四種因子對(duì)仿刺參幼參生長(zhǎng)的影響

李石磊，木云雷，滕煒鳴，付成東，劉項(xiàng)峰，于佐安，張 明，王慶志，陳 遠(yuǎn)

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省應(yīng)用海洋生物技術(shù)開(kāi)放試驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

四種因子對(duì)仿刺參幼參生長(zhǎng)的影響

李石磊，木云雷，滕煒鳴，付成東，劉項(xiàng)峰，于佐安，張 明，王慶志，陳 遠(yuǎn)

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省應(yīng)用海洋生物技術(shù)開(kāi)放試驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

以益生菌、水溫、寡糖和配合飼料為因素，仿刺參幼參的特定生長(zhǎng)率為指標(biāo)，通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)方法，研究4種因子對(duì)仿刺參幼參生長(zhǎng)的影響，獲得各因子的最佳組合參數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，4種因子對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率的影響均極顯著(P<0.01)，影響因素為益生菌>水溫>寡糖>配合飼料。最佳的因素搭配為益生菌5 mL/m3，水溫24 ℃，殼寡糖+褐藻膠寡糖混合0.002 g/L，幼參B型配合飼料。各因素水平對(duì)仿刺參幼參特定生長(zhǎng)率影響為益生菌5 mL/m3>15 mL/m3>10 mL/m3，水溫24 ℃>17 ℃>10 ℃，殼寡糖+褐藻膠寡糖>褐藻膠寡糖>殼寡糖，幼參飼料B型>幼參飼料加強(qiáng)型>稚參飼料。

仿刺參；特定生長(zhǎng)率；益生菌；寡糖；正交設(shè)計(jì)

仿刺參(Apostichopusjaponicus)又稱刺參，屬于棘皮動(dòng)物門(mén)、海參綱、楯手目、刺參科、仿刺參屬[1]。海產(chǎn)八珍之一，富含蛋白質(zhì)、黏多糖、維生素、氨基酸、海參皂苷以及多種微量元素和眾多生理活性物質(zhì)，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。刺參產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，總產(chǎn)量10年間增加了27倍[2]，養(yǎng)殖的過(guò)速發(fā)展及集約化養(yǎng)殖模式下的不規(guī)范運(yùn)作導(dǎo)致該產(chǎn)業(yè)存在較多問(wèn)題。如各階段餌料營(yíng)養(yǎng)配比不盡合理，化學(xué)藥品和抗生素的過(guò)量濫用造成環(huán)境污染，導(dǎo)致食品安全隱患，嚴(yán)重影響了該產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。

溫度是影響仿刺參生長(zhǎng)的重要因子之一，過(guò)高或過(guò)低的水溫均會(huì)抑制仿刺參的生長(zhǎng)。適溫范圍內(nèi)，隨著水溫的升高，仿刺參的呼吸和基礎(chǔ)代謝水平增加，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高超出適溫范圍時(shí)，仿刺參的呼吸代謝率又開(kāi)始減慢，降低能量和物質(zhì)的消耗，進(jìn)入夏眠狀態(tài)[3-4]。水溫過(guò)低時(shí)，仿刺參會(huì)進(jìn)入冬季半休眠狀態(tài)。不同規(guī)格的仿刺參對(duì)溫度的適應(yīng)能力不同，小規(guī)格仿刺參的夏眠臨界溫度高于大中規(guī)格[5]。益生菌可以調(diào)整微生態(tài)失調(diào)，保持生態(tài)平衡，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的健康水平，以達(dá)到防病、治病的效果。益生菌作為一種新型的抗生素替代品以其安全、環(huán)保等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖當(dāng)中。益生菌對(duì)仿刺參的養(yǎng)殖水體具有良好的改善作用[6-7]，可有效地提高幼參消化功能和非特異性免疫能力[8-9]，促進(jìn)仿刺參的生長(zhǎng)[10-11]。寡糖,又稱低聚糖,是指2～10個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的直鏈或支鏈的一類(lèi)糖。寡糖可改善水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境,能夠提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫相關(guān)酶的活性,提高機(jī)體的免疫功能,增強(qiáng)其抵抗疾病的能力，是一類(lèi)穩(wěn)定、安全和環(huán)保的抗生素替代物。近年來(lái)的研究表明,通過(guò)注射卡拉膠寡糖可以增強(qiáng)仿刺參免疫活性[12]，飼料中添加殼寡糖，對(duì)仿刺參的生長(zhǎng)和抵抗?fàn)N爛弧菌(Vibriasplendidus)的能力有一定的促進(jìn)作用[13]，飼料中添加半乳甘露寡糖不僅可以提高仿刺參免疫力,并且可以提高特定生長(zhǎng)率,并改善體壁氨基酸組成[14]。仿刺參幼參苗種的室內(nèi)養(yǎng)殖需要投喂一定比例的人工配合飼料，飼料的質(zhì)量是關(guān)系刺參生長(zhǎng)和水體環(huán)境的重要因素，不同原料成分和配比的配合飼料對(duì)仿刺參生長(zhǎng)的影響也有所不同。我國(guó)學(xué)者在仿刺參飼料的蛋白和脂肪需求量、不同蛋白來(lái)源組成、飼料添加劑等方面做過(guò)大量的研究[15-18]。研究表明，仿刺參稚參在粗蛋白水平為18.21%～24.18%、粗脂肪為5%時(shí)，獲得最大生長(zhǎng)；投喂植物性為主的飼料時(shí)，仿刺參的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高；飼料中添加甘草酸、硒酵母和維生素E對(duì)仿刺參的特定生長(zhǎng)率均有顯著的影響。

本試驗(yàn)主要針對(duì)仿刺參幼參培育階段，利用正交設(shè)計(jì)方法，探討溫度、益生菌、寡糖、配合飼料4種因子對(duì)仿刺參幼參生長(zhǎng)的影響，獲得上述各因子的最佳組合參數(shù)，為安全健康的仿刺參養(yǎng)殖模式構(gòu)建提供可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 益生菌、寡糖和配合飼料

試驗(yàn)用益生菌為工大3號(hào)，由大連工業(yè)大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。主要成分為該實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的菌株芽孢桿菌(Bacillus)2株、乳酸桿菌(Lactobacillus)2株及實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌和乳酸菌，6株菌進(jìn)行混合培養(yǎng)，混合培養(yǎng)的活菌數(shù)達(dá)1.0×108cfu/mL；殼寡糖和褐藻膠寡糖由大連化學(xué)物理研究所提供；配合飼料分為幼參B型，幼參加強(qiáng)型，稚參類(lèi)3種，由大連海洋大學(xué)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

幼參購(gòu)自大連水益生海洋生物科技有限公司，個(gè)體濕質(zhì)量(1.52±0.34) g，試驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)4個(gè)因素3個(gè)水平(表1)，各組因素水平正交設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。試驗(yàn)采用9個(gè)1.6 m3水槽，每個(gè)水槽內(nèi)懸掛3個(gè)聚乙烯網(wǎng)片制作成的網(wǎng)箱作為平行組，網(wǎng)箱口高于水面以防幼參爬出，網(wǎng)箱內(nèi)放上與箱底大小相當(dāng)?shù)暮谏y板一塊,板上鉆有直徑2 cm的小孔5～7個(gè)，便于幼參附著攝食和餌料投喂，利用控溫設(shè)備使各組水溫變化幅度保持±0.5 ℃。每個(gè)網(wǎng)箱內(nèi)放置幼參30頭，試驗(yàn)開(kāi)始前饑餓48 h，用分析天平逐個(gè)測(cè)量全部幼參個(gè)體濕質(zhì)量，試驗(yàn)期間每日16:00投喂配合餌料，投喂量為幼參體質(zhì)量的10%，益生菌和寡糖每5 d投放一次，每次的投放量為寡糖2 mg/L，寡糖混合組為殼寡糖+褐藻膠寡糖各1 mg/L。每10 d換水一次。62 d后試驗(yàn)結(jié)束，饑餓48 h，用分析天平逐個(gè)測(cè)量全部幼參個(gè)體濕質(zhì)量。計(jì)算各網(wǎng)箱幼參特定生長(zhǎng)率：

特定生長(zhǎng)率/%·d-1=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中，m0為幼參個(gè)體平均初質(zhì)量(g)，mt為幼參個(gè)體平均末質(zhì)量(g)，t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析處理均使用SPSS 16.0軟件。

表1 因素水平

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組幼參生長(zhǎng)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明,第7組的幼參特定生長(zhǎng)率值最高，其次是第4組，然后是第9組， 24 ℃下,3組幼參的特定生長(zhǎng)率平均值要高于17 ℃和10 ℃組， 17 ℃下,3組的特定生長(zhǎng)率平均值高于10 ℃(表2)。在試驗(yàn)階段，幼參的特定生長(zhǎng)率值隨著水溫的升高而變大。

表2 各組試驗(yàn)幼參特定生長(zhǎng)率

2.2 正交方差分析

將幼參特定生長(zhǎng)率取反正弦值，通過(guò)SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。4種因素對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率的影響均極顯著(P<0.01)，水溫和益生菌(P=0.000)較寡糖(P=0.006)和配合飼料(P=0.008)對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率有更大的影響，益生菌的平方和大于水溫的平方和，故益生菌對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率的影響大于水溫。影響因素的順序?yàn)橐嫔⑺疁?、寡糖和配合飼料?/p>

表3 方差分析

2.3 水溫對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率的影響

水溫對(duì)幼參的特定生長(zhǎng)率，24 ℃均值最大(32.324)￣(表4),且24 ℃>17 ℃>10 ℃(表4)；由水溫配對(duì)比較(表5)可見(jiàn)，24 ℃與10 ℃及17 ℃的幼參特定生長(zhǎng)率差異極顯著(P<0.01)，10 ℃和17 ℃的幼參特定生長(zhǎng)率差異顯著(0.01

表4 水溫單因素統(tǒng)計(jì)量

表5 水溫的配對(duì)比較

2.4 益生菌對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率的影響

益生菌對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率，5 mL/m3試驗(yàn)組均值最大(32.900)(表6),且5 mL/m3>15 mL/m3>10 mL/m3；由益生菌配對(duì)比較(表7)可見(jiàn)，5 mL/m3試驗(yàn)組與10 mL/m3、15 mL/m3試驗(yàn)組的幼參特定生長(zhǎng)率差異極顯著(P<0.01)，10 mL/m3和15 mL/m3試驗(yàn)組的幼參特定生長(zhǎng)率差異不顯著(P>0.05)。

表6 益生菌單因素統(tǒng)計(jì)量

表7 益生菌的配對(duì)比較

2.5 寡糖對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率的影響

殼寡糖+褐藻膠寡糖的幼參特定生長(zhǎng)率，均值最大(30.468),且殼寡糖+褐藻膠寡糖>褐藻膠寡糖>殼寡糖(表8)；殼寡糖與褐藻膠寡糖差異顯著(0.010.05)(表9)。

表8 寡糖單因素統(tǒng)計(jì)量

表9 寡糖的配對(duì)比較

2.6 配合飼料對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率的影響

配合飼料對(duì)幼參生長(zhǎng)率，幼參B型均值最大(30.96),且幼參B型>幼參加強(qiáng)型>稚參類(lèi)(表10)；由配合飼料配對(duì)比較(表9)可見(jiàn)，稚參類(lèi)與幼參B型差異極顯著(P<0.01)，稚參類(lèi)和幼參加強(qiáng)型差異不顯著(P>0.05)，幼參B型和幼參加強(qiáng)型差異不顯著(P>0.05)。

表10 配合飼料單因素統(tǒng)計(jì)量

表11 配合飼料配對(duì)比較表

綜合以上正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果可知，各因素水平對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率影響的強(qiáng)弱順序?yàn)椋阂嫔?、15、10 mL/m3，水溫24、17、10 ℃，殼寡糖+褐藻膠寡糖>褐藻膠寡糖>殼寡糖，幼參B型>幼參加強(qiáng)型>稚參類(lèi)。4種因素對(duì)幼參特定生長(zhǎng)率的影響均極顯著(P<0.01)，影響因素的順序?yàn)橐嫔?水溫>寡糖>配合飼料。因此可以確定最佳的因素搭配為益生菌5 mL/m3，水溫24 ℃，殼寡糖+褐藻膠寡糖2 mg/L，幼參B型。這與本次試驗(yàn)的結(jié)果位次相同。

3 討 論

3.1 溫度對(duì)仿刺參幼參生長(zhǎng)的影響

不同規(guī)格的仿刺參對(duì)溫度的適應(yīng)能力也不盡相同。Yang等[12]采用質(zhì)量20～134 g的仿刺參進(jìn)行研究，認(rèn)為最佳生長(zhǎng)溫度為10～20 ℃；Dong[13]采用9～10 g的仿刺參進(jìn)行研究，認(rèn)為在12～18 ℃，仿刺參幼參的生長(zhǎng)速度隨著溫度的升高而增加，但過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)速度下降，仿刺參幼參的適溫為12～21 ℃，最適生長(zhǎng)水溫為16～18 ℃[14]。本試驗(yàn)中生長(zhǎng)率最高的組別溫度為24 ℃，仿刺參體質(zhì)量為(1.52±0.34) g，推測(cè)這可能是由于本次試驗(yàn)所用仿刺參規(guī)格不同于以上研究所導(dǎo)致。夏季仿刺參幼參室內(nèi)保苗處于高水溫期，本試驗(yàn)所選用24 ℃水溫也是從現(xiàn)實(shí)角度考慮，試驗(yàn)結(jié)果對(duì)生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)作用。

3.2 益生菌和益生元對(duì)仿刺參生長(zhǎng)的影響

根據(jù)微生態(tài)制劑的物質(zhì)組成，可將其劃分為益生菌、益生元和合生元。目前水產(chǎn)中常用的益生菌種類(lèi)包括弧菌屬(Vibrio)、芽孢桿菌屬、酵母菌屬(Saccharomyces)及乳酸菌屬一些種類(lèi)。益生元指一些非消化性食物成分，最早發(fā)現(xiàn)的益生元是雙歧因子，后來(lái)發(fā)現(xiàn)多種不能消化的寡糖可作為益生元。合生元為益生菌和益生元結(jié)合的生物制劑，其特點(diǎn)是同時(shí)發(fā)揮益生菌和益生元的作用。

有研究表明,在仿刺參養(yǎng)殖中投喂益生菌，可以有效的改善水質(zhì)，同時(shí)益生菌本身含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)[19]，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、抑制和排斥作用，幫助建立和維持正常的水產(chǎn)動(dòng)物腸道優(yōu)勢(shì)種群，提高無(wú)脊椎動(dòng)物體液因子中的酶活力，增強(qiáng)免疫力和抗病性。益生菌可以減少機(jī)體皮質(zhì)醇的分泌和熱休克蛋白的表達(dá)，提高水產(chǎn)動(dòng)物應(yīng)激條件下的耐受力[20-21]。在海參養(yǎng)殖中添加益生菌，可以有效促進(jìn)刺參的生長(zhǎng)，如袁成玉等[7]使用光合細(xì)菌和芽孢桿菌投喂幼參能明顯促進(jìn)幼參生長(zhǎng)；周慧慧等[8]采用分離自刺參腸道的益生菌投喂稚參，顯著提高了稚參的成活率和生長(zhǎng)率。也有學(xué)者對(duì)益生元在仿刺參養(yǎng)殖中的作用進(jìn)行了研究，韓麗蓉等[10]進(jìn)行了殼寡糖對(duì)仿刺參生長(zhǎng)、免疫反應(yīng)和抗病力的影響研究，結(jié)果表明飼料中添加殼寡糖對(duì)仿刺參的生長(zhǎng)有一定程度的促進(jìn)作用，能提高機(jī)體免疫反應(yīng)，并在一定程度上增強(qiáng)仿刺參抗病力。王際英等[11]研究發(fā)現(xiàn)，以飼料添加劑的形式在仿刺參配合飼料中添加適量的半乳甘露寡糖不僅可以提高其特定生長(zhǎng)率,改善體壁營(yíng)養(yǎng)組成,還可以提高仿刺參機(jī)體免疫力,在 0.2%添加量即可起到促進(jìn)生長(zhǎng)、提高免疫力的作用,當(dāng)添加量高于1.2%時(shí)，降低了仿刺參的生長(zhǎng)性能及相關(guān)免疫酶活性。益生菌和益生元在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中的相互作用是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，果糖和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)可以顯著的提高三角魴(Megalobramaterminalis)免疫力和抗氧活能力，混合投喂的效果好于單獨(dú)投喂。Lin等[23]研究表明殼寡糖和凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)提高錦鯉(Cyprinuscarpio)的免疫力和抗病力。Ai等[24]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)可以促進(jìn)大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)生長(zhǎng)，增強(qiáng)免疫力，但單獨(dú)使用低聚果糖以及二者混合使用效果不明顯。Daniels等[25]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中補(bǔ)充益生菌、益生元和合生元，可以改善歐洲龍蝦(Homarusgammarus)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)和存活率，芽孢桿菌能大幅度提高幼蟲(chóng)的抗逆性。在海參飼料中添加枯草芽孢桿菌和果聚糖，枯草芽孢桿菌和果聚糖可協(xié)同作用，有效提高仿刺參免疫力，改善抗病力[26]。在本試驗(yàn)中所用的益生菌為芽孢桿菌、乳酸菌及酵母菌混合菌類(lèi)，試驗(yàn)嘗試了不同投喂劑量的益生菌和不同種類(lèi)寡糖的配比組合，結(jié)果表明，5 mL/m3的益生菌與0.002 g/L的褐藻膠寡糖+殼寡糖混合搭配投喂條件下，仿刺參幼參的生長(zhǎng)速度最快，而這種搭配組合對(duì)仿刺參幼參的免疫指標(biāo)的影響及其作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

4種因素對(duì)仿刺參幼參的生長(zhǎng)均具有極顯著影響，其影響效果依次為益生菌>水溫>寡糖>配合飼料。最佳的投喂組合為即益生菌5 mL/m3，水溫24 ℃，殼寡糖+褐藻膠寡糖2×10-6mg/L，幼參B型。本次試驗(yàn)通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究了水溫、復(fù)合益生菌、寡糖和配合飼料4種因素對(duì)仿刺參幼參生長(zhǎng)的影響，找到了仿刺參幼參保苗階段各因素的最佳配比組合，為安全健康的仿刺參保苗新模式的構(gòu)建提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

致謝：

感謝大連工業(yè)大學(xué)肖珊老師、大連化學(xué)物理研究所許青松副研究員和大連海洋大學(xué)任同軍老師提供的益生菌、寡糖和配合飼料。

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EffectsofProbiotics,Temperature,Oligosaccharide,andFormulatedFeedonGrowthinJuvenileSeaCucumberApostichopusjaponicus

LI Shilei,MU Yunlei,TENG Weiming,FU Chengdong,LIU Xiangfeng,YU Zuoan,ZHANG Ming,WANG Qingzhi,CHEN Yuan

( Liaoning Key Lab of Marine Fishery Molecular Biology,Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute,Dalian 116023,China )

Effects of probiotics,water temperature,oligosaccharide,and formulated feed on specific growth rate of juvenile sea cucumberApostichopusjaponicuswere investigated in a L9(34) orthogonal experiment to optimize the four factors.The results showed that there was significant influence of the factors on specific growth rate of juvenile sea cucumber (P<0.01),as the order of probiotics> water temperature> oligosaccharide> formulated feed.The best growth performance of the juveniles was observed under the conditions of probiotic at a dose of 5 mL/m3,water temperature 24 ℃,oligochitosan and alginate oligomers mixed at a dose of 0.002 g/L,and formulated feed type B.The strong-to-weak order of various factors and levels on specific growth rate of the juveniles was expressed as probiotic 5 mL/m3>15 mL/m3>10 mL/m3,water temperature 24 ℃>17 ℃>10 ℃,oligochitosan and alginate oligomers mixed> alginate oligomers > oligochitosan,type B for sea cucumber juvenile > fortified feed of sea cucumber juvenile > feed for sea cucumber juvenile.

Apostichopusjaponicus;specific growth rate(SGR);probiotic;oligosaccharide;orthogonal design

S968.9

A

1003-1111(2016)01-0021-06

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.004

2015-05-07；

2015-09-15.

遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015103044);大連市科技興海專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(大海漁科字20140101)；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B14NC127).

李石磊(1981-)，男，助理研究員;研究方向：海洋動(dòng)物遺傳育種與養(yǎng)殖技術(shù).E-mail:lnlylsl@126.com.通訊作者：陳遠(yuǎn)(1960-)，男，研究員;研究方向：海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物繁育及增養(yǎng)殖技術(shù).E-mail:chenyuan65432101@sina.com.