)算金針菇菇根蛋白提取得率，并以此為評(píng)判指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 反復(fù)凍融對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響

反復(fù)凍融對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 反復(fù)凍融對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響

由圖1可知，各試驗(yàn)組的蛋白提取得率都比對(duì)照組有顯著增加且均差異顯著。前期隨著凍融次數(shù)的增加，蛋白提取得率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，凍融3，4次時(shí)達(dá)到頂峰，凍融3，4次間的蛋白提取得率無(wú)顯著差異（p＜0.05），這可能因?yàn)檫m當(dāng)次數(shù)凍融能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂破壞細(xì)胞膜，另一方面由于細(xì)胞內(nèi)水結(jié)晶膨脹而引起細(xì)胞膨脹破裂，解凍后細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶出，從而提高了蛋白提取得率。凍融4次后蛋白提取得率呈逐漸降低的趨勢(shì)，且與凍融3，4次時(shí)的蛋白提取得率差異顯著，這可能因?yàn)槎啻蔚膬鋈谝鹆说鞍椎淖冃?，進(jìn)而使蛋白提取得率降低?；诤?jiǎn)化操作和節(jié)能考慮，選擇3次為凍融的最佳次數(shù)。

2.1.2 超聲提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

（1）料液比對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響。

料液比對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響見(jiàn)圖2。

稱取50 g漿體，按不同料液比（1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9），在超聲功率400 W下處理5 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min得上清提取液。由圖2可知，前期隨著料液比的增大，金針菇菇根蛋白提取得率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，料液比達(dá)1∶7以后增長(zhǎng)趨緩。料液比1∶7，1∶8，1∶9三者間的蛋白提取得率差異不顯著（p＜0.05），考慮節(jié)水和后續(xù)縮短濃縮時(shí)間的需求，選擇1∶7為最佳料液比。

圖2 料液比對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響

（2）超聲功率對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響。

超聲功率對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲功率對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響

稱取50 g漿體，按料液比1∶7，在不同超聲功率（300，400，500，600，700，800 W） 下處理5 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min得上清提取液，檢測(cè)計(jì)算金針菇菇根蛋白提取得率。由圖3可知，隨著超聲功率的增大，蛋白提取得率呈先增高后降低的趨勢(shì)，超聲功率600 W時(shí)蛋白提取得率最高達(dá)0.752%。分析原因是在一定功率內(nèi)，隨著超聲功率的逐漸加大，大量的聲能轉(zhuǎn)化為彈性波形式的機(jī)械能，引起局部剪切梯度，使細(xì)胞破碎，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，從而提高了蛋白提取得率。繼續(xù)增加超聲功率時(shí)，過(guò)強(qiáng)的“空化效應(yīng)”能導(dǎo)致部分成分的破壞，從而使蛋白提取得率降低[12-13]。因此，選擇600 W為最佳超聲功率。

（3）超聲時(shí)間對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響。

超聲時(shí)間對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響

稱取50 g漿體，按料液比1∶7，超聲功率600 W，超聲處理一定時(shí)間（3，6，9，12，15，18 min），以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min得上清提取液，檢測(cè)計(jì)算蛋白提取得率。由圖4可知，超聲時(shí)間對(duì)金針菇菇根蛋白提取得率的影響呈先快速增長(zhǎng)后逐漸降低的走勢(shì)，超聲時(shí)間9 min時(shí)蛋白提取得率最高為0.797%且與6，12 min差異顯著（p＜0.05）。分析可能原因是在適宜的超聲時(shí)間內(nèi)超聲逐步引起細(xì)胞破裂而促使了蛋白的溶出，使得率逐步升高。但隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，累積的超聲波作用能引起金針菇菇根蛋白的變性甚至降解，從而導(dǎo)致提取得率逐步降低。因此，選擇9 min為最佳超聲時(shí)間。

2.2 工藝組合試驗(yàn)結(jié)果

按照1.3.2工藝流程，參數(shù)為單因素試驗(yàn)最佳水平即凍融次數(shù)3次，料液比1∶7，超聲功率600 W，超聲時(shí)間9 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min得上清提取液，檢測(cè)計(jì)算金針菇菇根蛋白提取平均得率為1.02%，比超聲提取單因素試驗(yàn)最高得率0.797%（基于超聲波提取各最佳單因素水平）提高了28.0%，增長(zhǎng)幅度較大，這說(shuō)明凍融聯(lián)合超聲波法更有利于金針菇根中的蛋白提取。

2.3 工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2中的極差R可以看出，影響金針菇菇根蛋白提取得率的各因素主次順序是超聲功率＞凍融次數(shù)＞料液比＞超聲時(shí)間，即C＞A＞B＞D。由表2中的因素水平K值可以看出，凍融輔助超聲波法提取金針菇菇根蛋白的最佳工藝水平組合為A2B3C3D3，即凍融次數(shù)3次，料液比1∶8，超聲功率700 W，超聲時(shí)間11 min，經(jīng)測(cè)定此最佳工藝條件下的蛋白提取得率為1.31%。此得率較2.2工藝組合中的蛋白提取得率1.02%提高了28.4%，說(shuō)明正交優(yōu)化效果良好。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，凍融和超聲組合更有利于金針菇菇根中蛋白的提取。采用凍融輔助超聲波法提取金針菇菇根蛋白的工藝中，影響蛋白提取得率的主要因素依次為超聲功率、凍融次數(shù)、料液比和超聲時(shí)間。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳提取工藝參數(shù)為凍融次數(shù)3次，料液比1∶8，超聲功率700 W，超聲時(shí)間11 min；在此最佳工藝條件下的金針菇菇根蛋白提取得率為1.31%。凍融輔助超聲波提取為純物理提取方法，整個(gè)提取中無(wú)任何化學(xué)添加，提取工藝安全環(huán)保，具有良好的實(shí)際推廣價(jià)值，為金針菇根的回收利用提供了一種方法和思路。

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Process Optimization of Protein Extraction from Flammulina Velutipes Root Using Ultrasound Assisted by Freezing and Thawing

ZHU Guangcheng，WEI Shuxin，LU Fengyin
（Institute ofAgricultural Products Processing，He'nan AcademyofAgricultural Science，Zhengzhou，He'nan 450002，China）

To make full use and enhance the value of postharvest Flammulina velutipes，the root as material is studied on protein extraction using ultrasound assisted by freezing and thawing.Based on single factor and combination experiments，the freezing and thawing times，solid-liquid ratio，ultrasonic power，ultrasonic time are optimized using protein yield as evaluation index.The optimum extraction parameters obtained by orthogonal test are as follows：the freezing and thawing 3 times，solid-liquid ratio 1∶8，ultrasonic power 700 W，ultrasonic time 11 min.Under the optimized conditions，the extraction rate of protein is 1.31%.The extraction of ultrasound assisted by freezing and thawing is a pure physical method without any chemical additives，safe and environmentally friendly process with good practical promotional value.

Flammulina velutipes root；freezing and thawing；ultrasound；protein；extraction

TQ914.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.006

1671-9646（2016）11a-0018-04

2016-08-01

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院財(cái)政預(yù)算項(xiàng)目（2012035）。

朱廣成（1970—），男，大專，助理研究員，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)。