增液湯對(duì)原發(fā)性干燥綜合征小鼠干預(yù)作用實(shí)驗(yàn)研究

國(guó)小紅

(泰安市中醫(yī)醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，山東 泰安 271000)

?

增液湯對(duì)原發(fā)性干燥綜合征小鼠干預(yù)作用實(shí)驗(yàn)研究

國(guó)小紅

(泰安市中醫(yī)醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，山東 泰安 271000)

目的:觀察增液湯對(duì)干燥綜合征(SS)小鼠的脾臟指數(shù)、血清TNF-α、血清INF-γ、血流變的干預(yù)作用。方法:50只小鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、增液湯低、中、高劑量組，自身同種鼠抗原合并百白破疫苗造模，增液湯連續(xù)灌胃6周，實(shí)驗(yàn)?zāi)z測(cè)SS小鼠的脾臟重量及指數(shù)，血流變，血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(INF-γ)等指標(biāo)。結(jié)果:與正常組動(dòng)物比較，模型組小鼠脾臟重量、指數(shù)升高，TNF-α、INF-γ、ηL、ηH、RV升高；與模型組比較，增液湯中、高劑量組脾臟重量、指數(shù)降低，TNF-α、INF-γ、ηL、ηH、RV降低。結(jié)論:增液湯可干預(yù)SS小鼠的脾臟指數(shù)、血清TNF-α、INF-γ及血流變，其治療SS的機(jī)制可能與干預(yù)其免疫平衡有關(guān)。

增液湯；干燥綜合征；脾臟指數(shù)； TNF-α；INF-γ；血流變

干燥綜合征(Sjogren′s syndrome, SS)是一種因遺傳、內(nèi)分泌異常等因素引起的以外分泌腺功能異常為主的多器官受累的慢性、自身免疫性疾病。目前SS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，SS的發(fā)病主要與免疫失衡、內(nèi)分泌異常、外分泌腺細(xì)胞凋亡異常等原因有關(guān)，尚無(wú)安全有效的治療藥物[1]。近年來(lái)，中醫(yī)藥調(diào)節(jié)免疫功能的作用逐漸被證實(shí)[2-3],中醫(yī)藥因其對(duì)機(jī)體免疫功能良好穩(wěn)定的調(diào)節(jié)作用及安全性，在SS治療中展現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。增液湯是《溫病條辨》中用于陰液虧虛的基礎(chǔ)方，本研究主要探討增液湯對(duì)SS小鼠的干預(yù)作用，進(jìn)而探索其對(duì)SS小鼠的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 實(shí)物動(dòng)物 雌性SPF級(jí)C57BL/6小鼠，18-22 g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院，許可證編號(hào)：SCXK(京)2009-0120，飼養(yǎng)環(huán)境12 h明暗交替，溫度20～23 ℃，相對(duì)濕度40～60%。

1.1.2 主要儀器與試劑 AL204精密分析天平，上海迅達(dá)醫(yī)療器械公司；DL - 5 低速離心機(jī),鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)易有限公司；XD711酶標(biāo)儀，美國(guó) TOLEDO公司； LBY - N6B 型血液黏度儀,北京普利生儀器有限公司;弗氏完全佐劑，Sigma,USA,Lot:038K9719；吸附無(wú)細(xì)胞百日咳、白喉、破傷風(fēng)聯(lián)合疫苗，成都生物制品研究所，批號(hào)082012；TNF-α ELISA試劑盒，美國(guó)R&D公司，批號(hào)：20150820CN；INF-γ ELISA試劑盒，美國(guó)R&D公司，批號(hào)：20151001BV。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及給藥 56只小鼠中隨機(jī)選6只取下頜腺制備抗原，剩余50只隨機(jī)分為：正常組、模型組、增液湯低劑量組、增液湯中劑量組、增液湯高劑量組，每組10只。除正常組及6制備抗原小鼠外，其余小鼠均采用自身同種鼠抗原合并百白破疫苗造模。

1.2.2 抗原制備 隨機(jī)取6只小鼠下頜腺，分離包膜及結(jié)締組織，剔除淋巴結(jié)，生理鹽水洗凈，剪碎，冰浴中5000 r/min勻漿20 s后，于4 ℃ 3000 r/min離心10 min，低溫環(huán)境下吸出抗原上清液，置于試管中。測(cè)定蛋白濃度后，生理鹽水中制成0.4 mg/mL濃度上清液，并加入弗氏完全佐劑，制成0.2 mg/mL終濃度的乳化抗原液[4]。

1.2.3 造模方法 除正常組外，在每組小鼠兩側(cè)腹股溝及兩后腳掌皮下多點(diǎn)注射乳化抗原液，每只注射總量為1mL，首次免疫后第21，35 d，再次使用乳化抗原液加強(qiáng)免疫，方法同首次免疫；在首次免疫當(dāng)天，及首次免疫后第7，21，35 d，每組小鼠腹腔注射百白破疫苗0.1 mL以加強(qiáng)免疫[5]。

1.2.4 給藥方法 增液湯低、中、高劑量組分別于首次免疫后，根據(jù)人與小鼠體表面積換算等效劑量的1倍、2倍、4倍劑量為低、中、高劑量，即以增液湯(8.75 g/kg/d、17.5 g/kg/d、35 g/kg/d)劑量灌胃。正常組及模型組給予等量生理鹽水灌胃，共給藥6周。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 血流變 實(shí)驗(yàn)?zāi)﹦?dòng)物禁食12 h，麻醉后眼眶取血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝，取0.8 mL全血，采用LBY-N6B型血液黏度儀測(cè)定低切變率下全血粘度(ηL)、高切變率下全血粘度(ηH)及全血還原粘度(RV) 。

1.3.2 脾臟指數(shù) 動(dòng)物禁食后稱(chēng)取體重，取脾臟后稱(chēng)量脾臟重量。

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(g)/小鼠體重(g)×10。

1.3.3 血清TNF-α、INF-γ 眼眶取血后，將血以3000 r/min離心10分鐘后取血清，使用酶聯(lián)免疫法(ELISA)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清TNF-α、INF-γ含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠脾臟重量及脾臟指數(shù)的比較

表1 各組小鼠脾臟重量及脾臟指數(shù)

注: A：P<0.01 vs Normal Group；b：P<0.05 vs Model Group；B：P<0.01 vs Model Group，下同。

Note：A means significant difference at levels of 0.01 compared with Nor

由表1可知，與正常組比較，模型組小鼠脾臟重量及脾臟指數(shù)均升高(P<0.01);與模型組比較，增液湯低、中、高劑量組小鼠脾臟重量及脾臟指數(shù)均降低，其中，增液湯中、高劑量組脾臟重量及脾臟指數(shù)降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，尤以高劑量組更為顯著(P<0.01)。說(shuō)明增液湯可能對(duì)SS小鼠的免疫器官有調(diào)節(jié)作用。

2.2 各組小鼠血清TNFα、INFγ的比較

由表2可知，與正常組比較，模型組小鼠TNF-α、INF-γ均升高(P<0.05,P<0.01);與模型組比較，增液湯低、中、高劑量組小鼠血清TNF-α、INF-γ均降低，其中，增液湯中、高劑量組血清TNF-α、INF-γ降低具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，尤以高劑量組更為顯著(P<0.01)，說(shuō)明增液湯對(duì)SS小鼠的血液免疫因子有調(diào)節(jié)作用。

表2 各組小鼠血清TNFα、INFγ水平

2.3 各組小鼠血流變(ηL、ηH、RV)的比較

與正常組比較，模型組小鼠ηL、ηH、RV均升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，增液湯低、中、高劑量組ηL降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，尤以高劑量組更為顯著(P<0.01)；與模型組比較，增液湯中、高劑量組ηH均顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，增液湯中、高劑量組RV均不同程度降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；其中，增液湯高劑量組RV降低尤為顯著(P<0.01)。說(shuō)明增液湯可調(diào)節(jié)SS小鼠的血流變，增液湯對(duì)原發(fā)性干燥綜合征小鼠的干預(yù)作用實(shí)驗(yàn)研究。

表3 各組小鼠血清ηL、ηH、RV水平

3 結(jié)論與討論

增液湯是《溫病條辨》中用于増液潤(rùn)燥的經(jīng)典方劑，由玄參、生地、麥冬三種中藥組成。既往研究證實(shí)，增液湯可改善干燥綜合征患者眼干、口干的癥狀[6]，以及改變高熱動(dòng)物的血流變的研究[7]。SS是慢性炎癥性自身免疫病，其發(fā)病與T細(xì)胞過(guò)度活化引起的免疫失衡及免疫器官損害及炎癥有關(guān)[8-9]。増液湯中三味單味中藥的藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)：麥冬中多糖能顯著抗缺氧、增加小鼠的脾臟重量，調(diào)節(jié)小鼠免疫機(jī)能[10]。玄參主要含有的環(huán)烯醚萜、苯丙素苷、三萜皂苷和有機(jī)芳酸，具有抗炎作用[11]；生地黃可調(diào)節(jié)大鼠的全血高切粘度、全血低切粘度、血漿粘度[12]。鑒于增液湯三個(gè)單味藥對(duì)免疫、炎癥、血流變的作用，本研究檢測(cè)了增液湯復(fù)方對(duì)SS小鼠脾臟指數(shù)、TNF-α、INF-γ及血流變的影響。

Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生TNF-α，Th2細(xì)胞主要產(chǎn)生INF-γ。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。在許多病理狀態(tài)下TNF-α產(chǎn)生增多，包括風(fēng)濕免疫類(lèi)疾病。INF-γ只由活化T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)產(chǎn)生，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等特性。研究顯示，TNF-α、INF-γ在SS發(fā)病中起重要作用，T細(xì)胞亞群的比值及數(shù)量異常造成的TNF-α、INF-γ分泌異常及免疫功能異常時(shí)SS的重要病理機(jī)制[13-14]。本研究結(jié)果證實(shí)，增液湯對(duì)TNF-α、INF-γ 的下調(diào)作用可能是其治療SS的另一可能機(jī)制，另外，增液湯對(duì)SS小鼠脾臟質(zhì)量及脾臟指數(shù)的調(diào)節(jié)作用也佐證了這一點(diǎn)。增液湯對(duì)干燥綜合征小鼠血流變也有改善作用，推測(cè)這是其治療干燥綜合征癥狀的機(jī)制之一。

綜上，增液湯可干預(yù)其炎癥因子及免疫失衡狀態(tài)，改善SS小鼠的血流變，這可能是增液湯治療SS的重要機(jī)制之一。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)．干燥綜合征診斷及治療指南[J]．中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2010，14(11)：766-768．

[2]金光明, 靳二輝, 李升和,等. 中草藥免疫促進(jìn)劑對(duì)AA仔雞法氏囊和脾臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J]. 安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào), 2016, 30(3)：1-4.

[3]周金星，靳二輝，李升和，等．自擬中藥免疫促進(jìn)劑對(duì)SD大鼠白細(xì)胞及血清生化指標(biāo)的影響[J]．安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，30(1)：1-6．

[4]田孟江，涂志華，胡瑞，等．養(yǎng)肺滋陰湯對(duì)干燥綜合征小鼠模型干預(yù)作用[J]．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016(1)：63-68．

[5]張前德，魏睦新，林青．丹芪顆粒干預(yù)干燥綜合征模型大鼠頜下腺水通道蛋白-5的表達(dá)研究[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(15)：105-109．

[6]申康．六味地黃湯合增液湯治療原發(fā)性干燥綜合征30例[J]．山東中醫(yī)雜志，2002，21(8)：467-469．

[7]卞慧敏，翟玉祥，楊進(jìn)，等．增液湯對(duì)營(yíng)熱陰傷證動(dòng)物模型的作用[J]．中藥藥理與臨床，2001，17(6)：8-10．

[8]金桂蘭，孫麗霞，汪悅．增液布津湯對(duì)干燥綜合征小鼠細(xì)胞因子IFN-γ,IL-6,IL-1的影響[J]．新中醫(yī)，2011(3)：125-127．

[9]王君，仝小林，李純，等．增液湯抑制幼鼠胸腺細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制探討[J]．中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003，23(1)：35-39．

[10]余伯陽(yáng)，殷霞，張春紅，等．麥冬多糖的免疫活性研究[J]．中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991(5)：286-288．

[11]李醫(yī)明，蔣山好，朱大元．玄參屬植物化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J]．中草藥，1999，30(4)：307-310．

[12]趙潤(rùn)生，張一昕，苗冬雪，等．生地黃對(duì)血瘀模型大鼠血液流變性的影響[J]．中藥藥理與臨床，2006，22(3)：123-123．

[13]金桂蘭，周玲玲，汪悅，等．增液布津湯對(duì)干燥綜合征小鼠T細(xì)胞亞群的影響[J]．南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27(5)：455-458．

[14]何慧珍，金桂蘭，孫麗霞，等．增液布津湯對(duì)干燥綜合征模型鼠治療作用的研究[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(16)：208-212．

(責(zé)任編輯： 馬世堂)

Study of the Intervention of Zengye Soup on Sjogren's Syndrome Mice

GUO Xiao-hong

(Rheumatism Immunity Branch, Tai′an Traditional Chinese Medicine Hospital, Tai′an 271000, China)

Objective: To observe the intervention of Zengye Soup on spleen index, serum TNF-alpha, serum INF - gamma, hemorrheology of Sjogren′s syndrome (SS) modal mice.Methods: 50 mice were divided into normal group, model group, low dose Zengye soup group, medium dose Zengye soup group and high dose Zengye soup group randomly, SS model mice were made by injecting the same rat submandibular immune antigen and the DPT vaccine. Zengye soup was performed for 6 weeks. At the end of the experiment, the spleen weight and index, hemorrheology, serum TNF-alpha and INF-gamma indicator of mice were tested. Results: Compared with normal group mice, model group mice spleen weight and index, TNF-alpha, INF-gamma, ηL、ηH、RV increased; Compared with model group, spleen weight, index, TNF-alpha, INF-gamma, ηL、ηH、RV of the mice of medium dose and high dose group decreased.Conclusion: Zengye soup can adjust spleen index, serum TNF-alpha, INF-gamma and hemorrheology of the SS mice, the mechanism that Zengye soup treat for SS may be related to the intervention on the immune balance.

Zengye soup; Sjogren's syndrome; Spleen index; TNF-alpha; INF-gamma; Hemorrheology

2016-07-01

河北省中醫(yī)藥管理局科技項(xiàng)目(2014082)。

國(guó)小紅(1980-)，女，山東省梁山縣人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事風(fēng)濕免疫疾病研究。

R285.5

A

1673-8772(2016)05-0041-04