仔豬水腫病大腸桿菌O8型的分離與鑒定

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

仔豬水腫病大腸桿菌O8型的分離與鑒定

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

對山東東營某豬場送檢的病死豬進行病原菌分離，對分離細菌進行形態(tài)學觀察、生化試驗、PCR鑒定、藥敏試驗和動物致病性試驗。染色鏡檢、生化試驗結果及PCR試驗證實成功分離到一株O8型大腸桿菌，藥敏試驗結果證實該菌株具有多重耐藥性，致病性試驗中該菌株對昆明系小白鼠、仔豬均具有一定的致病性。

大腸桿菌；分離；鑒定

仔豬大腸桿菌病是由某些血清型大腸桿菌引起的腸道毒血癥，是由致病性大腸桿菌引起的豬常見傳染病，主要包括仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病[1-2]。豬水腫病多發(fā)于斷奶仔豬，尤其是生長快、體況健壯的仔豬最為常見，該病發(fā)病率不高，但病死率很高[3]，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大損失[4]。2016年2月，山東東營某豬場斷奶仔豬四肢出現(xiàn)不能站立、共濟失調(diào)、倒地、四肢呈劃水狀運動等神經(jīng)癥狀，眼瞼和頸部水腫。剖檢可見腸系膜水腫、胃壁呈膠凍樣水腫、腸系膜淋巴結呈串珠狀腫大、下頜淋巴結水腫、肺臟淤血水腫、膽囊水腫、腎包膜水腫。筆者無菌操作取病死豬的肝臟和腸系膜淋巴結進行分離鑒定，成功分離到一株O8型大腸桿菌，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料、試劑和試驗動物

無菌采取病死豬肝臟、腸系膜淋巴結等病料。草酸銨結晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復紅染液、血瓊脂平板、普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和肉湯液體培養(yǎng)基均由山東綠都生物科技有限公司質(zhì)檢部提供。DL 2 000 Marker、TagDNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，藥敏紙片、糖發(fā)酵管及生化試驗用各種試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。大腸桿菌O型單價陽性標準血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。10只18～22 g清潔級昆明系小鼠購自山東省實驗動物中心，30日齡斷奶仔豬購自濱州周邊豬養(yǎng)殖戶。

1.2 引物設計與合成

根據(jù)GenBank中登錄的大腸桿菌16S rRNA基因序列，設計1對引物，上游引物：5′-TGGCGG ACGGGTGAGTAA-3′，下游引物：5′-CGTCATCCCCA CCTTCCTC-3′，擴增的基因序列為1 091 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 細菌檢測與分離培養(yǎng)

將無菌采取的病死豬肝臟、腸系膜淋巴結病料涂片或觸片、干燥、固定，革蘭氏染色、鏡檢，觀察有無細菌及其形態(tài)特征，然后將病料劃線接種于血液瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，對可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色鏡檢。挑取單個可疑菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察生長情況，對可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色鏡檢[5]。

1.4 生化鑒定

分別將分離菌經(jīng)24 h營養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)后，進行糖發(fā)酵試驗及其他生化試驗。

1.5 PCR鑒定

挑取麥康凱營養(yǎng)瓊脂上單個菌落作為PCR的模板，進行PCR擴增。反應體系（50 μL）：10×Buffer（含氯化鎂）5 μL，上、下游引物各2 μL（20 pmol/L）。dNTP 4 μL，TagDNA聚合酶0.5 μL，模板1 μL，加水補足至50 μL。擴增反應程序：94℃5 min；94℃50 s，55℃50 s，72℃50 s，30個循環(huán)，72℃7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測?；厥誔CR產(chǎn)物，連pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑單菌落，振搖培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，再次鑒定，將鑒定陽性的質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6 藥敏試驗

采用藥敏紙片瓊脂擴散法（Kirby-Bauer法）進行，方法如下：將分離菌18 h肉湯純培養(yǎng)物做10倍稀釋，用無菌棉簽均勻涂布于麥康凱營養(yǎng)瓊脂平板上。用無菌眼科鑷子將藥敏紙片輕輕緊貼于平板上，使紙片之間距離適當，置37℃培養(yǎng)16～18 h后觀察結果并測量抑菌圈直徑。

1.7 O抗原血清型鑒定

從麥康凱瓊脂平板上挑取單菌落，接種于肉湯培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，離心取沉淀，加入滅菌的0.5%石炭酸生理鹽水制成菌懸液，置于121℃下高壓2 h，作為待檢抗原，取制備的待檢抗原和大腸桿菌O抗血清各10 μL，在玻璃板上混勻，同時設生理鹽水對照，觀察并記錄反應結果，30 s內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集則判為陽性，否則為陰性。

1.8 致病性試驗

1.8.1 小白鼠致病性試驗將10只小鼠隨機分成2組，分別為試驗組和對照組，每組5只。試驗組取37℃24 h肉湯純培養(yǎng)物（含菌量9×108CFU/mL）腹腔注射接種18～22 g小白鼠，0.2 mL/只；對照組小白鼠腹腔注射肉湯0.2 mL/只。注射后小白鼠隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況，并對死亡小白鼠進行細菌分離。

1.8.2 豬致病性試驗用上述菌液，選擇30日齡家豬6頭，平均分成2組，每組3頭，試驗組每只肌肉注射1.0 mL分離菌純?nèi)鉁囵B(yǎng)物，對照組每只皮下注射1.0 mL無菌肉湯。隔離飼養(yǎng)，觀察豬發(fā)病及死亡情況，并對死亡豬肝臟、腸系膜淋巴結等涂片染色鏡檢，再次進行細菌分離。

2 結果與分析

2.1 細菌檢測與分離培養(yǎng)結果

腸系膜淋巴結、肝臟觸片革蘭氏染色鏡檢，可見兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。37℃培養(yǎng)24 h后，在血瓊脂平皿上有邊緣整齊、光滑、濕潤、半透明的圓形菌落生長。在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上為邊緣整齊、表面光滑、濕潤、圓形、桃紅色菌落。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上也有圓形、半透明菌落，肉湯培養(yǎng)基呈均勻渾濁狀。分別挑取單個菌落和渾濁菌液涂片進行革蘭氏染色，鏡檢為中等大小、兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。

2.2 生化試驗結果

由表1可知，該分離株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、果糖、木糖、半乳糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇，不能發(fā)酵肌醇、衛(wèi)矛醇、赤鮮醇、菊糖，V-P試驗陰性，M-R試驗陽性，靛基質(zhì)試驗陽性，氧化酶、尿素酶陰性，硫化氫試驗陰性，與大腸桿菌的生化特征一致。

表1 分離菌的生化試驗結果

2.3 PCR鑒定

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小為1 091 bp，與預期結果一致（圖1）。PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接后，送公司測序。測序結果與GenBank登錄的大腸桿菌16S rRNA基因的相似性為100%。

圖1 大腸桿菌分離株PCR檢測結果

2.4 藥物敏感性試驗結果

由表2可知，分離菌對左氧氟沙星、頭孢曲松、新霉素、氟苯尼考高敏，對四環(huán)素、卡那霉素、環(huán)丙沙星中敏，對青霉素G、強力霉素、泰樂菌素、紅霉素、鏈霉素、氨芐西林、磺胺甲氧嘧啶耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗結果mm

2.5 血清型鑒定結果

玻片凝集試驗結果顯示，該菌的O抗原血清型為O8。

2.6 致病性試驗

2.6.1 小鼠致病性試驗試驗組小白鼠注射分離菌6 h后出現(xiàn)眼瞼、面部水腫、精神委靡、食欲不振，同時伴有共濟失調(diào)、麻痹等神經(jīng)癥狀，48 h內(nèi)全部死亡。剖檢小鼠肝臟和脾臟腫大、肺臟有點狀出血，胃壁和腸系膜漿液性水腫、腸黏膜出血。其他臟器未見明顯眼觀病變。取攻毒死亡小鼠肝臟和腸系膜淋巴結等劃線接種于麥康凱平板，涂片染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)為革蘭氏陰性短小桿菌。對照組小白鼠未見異常。

2.6.2 家豬致病性試驗試驗組家豬攻毒后12 h可見精神委靡，豬眼瞼和頸部高度水腫、不能站立、呈劃水狀運動，剖檢可見胃壁水腫、尤其是胃大彎水腫嚴重，腸系膜水腫、全身淋巴結水腫，肺水腫、心臟水腫。4 d內(nèi)全部死亡，取死亡豬腸系膜淋巴結、肝臟等分離細菌、涂片，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌。菌落PCR結果顯示，在1 091 bp左右有特異性條帶，說明從病變組織中分離到大腸桿菌。對照組家豬無任何臨床癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)各組織器官正常。

3 討論

選擇細菌性疾病病原分離時，要選擇有代表性的病例，并且最好是最近1周未經(jīng)抗生素治療的病豬，無菌操作采樣，保證用于細菌分離的病料無人為污染，必須新鮮運送，保證整個過程病料始終處于低溫狀態(tài)。

由于養(yǎng)豬場長期用藥不規(guī)范及飼料中抗生素的大量添加，使豬大腸桿菌的抗藥性日益嚴重，給豬大腸桿菌病的治療造成很大的困難。藥敏試驗結果表明，該分離株對左氧氟沙星、頭孢曲松、新霉素、氟苯尼考高度敏感，因此，可選取這些藥物進行治療以提高療效，多種藥物交替、輪換使用，避免再次產(chǎn)生耐藥性。建議以后如果豬場有細菌病暴發(fā)，都要將細菌分離鑒定，并進行藥敏試驗，以便有針對性的用藥，使豬場損失降低。

對畜禽傳染病應該堅持防重于治的原則，以預防為主。豬大腸桿菌病也是如此，日常應加強飼養(yǎng)管理，注意防寒保暖，減少天氣變化、營養(yǎng)因素等外界條件對豬的影響，提高豬的抗病能力，同時做好消毒與滅蠅、滅蚊工作，保持豬場清潔衛(wèi)生。大腸桿菌血清型眾多，對家豬致病的大腸桿菌血清型有O2、O8、O138、O139、O141等，各血清型之間交叉保護性效果不好。臨床中大腸桿菌優(yōu)勢血清型具有一定的區(qū)域性，可以篩選優(yōu)勢血清型且具有良好免疫原性的菌株制備多價苗進行免疫預防。

[1]劉峰，張進，劉毅.豬大腸桿菌病防治研究進展[J].湖南畜牧獸醫(yī)，2010（6）：1-3.

[2]吳文福，巫月生，賴月輝，等.豬大腸桿菌病的流行特點[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2001，26（1）：13-15.

[3]謝金文，董林，苗立中，等.豬水腫病大腸桿菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（3）：121-122.

[4]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：111-119.

[5]胡桂學.獸醫(yī)微生物學實驗教程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2006：35-38.

（編輯：富春妮）

伸筋拉骨益壽延年

常言道：“筋長一寸，壽延十年?！蔽以诰毩暁夤r，充分注意到了伸筋和拉骨。這樣做的好處是使全身舒展，又可以打通經(jīng)絡。在《鶴翔莊氣功》中，第一節(jié)六方和合，兩手掌向上，兩手臂盡量向前伸展，這樣反復做3遍，接著做下一個動作，兩手臂回收，再向左右伸展，手掌還是向上，這一舉和一伸，都要伸展盡量充分，這樣就做到了伸筋和拉骨。當然，兩手臂在做回收和舒展時，要緊密地配合呼吸，呼吸要細、長、勻、緩。在一呼一吸中，練功者就吸收了天地中的精華，同時也排出了全身的廢氣。

同樣，在乒乓球運動中，我也著重練習伸筋拉骨的動作。例如，乒乓球運動的技術動作正拉弧圈球與直板橫打，最能說明問題。正接弧圈球與直板橫打的技術要領是用球拍的正上部擊球，要求吸球、拉球與發(fā)力一氣呵成，右臂盡量往上拉（小臂一定要超過肩的高度），這樣拉過去的球速度快、旋轉(zhuǎn)快，失誤也少。手臂盡量往上拉的過程就是伸筋拉骨的過程。運動中，拉動了手臂外側的小腸經(jīng)，也拉動了手臂上的肺經(jīng)、心經(jīng)、大腸經(jīng)和心包經(jīng)，這些經(jīng)絡都被打通了。這兩項技術在乒乓球運動中是使用頻率很高的技術，平均每分鐘要做四五次，打1個小時的乒乓球，大約要做200次。這200次的運動對手臂部位的各經(jīng)絡進行了疏通和調(diào)理，就對消化、循環(huán)、泌尿、內(nèi)分泌和呼吸系統(tǒng)起到了很好的調(diào)理作用。

（摘自《中老年保健》2015-12范良善/文）

Isolation and Identification of Escherichia coli Serotype O8 from Edema Disease of Pigs

LI Tianzhi,YU Xinyou
(Shandong Lvde Bio-Industry Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China)

The pathogen was isolated on a dead pig from a Shandong Dongying farm.The serotype O8 Escherichia coli was confirmed by morphological observation,biochemical test,PCR assay,drug sensitive test and animal infection experimen.Results showed the isolates with multidrug-resistant,had certain pathogenic to Kunming mice and weaning pigs.

Escherichia coli;isolation;identification

S858.282.61+5

A

1002-1957(2016)04-0118-03

2016-06-25

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-06-022-15）；山東省自然科學基金項目（ZR2014CQ012）

李天芝（1985-），女，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術研究工作.E-mail:517493935@qq.com